Worm-align en Worm_CP, Twee Open-Source Pipelines voor straightening en kwantificering van fluorescentie beeldgegevens verkregen van Caenorhabditis elegans

Samenvatting

Worm-align/Worm_CP is een eenvoudige FIJI / CellProfiler workflow die kan worden gebruikt om recht te maken en uit te lijnen Caenorhabditis elegans monsters en om hele worm beeld-gebaseerde tests te scoren zonder de noodzaak van voorafgaande training stappen. We hebben Worm-align/Worm_CP toegepast op de kwantificering van warmte-shock geïnduceerde expressie bij levende dieren of lipide druppels in vaste monsters.

Samenvatting

Een probleem vaak ondervonden bij het verwerven van beeldgegevens van vaste of verdoofde C. elegans is dat wormen kruisen en clusteren met hun buren. Dit probleem wordt verergerd door de toenemende dichtheid van wormen en creëert uitdagingen voor beeldvorming en kwantificering. We ontwikkelden een fiji-gebaseerde workflow, Worm-align, die kan worden gebruikt om single- of multi-channel montages van door de gebruiker geselecteerde, rechtgetrokken en uitgelijnde wormen te genereren uit ruwe beeldgegevens van C. elegans. Worm-align is een eenvoudige en gebruiksvriendelijke workflow die geen voorafgaande training van de gebruiker of het analysealgoritme vereist. Montages gegenereerd met Worm-align kan helpen bij de visuele inspectie van wormen, hun classificatie en representatie. Bovendien kan de output van Worm-align worden gebruikt voor latere kwantificering van fluorescentieintensiteit in enkele wormen, hetzij in FIJI rechtstreeks, of in andere softwareplatforms voor beeldanalyse. We laten dit zien door de Worm-align output te importeren in Worm_CP, een pijplijn die gebruik maakt van de open-source CellProfiler software. De flexibiliteit van CellProfiler maakt de integratie van extra modules voor hoog-inhoudsonderzoek mogelijk. Als praktisch voorbeeld hebben we de pijplijn gebruikt op twee datasets: de eerste dataset zijn beelden van warmteschok reporter wormen die groene fluorescerende eiwitten (GFP) uitdrukken onder de controle van de promotor van een warmteschok inducible gen hsp-70, en de tweede dataset zijn beelden verkregen uit vaste wormen, gekleurd voor vet-winkels met een fluorescerende kleurstof.

Inleiding

Een relatief eenvoudig organisme, de nematode C. elegans,is een uiterst nuttig modelsysteem voor het bestuderen van menselijke ziekten. Ongeveer 38% van de genen in het genoom van C. elegans heeft functionele tegenhangers bij mensen^1,2. Een van de unieke kenmerken van C. elegans is dat het optisch transparant is, waardoor gemakkelijk toegang is tot in vivo informatie over (sub)cellulaire expressie van tl-verslaggevers over weefsels. Dit maakt C. elegans een topmodel organisme voor high-content schermen met behulp van image-based platforms³. Echter, een probleem dat vaak compliceert deze studies is dat wanneer de beeldvorming dichte populaties van wormen, ze de neiging om te kruisen en te clusteren, het maken van vergelijkingen tussen individuele wormen uitdagend, vertroebelen downstream beeldanalyse en kwantificering.

Bestaande oplossingen die dit probleem te overwinnen meestal vertrouwen op de optimalisatie van de culturing en imaging protocol, zoals door het gebruik van micro-fluidics setups⁴, waardoor enkele wormen worden vastgelegd in afzonderlijke beelden^5,6. Anderen hebben toegepast machine-learning algoritmen waardoor voor de erkenning van enkele wormen, zelfs in een samengeklonterde bevolking. Een uitstekend voorbeeld van de laatste is de WormToolbox, dat is een modulaire uitbreiding van de open-source beeldanalyse platform, CellProfiler⁷. WormToolbox biedt een high-throughput en high-content oplossing voor analyse van C. elegans, en profiteert duidelijk van de opname ervan in CellProfiler, omdat aanvullende analysemodules gemakkelijk kunnen worden opgenomen. Hoewel WormToolbox wordt geleverd met een vooraf opgeleid model (DefaultWormModel.xml), is omscholing van het machine learning-algoritme meestal vereist voor elke nieuwe toepassing. Online tutorials over hoe dit te doen zijn beschikbaar op Github (https://cp-website.github.io/Worm-Toolbox/). Ondanks dit, het installeren en gebruiken van WormToolbox vereist een aanzienlijke tijd-investering voor beginnende gebruikers.

