Optimalisatie van de Cuff Techniek voor Murine Heart Transplantation

Samenvatting

We introduceren een binnenband benadering van de manchettechniek voor muis cervicale heterotopische harttransplantatie om evert het vat over de manchet te helpen. We ontdekten dat de samenwerking tussen twee ervaren chirurgen de operatietijd aanzienlijk verkort.

Samenvatting

Murine harttransplantatie is uitgevoerd voor meer dan 40 jaar. Met de vooruitgang in de microchirurgie, zijn bepaalde nieuwe technieken gebruikt om chirurgische efficiëntie te verbeteren. In ons lab hebben we de manchettechniek geoptimaliseerd met twee grote stappen. Eerst gebruikten we de binnenbandtechniek om een tijdelijke binnenband in de externe halsader en halsslagaderbloedvat te plaatsen om de edlijsie van het vat over de manchet te vergemakkelijken. Ten tweede hebben we volledige heterotopische harttransplantatie uitgevoerd door de samenwerking van twee ervaren chirurgen. Deze wijzigingen hebben de bedrijfstijd effectief teruggebracht tot 25 minuten, met een slagingspercentage van 95%. In dit rapport beschrijven we deze procedures in detail en geven we een aanvullende video. Wij zijn van mening dat dit verslag over de verbeterde manchettechniek praktische richtlijnen zal bieden voor murine heterotopische harttransplantatie en het nut van dit muismodel voor fundamenteel onderzoek zal verbeteren.

Inleiding

De oprichting van muis heterotopische harttransplantatie door end-to-end anastomose in de buik in 1973 was een belangrijke mijlpaal in de fundamentele transplantatie immunologie onderzoek¹. Dit model bood een belangrijk en geldig hulpmiddel voor het analyseren van de mechanismen van ischemie reperfusieletsel², immunologische afstoting en tolerantie^3,4. Echter, de complexe en tijdrovende aard van de operatie, alsmede het potentieel voor infecties kan resulteren in ernstige perioperatieve buikverklevingen en ontstekingsreacties, wat resulteert in een lage efficiëntie voor heterotopische harttransplantatie model.

De cervicale heterotopische harttransplantatie techniek werd voor het eerst beschreven door Chen in 1991⁵. In dit model wordt de externe halsader van de ontvanger anastomosed aan de longslagader van de graft en de halsslagader is anastomosed aan de stijgende aorta. De belangrijkste voordelen van deze methode zijn het gemak van monitoring en het verminderen van trauma aan de ontvanger. In hetzelfde jaar beschreef Matsuura een verbeterde techniek, waarbij het einde van de externe halsader en halsslagader over een Teflon manchet werden gefixeerd en met een omtrekvormige zijdeligbondtuur⁶werden bevestigd. Sommige onderzoekers bevestigden ook de manchet aan de juiste longslagader in het donorhart alvorens de manchet in de externe halsader van de ontvanger⁷te plaatsen. Tot nu toe is de manchettechniek op grote schaal toegepast in verschillende vasculaire pedicletransplantatiemodellen, waaronder die voor long^8,lever⁹en nier^{10-transplantatie.}

Tot op heden zijn er verschillende problemen in verband met de manchettechniek. Bijvoorbeeld, de halsslagader is moeilijk te evert over de manchet als gevolg van de extra elasticiteit, wat resulteert in het weefsel naar achteren draaien. Daarom kan extra praktijk en een microchirurgische dilatator nodig zijn om deze stap te voltooien. Bovendien kan de voorbereiding van het cervicale vat tot 25 minuten duren.

