Dit protocol beschrijft hoe u een nauwkeurige laminectomie voor inductie van stabiele transsectie-type dwarslaesie in het muismodel, met minimale bijkomende schade voor het onderzoek van de dwarslaesie te creëren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Inductie van volledige transsectie-type ruggenmergletsel bij muizen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Dwarslaesie (SCI) leidt grotendeels tot onomkeerbaar en permanent functieverlies, meestal als gevolg van trauma. Verschillende behandelingsopties, zoals celtransplantatiemethoden, worden onderzocht om de slopende handicaps die voortvloeien uit SCI te overwinnen. De meeste preklinische dierproeven worden uitgevoerd in knaagdiermodellen van SCI. Hoewel ratmodellen van SCI op grote schaal zijn gebruikt, hebben muismodellen minder aandacht gekregen, hoewel muismodellen aanzienlijke voordelen kunnen hebben ten opzichte van rattenmodellen. De kleine omvang van muizen komt neer op lagere onderhoudskosten voor dieren dan voor ratten, en de beschikbaarheid van tal van transgene muismodellen is voordelig voor vele soorten studies. Het induceren van herhaalbaar en nauwkeurig letsel bij de dieren is de belangrijkste uitdaging voor SCI-onderzoek, dat bij kleine knaagdieren een hoge precisieoperatie vereist. Het transsectie-type letsel model is een veelgebruikte schade model in de afgelopen tien jaar voor transplantatie-gebaseerde therapeutisch onderzoek, maar een gestandaardiseerde methode voor het induceren van een volledige transsectie-type letsel bij muizen bestaat niet. We hebben een chirurgisch protocol ontwikkeld voor het induceren van een volledig transsectietypeletsel bij C57BL/6 muizen op thoracale wervelniveau 10 (T10). De procedure maakt gebruik van een kleine tipboor in plaats van rongeurs om de lamina nauwkeurig te verwijderen, waarna een dun mes met afgeronde snijkant wordt gebruikt om de dwarslaesie van het ruggenmerg te induceren. Deze methode leidt tot reproduceerbare transsectie-type letsel bij kleine knaagdieren met minimale collateral spier-en botschade en minimaliseert daarom verstorende factoren, met name waar gedrags-functionele resultaten worden geanalyseerd.
Inleiding
Dwarslaesie (SCI) is een complex medisch probleem dat resulteert in drastische veranderingen in gezondheid en levensstijl. Er is geen remedie voor SCI, en de pathofysiologie van SCI is niet grondig begrepen. Animal SCI-modellen, met name knaagdiermodellen, bieden een waardevol hulpmiddel voor het testen van nieuwe behandelingen en worden al tientallen jaren gebruikt om SCI te verkennen. Tot op heden heeft meer dan 72% van de preklinische SCI-studies rattenmodellen gebruikt, in vergelijking met slechts 16% die muizen hebben gebruikt1. Hoewel ratten, vanwege hun grotere omvang en de neiging om holtes te vormen die verwant zijn aan menselijke SCIs, van oudsher het voorkeursmodel waren voor het bestuderen van nieuwe therapeutische benaderingen, worden muizen (waaronder veel transgene muismodellen) nu vaker gebruikt om cellulaire en moleculaire mechanismen van de SCI2te bestuderen. Het muismodel biedt extra voordelen in termen van gemakkelijkere hantering, snellere voortplantingspercentages en lagere kosten dan ratten; muizen vertonen ook een hoge mate van genomische gelijkenis met mensen1,2,3. Het grote nadeel van het muismodel is geïdentificeerd als de aanzienlijk kleinere omvang die uitdagingen creëert voor chirurgische ingrepen voor het maken en behandelen van ruggenmergletsels4,5.