Hier beschrijven we een eenvoudig en kosteneffectief protocol voor cultuur en beeldpopulaties van C. elegans. Om de beoordeling van individuele wormen in de verworven beelden mogelijk te maken, hebben we een eenvoudige open-source FIJI-gebaseerde workflow ontwikkeld, genaamd Worm-align. Worm-align kan worden gebruikt om single- of multi-channel montages van rechtgetrokken en uitgelijnde wormen te genereren. Ten eerste moet de gebruiker handmatig individuele wormen selecteren voor analyse door een lijn van het hoofd naar de staart te trekken. Worm-align gebruikt deze selectie om geselecteerde wormen uit de overzichtsafbeelding bij te snijden en een montage te genereren waarin geselecteerde wormen worden rechtgetrokken en uitgelijnd om visuele vergelijking en presentatie te vergemakkelijken.

Bovendien kan de output van Worm-align worden gebruikt voor latere kwantificering van fluorescentieintensiteit in enkele wormen, hetzij in FIJI rechtstreeks, of in andere softwareplatforms voor beeldanalyse. We laten dit zien door de Worm-align output te importeren in Worm_CP, een pijplijn die gebruik maakt van de open-source CellProfiler software. De flexibiliteit van CellProfiler maakt de integratie van extra modules voor hoog-inhoudsonderzoek mogelijk. We hebben de Worm_CP pijpleiding gebruikt om de warmteschokrespons te kwantificeren, een goed bewaard beschermd mechanisme dat eiwitten die verkeerd zijn gevouwen als gevolg van stressoren zoals hoge temperatuur^8,opnieuw vouwt. Specifiek hebben we de pijpleiding toegepast op wormen die een geïntegreerde multi-copy transgene, waar de promotor van een warmteshock induceerbare gen, hsp-70(C12C8.1), drijft groene fluorescerende eiwit (GFP)⁹. We hebben ook gebruik gemaakt van de Worm_CP pijpleiding op vaste dieren die zijn geëtiketteerd met een fluorescerende kleurstof die lipide druppels (LP's) visualiseert, de belangrijkste vetopslag organelle in C. elegans¹⁰. Hoewel deze workflow niet over de doorvoer van WormToolBox beschikt, is het een gebruiksvriendelijk en eenvoudig alternatief voor visuele presentatie en analyse van op afbeeldingen gebaseerde C. elegans-experimenten.

Protocol

1. Fixatie van wormen voor vet-inhoud beeldvorming met behulp van een fluorescerende kleurstof voor lipide druppels (BODIPY)¹⁰