Om deze problemen op te lossen, introduceren we de binnenbandtechniek, die is gebaseerd op de manchettechniek en omvat het bevestigen van de manchet op de externe halsader en halsslagader met behulp van een binnenband om te helpen bij de edsie van de vaatwand. Bovendien, met eenvoudige training, de ontvanger voorbereiding wordt teruggebracht tot 15,5 minuten. Deze techniek vermindert de complexiteit van de operatie en vereist geen extra oefening of het gebruik van een vasculaire dilatator. Het kan worden toegepast in alle transplantatie immuunonderzoek, vooral voor het verifiëren van derden immuuntolerantie waarbij de ontvanger ontvangt twee cardiale allografts, een in de buik en de andere in de nek¹¹. We raden ook samenwerking aan tussen twee ervaren chirurgen om dit model vast te stellen, waarbij een chirurg het ontvangende dier voorbereidt en het andere het donorhart oogst en implanteert. Een dergelijke samenwerking kan de bewerkingstijd verkorten tot 25 minuten. Met behulp van deze geoptimaliseerde procedure hebben we syngene, allogene¹²,^13,,14,15,^16,17,18,19en xenogeneic muisharttransplantatiemodellen²⁰vastgesteld .^,

De reden voor de ontwikkeling van de binnenbandtechniek was om de verrichtingstijd voor de totstandbrenging van een model van de muisharttransplantatie met een hoog slagingspercentage te verminderen. Optimalisatie van het cervicale harttransplantatiemodel vergemakkelijkt de verwerving van hoge slagingspercentages in een korte periode van operatietijd in vergelijking met de traditionele hechtings- en manchettechniek²¹. Verder kan het samenwerkingsmodel de warme ischemische tijd van het donorhart verder verkorten in vergelijking met operaties die met één operator worden uitgevoerd.

Protocol

Dieren (BALB/c, C57BL/6, man, 8-12 weken) zijn ondergebracht in een specifieke ziekteverwekkervrije faciliteit in het Xiamen University Laboratory Animal Center. C57BL/6 wordt gebruikt als ontvanger en BALB/c wordt gebruikt als donor. Alle procedures worden uitgevoerd volgens de richtlijnen van het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

OPMERKING: Voor de bewerking is een reeks microchirurgische instrumenten nodig, waaronder een microschaar, micro straight tang,Table and Materialsmicrogebogen Figure 1tangen en micronaaldhouders. Er is één paar bulldogklemmen voor eenmalig gebruik nodig(figuur 1F). Twee manchetten voor de externe halsader en halsslagader worden bereid door het snijden van de aangepaste polyamide buizen met een no. 10 scalpel onder een microscoop. De diameter van de ader en de slagader manchet is respectievelijk 0,9 mm en 0,55 mm. Bovendien is de diameter van de binnenband voor de overeenkomstige ader manchet 0,6 mm, en deze van de binnenband voor de overeenkomstige slagader manchet is 0,28 mm (Figuur 1G).

1. Voorbereiding van de ontvanger

1. Verdoes de ontvangermuis met pentobarbital (60 mg/kg, i.p). Gebruik atraumatische mechanische tondeuses om het haar te verwijderen in het rechter zijwaartse cervicale gebied.
2. Gebruik een steriele katoenen tip applicator om het chirurgische gebied af te vegen met jodium antiseptisch gevolgd door 70% ethanol.
3. Plaats de muis in de supinepositie op het bedieningsplatform. Bedek de muis met steriel gaas.
4. Gebruik een oogheelkundige schaar om een dwarse incisie te maken van de onderste een derde nek middellijn naar het rechter schouder-sleutelbeen gewricht.
5. Isoleer de juiste externe halsader met micro gebogen tangen om voldoende lengte bloot te leggen, de takken af te snijden via elektrocoagulatie en het vat aan het distale uiteinde te kruisen met behulp van een 6-0 zijden hechting.
6. Klem de externe halsader proximally met behulp van een bulldog klem en vervolgens transect de ader proximally aan de ligatuur met behulp van een micro schaar.
7. Was het vat lumen met 100 U/mL 0-4 °C gehepariniseerde zoutoplossing om eventueel restbloed te verwijderen.
8. Trek de externe halsader door de ader manchet met behulp van micro rechte tangen; steek de ader binnenband in het lumen als een stent, en evert het vat muur over de manchet met micro rechte tangen (Figuur 2A).
9. Bevestig het everted schip endotheel aan het proximale uiteinde van de manchet met behulp van een omtrek 8-0 zijden hechting (figuur 2B).
10. Gebruik micro rechte tangen om de binnenband van de ader uit het adervat te halen.
11. Voer stompe dissectie uit met microgebogen tangen om de rechter halsslagader naast de binnenrand van de sternocleidomastoïde te isoleren.
12. Klem de rechter halsslagader proximally met behulp van een bulldog klem, ligate de halsslagader distaal met behulp van een 6-0 zijden hechting, en gebruik een micro schaar om de halsslagader proximaal transect aan de ligatuur.
13. Was de halsslagader met 100 U/mL 0-4 °C gehepariniseerde zoutoplossing om eventueel restbloed te verwijderen.
14. Geef de halsslagader door de slagader manchet en steek de binnenband van de slagader in het slagadervat met behulp van micro rechte tangen(figuur 2C).
15. Evert het vat over de manchet met behulp van micro rechte tangen; vast te stellen het everted schip endotheel met behulp van een omtrek 8-0 zijden hechting (Figuur 2D).
16. Haal de binnenband van de slagader met micro rechte tangen uit het slagadervat.
    OPMERKING: Bewaar de submandibulaire klier van de ontvanger.