Er is een gat in de bestaande literatuur die de noodzaak benadrukt van een robuust en reproduceerbaar chirurgisch protocol om stabiele SCI in het muismodel te induceren. Daarom bieden we een nieuwe en nauwkeurige chirurgische aanpak in dit protocol om deze beperkingen te overwinnen. Dit protocol biedt diepgaande richtlijnen om een transsectie-type letsel bij muizen te veroorzaken, omdat dit letseltype is erkend als de meest geschikte om regeneratieve en degeneratieve veranderingen te bestuderen na een blessure6, evenalsneuroplasticiteit, neurale circuits en weefselengineering benaderingen7. We hebben ervoor gekozen om de schade in de lagere thoracale regio te induceren, omdat thoracale niveau SCI wordt het meest gebruikt in de literatuur1.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures werden uitgevoerd met de goedkeuring van de Griffith University Animal Ethics Committee (ESK/04/16 AEC en MSC/04/18 AEC) onder de richtlijnen van de National Health and Medical Research Council van Australië.
1.
- Verdoven en stabiliseren van het dier.
- Gebruik 8-10 weken oude vrouwelijke C57BL/6 muizen. Gebruik 5% isofluraan in 1 L/min zuurstof voor inductie van anesthesie. Voor het onderhoud van anesthesie, gebruik 1,5-2% isoflurane in 1 L/min zuurstof. Bevestig de juiste verdoving door het vaststellen van een gebrek aan pijnreflex in staart- en achterpoten.
- Toleer buprenorfine (0,03 mg/kg lichaamsgewicht) voor analgesie en enrofloxatine (10 mg/kg lichaamsgewicht) voor antibioticabedekking, onderhuids afhankelijk van het lichaamsgewicht. Meloxicam (2 mg/kg lichaamsgewicht) kan worden gegeven voor langdurige analgesie indien nodig.
- Houd de lichaamstemperatuur van het dier stabiel op 37 °C met een verwarmingskussen
- Scheer de rugbont om het chirurgische gebied over de rugwervel te blootstellen. Verwijder de geschoren vacht uit chirurgisch gebied voordat u de incisieplaats steriliseert. Steriliseren het geschoren gebied met steriele wattenstaafjes gedrenkt in povidone jodium antiseptische vloeistof en chirurgische geest.
- Tape de poten van de muis aan de chirurgische gebied om het dier te stabiliseren (Figuur 1A). Plaats een ovaal venster gordijn over de muis (Figuur 1B).
2. Laminectomie
- Maak een verticale middellijn incisie op het T10-wervelniveau met behulp van een chirurgische scalpel.
- Zoek het spinachtige proces van T10 wervel om de plaats van laminectomie te bepalen. Het lichaam van de wervel ligt licht craniaal aan het uiteinde van het spinachtige proces8 (zie figuur 2). De punt rust ongeveer in het midden van de T11 wervel8.
- Maak de incisie ~ 2,5 cm lang, zodat de wervelkolom van de T10-wervel ongeveer in het midden van de lengte van de incisie ligt.
- Reflecteer de huid en trek de huid in met oprolmechanismen.
- Gebruik de rechte tangen om de huid te tillen van de onderliggende fascia. Dit zal ruimte creëren voor de oprolmechanismen te plaatsen; deze houden het chirurgische veld open.
- Voer stompe dissectie van onderhuids weefsel en fascia uit om de spinous processen bloot te stellen.
- Gebruik de stompe rand van de scalpel om een kleine middellijn incisie in het onderhuidse weefsel en de onderliggende fascia te maken om de stekels van T9-T11 wervels bloot te leggen. Gebruik de fijne tip tang (niet-scherp) om stompe dissectie uit te voeren en weerspiegelen de fascia.
- Splits en scheid de para-spineuze spieren om de laminae bloot te leggen.
- Gebruik de stompe punt van de scalpel om de rugstamspieren en para-spineuze spieren langs de stekels van de T9-T11 wervels te splitsen. Gebruik de stompe fijne punt tangen om botte dissectie van de spieren uit te voeren in lagen en bloot de laminae van de wervels. Dit moet het bloeden minimaliseren.