1. Bereid een gesynchroniseerde populatie van C. elegans voor door te bleken volgens standaardprocedures². Plaat ongeveer 1.000 L1-fase wormen op een 9 cm nematode groei media (NGM) plaat per aandoening.
   OPMERKING: Er worden meer wormen bereid dan aan het einde daadwerkelijk gekwantificeerd, als gevolg van verlies van wormen bij het hanteren.
2. Om dieren in een jongvolwassen stadium in beeld te brengen (ongeveer 50 uur na L1-beplating bij 20 °C), elke plaat van 9 cm met 15 mL M9 in een conische buis te wassen, 252 x g gedurende 1 min te centen en de supernatant te verwijderen.
3. Herhaal de was en laat 1 mL M9 over de pellet van wormen.
4. Breng 1 mL M9 met de wormen in een 2 mL laag eiwithoudende microcentrifuge buis, met behulp van lage retentie tips.
5. Spin naar beneden op 252 x g in een microcentrifuge gedurende 1 min en verwijder de supernatant, voorzichtig niet aan te raken de worm pellet aan de onderkant van de buis.
6. Voor het monitoren van het vetgehalte met behulp van 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (BODIPY) vlekken¹⁰ (Tabel van materialen), fix wormen hetzij door toevoeging van 0,5 mL van 60% isopropanol aan de worm pellet voor 3 min¹¹, of door het toevoegen van 2 mL van ijskoude methanol voor 10 min. Voor beide procedures, omkeren van de buis om de 30 s.
   LET OP: Als methanol het gekozen fixatiereagens is, moet deze stap worden uitgevoerd in een rookkap vanwege de toxiciteit.
7. Verwijder zoveel mogelijk fixatief zonder de wormpellet aan te raken en voeg 1 mL M9 toe. Laat de wormen 3−5 min aan de onderkant van de buis nestelen.
8. Was opnieuw met 1 mL M9, laat de wormen zich vestigen en verwijder de supernatant, waardoor ongeveer 50 μL in de buis achterblijft. Zet de buis vast met behulp van een klem.
9. Vries-scheur de wormen door het storten van de veilig gesloten buis in vloeibare stikstof en vervolgens in een warm water bad op ~ 40 °C.
10. Herhaal stap 1.9 nog één keer.
11. Voeg 0,5 mL bodipy verdund in M9 toe bij een uiteindelijke concentratie van 1 μg/μL en plaats op een rotator bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
12. Laat de wormen na 1 uur 3−5 min aan de onderkant van de buis nestelen.
13. Verwijder supernatant en voeg 1 mL M9 toe.
14. Laat de wormen vestigen aan de onderkant en verwijder supernatant.
    OPMERKING: Als alternatief is het mogelijk om 1 min naar beneden te draaien met 252 x g, omdat dit de morfologie niet lijkt te beïnvloeden.
15. Voeg 0,5 mL M9 toe.
    OPMERKING: Als het fixatieve 60% isopropanol is, kunnen de wormen alleen binnen 48 uur worden gebruikt. Als het fixatieve methanol is, moeten de wormen binnen 24u worden gebruikt.

2. Het voorbereiden van agarosepads om de wormen te monteren

OPMERKING: De kritieke stap tijdens de voorbereiding van een agarose pad is het verkrijgen van een pad van regelmatige dikte. Anders, wormen over het pad zal worden in verschillende brandpuntsvlakken, waardoor het lastig om een gericht beeld van een breder gezichtsveld te krijgen.

1. Bereid 2% agarosepads door 0,2 g agarose toe te voegen aan 10 mL gesteriliseerde H₂O in een beker of een conische kolf. Verwarm in de magnetron voor 30 s tot de agarose begint te koken.
   LET OP: Niet oververhit raken en stoppen zodra er bellen verschijnen; anders verhoogt de viscositeit van de agarose waardoor het moeilijker is om de gewenste paddikte te bereiken.
2. Zodra de agarose is gesmolten, afzien van een druppel gesmolten agarose in het midden van een microscoop glazen glijbaan met behulp van een 1000 μL pipet tip met zijn einde gesneden. Onmiddellijk, maar delicaat, houd een andere glazen dia zeer dicht bij de agarose laten vallen en laat het op de agarose om een pad van regelmatige dikte voor de beste microscopie resultaten te vormen.
   OPMERKING: Het loslaten van de bovenste dia van een hoogte zal niet alleen vormen bubbels, maar zal resulteren in een ongelijke pad. Als alternatief is het ook mogelijk om twee glazen dia's te gebruiken die de glijbaan flankeren met het pad, met een dun laagje tape op elke dia.
3. Verwijder na minimaal 2−3 min de bovenste schuif voorzichtig. Met behulp van de zijkant van de bovenste dia, trim het pad om het vierkant vormig te maken. Monteer de wormen binnen 5 minuten, om te voorkomen dat het pad voor gebruik droogt.