2. Voorbereiding van de donor

1. Verdoven de donormuis met pentobarbital (60 mg/kg, i.p). Gebruik atraumatische mechanische tondeuses om het haar in de buikstreek te verwijderen.
2. Plaats de muis in de supinepositie op het bedieningsplatform. Bedek de muis met steriel gaas.
3. Gebruik een steriele katoenen tip applicator om het chirurgische gebied af te vegen met jodium antiseptisch gevolgd door 70% ethanol.
4. Maak een abdominale middellijn incisie met een oogheelkundige schaar en bloot de buikholte.
5. Gebruik micro gebogen tangen om de inferieure vena cava bloot te stellen, en vervolgens intraveneus injecteren 200 μL van 100 U / mL 0-4 ° C heparinized zout lijn per 20 g lichaamsgewicht door de inferieure vena cava.
6. Voer thoracotomie uit met oogheelkundige schaar, snijd de ribben door de bilaterale midaxillaire lijn insnijdingen, draai de voorste borstwand naar buiten om de borstholte bloot te leggen.
7. Accijns de thymus met micro gebogen tangen.
8. Stel de aorta bloot en doorsneed vervolgens 200 μL van 100 U/mL 0-4 °C en vervolgens zout aan de kransslagader door de aortaboog.
   OPMERKING: Voorkom dat er gasbellen in het donorhart worden doorzeefd.
9. Gebruik een microschaar om de opgaande aorta aan het begin van de aortaboog te transecteren.
10. Transect de longslagader aan het begin van de twee belangrijkste takken met een micro schaar.
11. Ligate de superieure vena cava en inferieure vena cava proximally met behulp van een 6-0 zijden hechting en gebruik een micro schaar om ader distally transect aan de ligatuur.
12. Ligate de longaders aan elkaar, omtrek, met behulp van een enkele 6-0 zijden hechting, en afgesneden van de ader takken distally aan de ligatuur met behulp van een micro schaar.
13. Verwijder het harttransplantatie uit de omliggende zachte weefsels; bewaren in 0-4 °C heparinized zoutoplossing.

3. Hartimplantatie

1. Plaats het donorhart ondersteboven in het rechter nekgebied van de ontvanger.
2. Voer de longslagader van het donorhart in tot een 6-0 zijden lus met micro rechte tangen.
3. Wikkel het vat lumen rond de ader manchet, en draai vervolgens de 6-0 zijden hechting lussen rond de manchet om het vat gezamenlijke band.
4. Voer anastomose uit van de aorta van het transplantaat en de slagaderboechet door de in stap 3.2 beschreven stappen te volgen.
5. Laat de geklemde halsader los, gevolgd door de geklemde halsslagader. Houd het vat gewricht ontmoedigd en zorg ervoor dat de bloedstroom vrij is.
   LET OP: Het sinusritme dat binnen 1 min terugkeert naar meer dan 200 keer, wordt als normaal beschouwd.
6. Bevochtig het donorhart met warme (37 °C) zoutoplossing en controleer of het transplantaat bloedt. Stel het pulserende hart graft in de onderhuidse ruimte, en dan hecht de incisie.