OPMERKING: Als er bloedingen zijn, gebruik dan verwarmde zoutoplossing (37 °C) irrigatie en wattenstaafjes om het te controleren en bloed uit het chirurgische veld te wissen. - Gebruik dezelfde tangen om kleine zakken rond de dwarse processen van T10 wervel te maken. Gebruik de gebogen tangen om het T10-wervellichaam te stabiliseren door de tanden onder de dwarse processen vast te haken, in de gecreëerde zakken(figuur 1C).
- Spoel de T10 laminae grondig af met warme zoutoplossing en veeg voorzichtig schoon met wattenstaafjes om het benige oppervlak duidelijk te visualiseren. Zorg ervoor dat er geen spier /ligament bijlagen blijven langs het oppervlak bilateraal.
- Gebruik de stompe punt van de scalpel om de rugstamspieren en para-spineuze spieren langs de stekels van de T9-T11 wervels te splitsen. Gebruik de stompe fijne punt tangen om botte dissectie van de spieren uit te voeren in lagen en bloot de laminae van de wervels. Dit moet het bloeden minimaliseren.
- Gebruik een boor met een fijne punt (0,55 mm diameter, 7 mm lengte) om de laminae bilateraal te breken.
- Gebruik de punt van de boor om een verticaal pad te traceren van T9-T10 tussenruimte naar T10-T11 tussenwervelruimte langs zowel de T10 laminae, zonder de boor aan te zetten. Dit is om ervoor te zorgen dat de boor bit niet vangt geen weefsel (Figuur 1D).
- Nu draaien de boor op, langzaam en zorgvuldig graven een verticale sleuf op de juiste lamina van de T10 wervel. Dit deel van de laminectomie moet leiden tot een nauwkeurig chirurgisch defect in de dikte van het bot in een rechte verticale lijn. Houd de grip met de gebogen tangen om de wervel stabiel te houden.
- Zorg ervoor dat de punt van de boor niet door het bot dringt en het ruggenmerg verwondt. Herhaal hetzelfde proces aan de linkerkant van de lamina, waardoor de wervel stabiel blijft met de gebogen tangen. Irrigeer met warme zoutoplossing om eventuele resterende botfragmenten weg te wassen.
- Til en verwijder het achterste deel van de neurale boog(figuur 1F).
- Gebruik de schuine fijne punt tangen om het spineuze proces grip en verwijder het hele dorsale segment van de laminae gescheiden door de bilaterale boren. Irrigeer en wattenstaafje opnieuw als er sprake is van bloeding, om het ruggenmerg dat onder het laminectomievenster wordt blootgesteld duidelijk te visualiseren(figuur 1E).
3. Transsectie
- Induceer de dwarslaesie door de transsectie van het blootgestelde koord met een enkel plakje van het blad.
- Gebruik het smalle, ronde snijblad om het snoer in het midden van het laminectomievenster te snijden. Zorg ervoor dat u de laterale uitsparingen van de wervelkolom veegt om een volledige transsectieletsel te veroorzaken(figuur 1G).
- Bevestig de volledigheid van de transsectieletsel met behulp van de stompe fijne punt tangen en verwijder de resterende verbindingen op de transsectie site.
- Controleer het bloeden indien aanwezig, voordat u de chirurgische lagen sluit.
- Gebruik de warme zoutoplossing te irrigeren en duidelijk alle bloeden die optreedt van de doorsneden koordstronken. Gebruik een wattenstaafje om zachte druk uit te oefenen om hemostase te bereiken indien nodig. Zorg ervoor dat u het ruggenmerg niet comprimeert.
4. Sluiting en onmiddellijke postoperatieve zorg
- Breng de spieren samen en hecht in laag.
- Zodra hemostase is bereikt op de transsectieplaats, laat u de gebogen tanggreep op de T10-wervels los. Breng de randen van ontleed spieren samen langs de middellijn om een goede apposition te bereiken.
- Hecht de spieren in een laag met behulp van 5-0 polyglactine 910 opneembare hechtingen. Zorg ervoor dat de natuurlijke kromming van de wervelkolom geen spanning veroorzaakt bij de hechtingslijn of open de hechtingen, waardoor de plaats van de laminectomie wordt blootgelegd.
- Sluit onderhuids weefsel en huid.