3. Montage van vaste wormen voor beeldvorming

1. Maak een mond micropipet door het uitbreiden van een dunne glazen capillaire in de vlam van een Bunsen brander (Figuur 1A). Na verlenging in de vlam, breek de capillaire in twee stukken (Figuur 1B). Kies de meest geschikte, meestal de langste, en test of het einde van de capillaire is open door te proberen om water aan te trekken.
   OPMERKING: Als de vloeistof niet in de capillaire komt, is deze te dun of geblokkeerd. Snijd voorzichtig het uiteinde van de capillaire met een schaar, het vermijden van snijden te veel als wormen zal worden aangezogen als het gat te groot is.
2. Sluit de glazen haarvat van stap 3.1 aan op de capillaire adapter (figuur 1C),gekoppeld aan de siliconen buis van 6 mm en sluit het andere uiteinde van de 6 mm siliconenbuis aan in een 0,2 μm-filter, bevestigd aan een siliconen buis van 3 mm aan de andere kant(figuur 1C). Sluit een filtertip van 1 mL(figuur 1C)aan op het vrije uiteinde van de 3 mm siliconen buis om vloeistof aan te trekken.
   OPMERKING: Het 0,2 μm-filter wordt toegevoegd tussen de mond van de experimentator en het capillair, om de maximale veiligheid van de onderzoeker te garanderen. Een soortgelijke oplossing wordt gebruikt voor mondmicropipets die worden gebruikt om muisembryo's te verwerken¹². Verander het filter (meestal om de paar maanden) als de mond micropipet is niet aspirating vloeistof meer.
3. Verwijder met behulp van de mondmicropipet onder een dissectiemicroscoop zoveel mogelijk vloeistof rond de wormkorrel van vaste wormen(figuur 2).
   OPMERKING: Pipetting supernatant uit met behulp van een handmatige micropipet kan worden gebruikt als een alternatief voor de mond pipetten in stappen 3.1 tot en met 3.3 om zo veel supernatant mogelijk te verwijderen. Voeg 6 μL montagemedium toe. We vinden echter dat deze methode niet zo efficiënt werkt omdat overmatige vloeistof in de pads een schaarse wormdichtheid creëert, waardoor beeldvorming tijdrovender wordt. Hervat stap 3.6. Kijk naar de onderkant van de buis en zorg ervoor dat de pipet de wormen niet aanzuigen.
4. Voeg snel 10 μL montagemedium(Tabel van Materialen) toe aan de onderkant van de buis.
5. Spoel een 10 μL-tip in PBS met sporen van wasmiddel (0,01% Triton), om te voorkomen dat wormen aan de zijkanten van de plastic pipetpunt blijven plakken. Snijd het uiteinde van de punt met een schaar.
6. Breng 8 μL montagemedium met de wormen over op het agarosepad dat in stap 2.3 is bereid. Onder de microscoop, schud voorzichtig de dia, om overlap van de wormen te voorkomen.
7. Bedek de val van het montagemedium op de agarosepad met een 18 mm x 18 mm coverslip (figuur 3).
   LET OP: Kleinere covers hebben de voorkeur omdat ze minder druk uitoefenen op de wormen. Houd de coverslip met een pincet en breng een rand van de coverslip tegen de agarose pad, voordat voorzichtig depon met de pincet.

4. Montage van levende wormen voor beeldvorming

OPMERKING: Om levende wormen in beeld te brengen, moeten ze op het pad worden geïmmobiliseerd. Een manier om dit te bereiken is om ze te verlammen met de nicotinische receptor agonist: levamisole (Tabel van materialen).

1. Pipet 3−4 μL van 3 mM levamisole opgelost in M9 op de agarose pad gemaakt in stap 2.3.
   OPMERKING: Er moet voldoende vloeibaar volume zijn dat de wormen niet op elkaar zitten, maar niet te veel vloeistof dat de wormen te schaars op het pad zijn. Ervaren wormplukkers kunnen 3 μL levamisole gebruiken. Minder ervaren plukkers moeten mogelijk een groter volume levamisole toevoegen, zodat de levamisole niet volledig verdampt.
2. Kies 30−50 wormen per aandoening in de druppel levamisole.
3. Bedek de druppel levamisole op de agarosepad met een 18 mm x 18 mm coverslip. Beeldwormen binnen 1 uur, als de verlammende agent zal uiteindelijk leiden tot de dood van de wormen.