4. Postoperatieve zorg- en graftbeoordeling

1. Noteer de tijd tot normaal sinusritme en het behoud van het normale sinusritme gedurende ten minste 5 minuten na het loslaten van de klem om de postoperatieve graftfunctie te controleren.
2. Plaats de ontvanger alleen op een warme deken totdat de ontvanger wakker wordt van anesthesie. Toleer buprenorfine analgesie, 0,05 mg/kg, s.c, aan het einde van de operatie en elke 12 uur gedurende 72 uur na de operatie.
3. Nota dagelijks het gewicht en de postoperatieve herstelstatus van de ontvanger. In het geval van >15% gewichtsverlies ten opzichte van die op de operatiedatum, hemiplegische verlamming, of infectie, euthanaseren de ontvanger via terminale isoflurane inhalatie²¹.
4. Monitor graft overleving door palpatie dagelijks. De operatie wordt beschouwd als succesvol als de murine allograft overleeft voor >72 uur. Rangschik de graftfunctie, zoals eerder gemeld²²: Schaal 3 - krachtig pulseren en frequentie; Schaal 2 - minder pulseren; Schaal 1- fibrillatie en dreigende afwijzing; of Schaal - 0, verlies van hartslag en volledige afwijzing.

Resultaten

Chirurgische operatietijd

Na de training kan een ervaren chirurg de operatie met succes binnen 35 minuten uitvoeren met behulp van de binnenbandtechniek, waarbij ongeveer 15,5 minuten nodig zijn voor de voorbereiding van de ontvanger, 10,9 minuten nodig zijn voor de voorbereiding van de donor en 4,4 minuten nodig zijn voor donorhartanastos. De koude en warme ischemietijd (van donorpreparaat tot hartimplantatie) wordt teruggebracht tot 15,3 minuten in vergelijking met de operat...

Discussie

Muisharttransplantaties modellen zijn belangrijke instrumenten voor transplantatie immunologie onderzoek, als instrumenten en materialen voor de evaluatie van de immuunmechanismen van dit model en een groot aantal gen-gemodificeerde muizen beschikbaar zijn. Microchirurgische technische uitdagingen, zoals de hechting en de edsie van schepen, hebben echter het wijdverbreide gebruik ervan beperkt. In deze studie hebben we bepaalde technische belangrijkste uitdagingen van murineharttransplantatie onderzocht en goede resultat...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Slagader manchet	Zelfgemaakt		Polyamide buis. diameter: 0,55 mm,lengte: 1,0 mm
Slagader binnenbuis	Zelfgemaakt		Polyamide buis. Diameter: 0,28 mm
Micro gebogen pincetten	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Chirurgische instrumentenfabriek	WA3050	1/8 boog, 0,3-mm punt zonder haak
Micro naaldhouders	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Chirurgische instrumentenfabriek	WA2050	0,2-mm punt
Micro schaar	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Chirurgische instrumentenfabriek	WA1050	Recht, bladlengte: 10 mm
Micro rechte pincetten	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Chirurgische instrumentenfabriek	WA3060	0,15-mm punt zonder haak
Scanlan Vascu-Statt Bulldogklemmen	Scanlan International Inc	1001-531	Klemdruk 20–25 gram
Venen manchet	Zelfgemaakt		Polyamide buis. diameter: 0,9 mm,lengte: 1,2 mm
Venen binnenbuis	Zelfgemaakt		Polyamide buis. Diameter: 0,6 mm