- Gebruik 5-0 niet-absorberende zijdehechtingen om de huidincisie te sluiten. Zorg ervoor dat er geen bloeden, stolsels of vuil achter blijven onder de huid voor sluiting. Een definitieve irrigatie met warme zoutoplossing kan nodig zijn bij deze stap.
- Stop de verdoving. Observeer het dier gedurende 10-30 minuten tot het herstel. Het dier moet gedurende deze duur op het verwarmingskussen blijven. Zorg voor watergel en gehydrateerd voedsel in de kooi.
- Voor postoperatieve zorg, omvatten buprenorfine (tweemaal daags), enrofloxacin (eenmaal daags) voor de eerste twee dagen profylactisch. Bovendien, handmatig leeg de blaas ten minste tweemaal per dag, zich te houden aan de richtlijnen van de dierethiek commissie.
OPMERKING: De dieren in dit experiment werden tweemaal daags beoordeeld op hun algemene gezondheid en welzijn, waaronder het controleren op aanhoudende pijn (om extra doses buprenorfine te geven) of infectie (extra enrofloxacin), hun voedings- en hydratatiestatus (geef injecteerbare vloeistoffen indien uitgedroogd) en eventuele tekenen van autotomie (geef wondverzorging bij kleine autotomie). Het wordt ten zeerste aanbevolen dat deze aspecten van postoperatieve zorg, met inbegrip van de euthanasiebesluiten, met de begeleiding van de instellingsdierethiekcommissie moeten worden vastgesteld.
5. Evaluatie van het schademodel
- Het vaststellen van het verlies van motorische functie.
- Beoordeel motorisch gedrag op de gewonde muizen 2, 7, 14, 21 en 28 dagen na de verwonding in een open veld met behulp van de Basso Mouse Scale (BMS) om het verlies van functie9 te bepalen (Figuur 3C-E).
- Histologische bevestiging van letsel
- Oogst de gewonde ruggenmergs met de wervelkolom kolommen na euthanasie (gedaan met kooldioxide in dit experiment, zoals goedgekeurd door de dier ethische commissie).
- Fix het weefsel door 's nachts onderdompeling in 4% paraformaldehyde en ontkalken de botten door behandeling met 20% ethyleen diamine tetraacetic zuur (EDTA) gedurende 3 weken, ter vervanging van verse EDTA om de 48 uur.
- Bereid de ontkalkte stekels voor op cryo-sectioning en snijd ze in 30 μm dikke secties.
- Monteer de secties op gelatine gecoate glazen platen voor immuno-kleuring met anti-GFAP antilichamen en Hoechst 33342.
- Beeld de dia's op een fluorescerende microscoop (Figuur 3A) en voer metingen uit van de letselgrootte met behulp van beeldanalysesoftware (bijvoorbeeld Nikon-analysesoftware - NIS Elements [Figuur 3B]).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De resulterende methode zoals afgebeeld in figuur 1, omvat een adequate stabilisatie van de muis(figuur 1A) en een goede visualisatie van de wervelkolom en het paraspineuze weefsel (figuur 1B). Spinous proces en laminae kan duidelijk worden gevisualiseerd met minimale spierdissectie en bloedverlies(Figuur 1C, gemarkeerde zone). De fijne tip boren wordt uitgevoerd zoals weergegeven in
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Deze methode veroorzaakt een volledige transsectie type letsel op het T10-wervelniveau bij muizen, wat resulteert in volledige dwarslaesie van het dier, onder het niveau van letsel. Over het geheel genomen resulteert deze methode in minimale bloedingen, verwaarloosbare bijkomende schade en een stabiele, reproduceerbare schade. In vergelijking met eerder gepubliceerde methoden van transsectie zonder laminectomie10,biedt deze methode de voordelen in termen van directe visualisatie zonder de kromming...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door een Griffith University International Student (PhD) stipendium aan RR, een Perry Cross Foundation Grant aan JE en JSJ, een Clem Jones Foundation Grant aan JSJ en JE, en een Motor Accident Insurance Commission van Queensland subsidie aan JSJ en JE.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Baytril injecteerbaar 50 mg/mL, 50 mL | Provet | BAYT I | Post-operatieve zorggeneesmiddel |