5. Beeldvorming dia's met een epifluorescentie microscoop

1. Met een agarose pad van uniforme dikte, beeld alle wormen op de dia in een keer met behulp van een 6 x 6 of 7 x 7 groot beeld bijvoorbeeld met de 20x doelstelling van een fluorescerende microscoop. Als de dikte van de pad niet eens is, verkrijg dan enkele kleinere 3 x 3 of 4 x 4 afbeeldingen van dezelfde dia.
2. Gebruik dezelfde instellingen voor fluorescentieintensiteit en belichtingstijd voor alle omstandigheden. Pas elke instelling aan op de dia met de helderste intensiteit, zodat er geen pixelverzadiging is. Voor specifieke instructies over het verwerven van afbeeldingen, volg de instructies van de microscoopfabrikant.

6. Het maken van montage beelden van uitgelijnde enkele wormen met behulp van de Worm-align FIJI pijplijn

1. Installeer het open-source softwarepakket voor beeldanalyse FIJI¹³/ImageJ¹⁴ van https://imagej.net/Fiji. Als er een voorafgaande installatie van FIJI beschikbaar is, moet u ervoor zorgen dat deze wordt bijgewerkt naar versie 1.52a of hoger, omdat sommige functies die in de macro worden gebruikt (bijvoorbeeld tabelfuncties) dit vereisen. Download de worm-align macro van Github: https://github.com/hannekeo/Worm-align.
2. Open FIJI en voer de worm-uitlijnen macro uit. Worm uitlijnen uitvoeren door op Plug-ins te klikken | Macro's | Uitgevoerd in de fiji-hoofdmenubalk(figuur S1). Zoek nu het Worm-align.ijm script op de computer.
3. De macro initialiseert door te vragen naar de locatie van de afbeeldingen. De pijplijn zal werken op zowel single-channel en multi-channel fluorescentie beelden (Figuur S2). Selecteer een invoermap en de macro genereert automatisch een uitvoermap waarin alle resultaten worden opgeslagen(figuur S3).
   OPMERKING: Het is belangrijk dat de geselecteerde map alleen afbeeldingsbestanden bevat, omdat de aanwezigheid van andere bestandsindelingen ervoor zorgt dat de macro vastloopt. Idealiter groeperen alleen afbeeldingen die zijn vastgelegd met dezelfde microscoopinstellingen. Worm-align accepteert veel verschillende bestandsformaten, waaronder nd2, czi, tif, rgb, jpg en png. De naam van de uitvoermap is dezelfde als de invoermap, waarbij '_output' als postfix wordt toegevoegd, d.w.z. als de invoermap 'afbeeldingen' is, wordt de uitvoer gevonden in 'images_output'. De uitvoermap bevat vier submappen, waarin de gegevens worden opgeslagen.
4. Laat de macro doorgaan met het openen van de eerste afbeelding in de invoermap en deze gebruiken als een representatieve afbeelding om een instelling te extraheren om de montage te genereren.
   OPMERKING: Worm-align selecteert automatisch de eerste afbeelding in de invoermap om de instellingen te genereren die worden toegepast op alle andere afbeeldingen in de map. Als een andere afbeelding wordt beschouwd als representatiever van de gegevensset, moet u ervoor zorgen dat deze afbeelding wordt geselecteerd door een kopie van de afbeelding op te slaan in de invoermap, waarbij de naam wordt gewijzigd zodat deze nu bovenaan de lijst wordt weergegeven (bijvoorbeeld '0_RepresentativeImage').