| Betadine 500 mL | Provet | BETA AS | Verbruiksartikel |
| Castroviejo naaldhouder, vergrendelbaar | ProSciTech | T149C | Herbruikbaar |
| Keramische zirkoniummes, rond met scherpe zijden, enkelzijdig, hoekig | ProSciTech | TXD101A-X | Herbruikbaar |
| Wattenstaafjes (5st) | Multigate | 21-893 | Verbruiksartikel |
| Dremel Micro | DREMEL | 8050-N/18 | Snoerloos rotatiegereedschap |
| Verbandtang fijn | Multigate | 06-306 | Voor eenmalig gebruik |
| Boorbits | Kemmer Präzision | SM 32 M 0550 070 | Herbruikbaar |
| Dumont #7b tang | Fine Science Tools | 11270-20 | Herbruikbaar |
| Dumont pincet, stijl 5 | ProSciTech | T05-822 | Herbruikbaar |
| Bonttrimmer | WAHL | WA9884-312 | Zero Overlap Hair Trimmer |
| Irisschaar, Ti, scherpe uiteinden, recht, 90mm | ProSciTech | TY-3032 | Herbruikbaar |
| Isofluraan isothesia NXT 250 | Provet | ISOF 00 HS | Anesthesiegemiddel |
| Colibri Retractor - 4cm | Fine Science Tools | 17000-04 | Herbruikbaar |
| Schelphandgreep | ProSciTech | T133 | Herbruikbaar |
| Signature latex chirurgische handschoenen maat 7.5 | Medline | MSG5475 | Verbruiksartikel |
| Natriumchloride 0,9% | STS | PHA19042005 | Verbruiksartikel |
| Steriele verbandset | Multigate | 08-709 | Voor eenmalig gebruik |
| Steriele vloeistofdicht scherm 60x60 cm | Multigate | 29-220 | Voor eenmalig gebruik |
| Chirurgisch spirit 100 mL | Provet | # SURG SP | Verbruiksartikel |
| Hechtmateriaal - ZILK BLK 45CM 5/0 FS-2 | Johnson & Johnson Medical | 682G | Zijdedraad |
| Hechtmateriaal - Vicryl 70CM 5-0 S/A FS-2 | Johnson & Johnson Medical | VCP421H | Vicrylnaald |
| Temgesic 0,3 mg in 1 mL, x 5 ampullen (klasse S8-geneesmiddel) | Provet | TEMG I | Post-operatieve zorggeneesmiddel |
Referenties
- Sharif-Alhoseini, M., et al. Animal models of spinal cord injury: a systematic review. Spinal Cord. 55 (8), 714-721 (2017).
- Lee, D. H., Lee, J. K. Animal models of axon regeneration after spinal cord injury. Neuroscience Bulletin. 29 (4), 436-444 (2013).
- Sharif-Alhoseini, M., Rahimi-Movaghar, V. Topics in Paraplegia. Dionyssiotis, Y. , IntechOpen. (2014).
- Talac, R., et al. Animal models of spinal cord injury for evaluation of tissue engineering treatment strategies. Biomaterials. 25 (9), 1505-1510 (2004).
- Nakae, A., et al. The animal model of spinal cord injury as an experimental pain model. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 939023(2011).
- Kwon, B., Oxland, T., Tetzlaff, W. Animal models used in spinal cord regeneration research. Spine. 27, 1504-1510 (2002).
- Kundi, S., Bicknell, R., Ahmed, Z. Spinal cord injury: current mammalian models. American Journal of Neuroscience. (4), 1-12 (2013).
- Harrison, M., et al. Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse. Neuroimage. 68, 22-29 (2013).
- Basso, D. M., et al. Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. Journal of Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
- Seitz, A., Aglow, E., Heber-Katz, E. Recovery from spinal cord injury: a new transection model in the C57Bl/6 mouse. Journal of Neuroscience Research. 67 (3), 337-345 (2002).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