5. Teken met het tekengereedschap Rechte lijn trekt een lijn over de breedte van een worm(Figuur S4)en gebruik de lengte van deze lijn om de hoogte van de bijgesneden gebieden voor enkele wormen te bepalen. Geef voor elk kanaal de naam, opzoektabel (LUT), intensiteitsinstellingen (B&C) op en of deze moet worden opgenomen in de montage(figuur S4).
   OPMERKING: Deze parameters worden opgenomen en opgeslagen in een instellingenbestand, Instellingen.csv, in de cellprofiler-submap van de uitvoermap.
6. Zodra alle instellingen zijn vastgelegd, wordt de gebruiker getoond hoe de afbeeldingen eruit zullen zien na toepassing van de toegepaste instellingen(Figuur S5). Vink het bovenste vakje aan als de instellingen voldoende zijn. Selecteer opties voor het maken van montage (verwijder teken, indien niet vereist): 1. Genereer een montage van geselecteerde wormen voor elke afbeelding, of 2. Genereer een gecombineerde montage waarin alle wormen geselecteerd op alle afbeeldingen in de invoermap worden gecombineerd tot een enkele montage. Klik op OK om de rest van de macro uit te voeren.
   OPMERKING: Als het bovenste vakje niet is aangevinkt voordat u op 'OK' klikt, wordt de installatie opnieuw uitgevoerd, zodat de afbeeldingsinstellingen kunnen worden geoptimaliseerd.
7. De worm-uitlijnpijplijn gaat nu verder met het openen van alle afbeeldingen in de invoermap. Teken voor elke afbeelding lijnen op de lengteas van alle wormen die in de montage moeten worden opgenomen en/of die(figuur 4 en figuur S6)worden opgenomen met behulp van het gereedschap 'gesegmenteerde lijn' (op de hoofdmenubalk van FIJI). Om een goede uitlijning van worm te garanderen, trek lijnen consequent van kop naar staart (of vice versa), en langs de volledige lengte van de worm (zie voorbeelden van "goede" en "slechte" lijn tekening in figuur 4B).
8. Voeg elke regel toe aan de ROI-managerdoor op Ctrl+T te klikken. Worm-align gebruikt de regels die zijn toegevoegd aan de ROI-manager, in combinatie met de parameter wormbreedte (ingesteld in stap 6.4) om bijgesneden afbeeldingen van enkele geselecteerde wormen te genereren. Het verzamelen van regel-ROM's wordt opgeslagen in de submap 'gegevens'. Deze map bevat ook een kopie van de oorspronkelijke afbeelding met de lijnen, evenals het nummer van de worm. Lijnen zijn kleurgecodeerd met de Glasbey_on_dark opzoektabel. De afbeeldingen van rechtgetrokken wormen worden opgeslagen in de single_worms submap van de uitvoermap. Bovendien, indien geselecteerd in stap 6.6 van dit protocol, Worm-align produceert montages van alle wormen geselecteerd per overzicht afbeelding en / of voor alle overzicht beelden in de invoermap (zie figuur 4C en figuur S7). Deze montages zijn te vinden in de 'uitgelijnde' submap van de uitvoermap.

7. Analyse van single-worm fluorescentie intensiteit met behulp van de output van Worm-align in een geautomatiseerde CellProfiler pijplijn

1. Voor downstream gegevensverwerking en analyse van de Worm-align output, downloaden en installeren van de open-source image analysis software pakket 'CellProfiler^15,16 van https://cellprofiler.org/. Download de Worm_CP.cpproj-pijplijn van GitHub: https://github.com/hannekeo/Worm-align
   OPMERKING: De hier beschreven voorbeeldpijplijn is gemaakt met CellProfiler2.2.0 en wordt mogelijk niet uitgevoerd in latere versies van CellProfiler.
2. Voordat u de Worms_CP.cpproj-pijplijn start, moet u ervoor zorgen dat alle verwachte uitvoerafbeeldingen aanwezig zijn in de CellProfiler-submap van de map Worm-align output: een verwerkte kopie van de oorspronkelijke afbeelding (met de naam: Original_), een binair afbeeldingsmasker van de wormpopulatie (met de naam: Mask_), een lijnmasker van de lijnen die zijn getekend op geselecteerde wormen (met de naam: Lines_), en één afbeelding die elk van de kanalen vertegenwoordigt die in de oorspronkelijke afbeelding aanwezig zijn (genoemd naar kanaalnummer).
3. Als u de fluorescentieintensiteit in enkele wormen wilt kwantificeren, klikt u op de invoermodule Afbeeldingen en sleept u de uitvoermap CellProfiler gewoon naar het venster met de tekst Bestanden en mappen neerzetten. Als er een lijst met afbeeldingen uit eerdere analyses aanwezig is, verwijdert u deze eerst door met de rechtermuisknop in het venster te klikken en bestandslijst wissen te selecteren. Als u het bestand 'Instellingen.csv' wilt uitsluiten van de lijst met afbeeldingen, selecteert u 'Afbeeldingen alleen' of 'Aangepast' met 'Extensie is tif, tiff, ome.tif of ome.tiff' voor de filterinstellingen(figuur S8).
4. Klik op de invoermodule Metagegevens. Klik in de tweede extractiemethode op de gele map en zoek de submap CellProfiler in de map WormAlign-uitvoer (figuur S9). Selecteer het bestand Instellingen.csv en koppel de instellingen in het bestand aan de CellProfiler-uitvoer door de metagegevens in de CSV-bestanden te koppelen aan die in de afbeeldingen (Kanaalmetagegevens).
5. Klik op de invoermodule NamenAndTypes en voeg een nieuwe afbeelding in voor elk kanaal van de oorspronkelijke afbeelding dat moet worden gekwantificeerd.
   OPMERKING: Reeds aanwezig in de voorbeeldpijplijn zijn het wormmasker, twee kleurenafbeeldingen, het lijnmasker en de oorspronkelijke afbeelding en drie afbeeldingen met grijze schaal (het groene en het rode kanaal). De lijst in deze module moet worden aangepast als de oorspronkelijke afbeeldingen meer of minder kanalen hebben dan de voorbeeldafbeeldingen.
6. Controleer of de naam van de afbeeldingen in elk kolomlabel/masker/worm juist is.
   OPMERKING: De namen van de afbeeldingen op één regel moeten allemaal overeenkomen met dezelfde eerste afbeelding die moet worden geanalyseerd. Als er een fout wordt gemaakt tijdens het beeldanalyseproces, ontbreken sommige uitvoerafbeeldingen en komen de namen onder de drie kolommen label/masker/wormen niet meer overeen met dezelfde oorspronkelijke afbeelding voor elke regel. Als dit het geval is, zoek dan waar de fout is.
7. Druk op De uitvoerinstelling weergeven om de map te selecteren om de uitvoer van Cellprofiler op te slaan.
8. Klik op Testmodus starten. Controleer eenmaal in de testmodus de instellingen van de pijplijn door ze toe te passen op de eerste afbeelding in de gegevensset, door op Uitvoeren te klikken (die door alle actieve modules in de pijplijn wordt uitgevoerd) of Stap (die één module tegelijk door de pijplijn loopt).
   OPMERKING: In de testmodus worden de uitgepakte metingen niet geëxporteerd, zelfs niet als er een ExportToSpreadsheet-module aanwezig is (en actief) in de pijplijn is.
9. Zodra de pijplijn presteert zoals het hoort, klikt u op Testmodus afsluiten en drukt u vervolgens op Afbeeldingen analyseren. Zoals momenteel geconfigureerd, zal de Worms_CP (1) de Mask_ afbeelding gebruiken om een ruw wormmasker en de Lines_ afbeelding(Figuur S10A)te segmenteren om de geselecteerde wormen eruit te selecteren en enkele wormmaskers te produceren(Figuur S10C), (2) meet de fluorescentie intensiteit van alle kanalen aanwezig in de invoerbeelden in die wormen geïdentificeerd en gemaskeerd. De pijplijn kan ook de achtergrondintensiteit meten (Figuur S10B) en alle afbeeldingen dienovereenkomstig corrigeren (aangegeven door de woorddrempel in de naam van de gemeten parameter Intensity_MeanIntensity_green_threshold.
10. Open de Worm_CP uitvoer bestaande uit twee csv-bestanden, wormen.csv en lijnen.csv die zijn opgeslagen in de geselecteerde uitvoermap (zie figuur S11). Deze bestanden kunnen worden geopend in Excel of R (Studio) voor nabewerking en rapportage. Als extra uitvoer vereist is, bijvoorbeeld per afbeeldingsgegevens, kan deze worden geselecteerd in de module ExportToSpreadsheet in de pijplijn.

Resultaten

Culturing en imaging C. elegans volgens de methode beschreven in dit protocol produceert grote overzichtsbeelden van wormpopulaties. Om visuele inspectie en classificatie van wormen uit deze beelden te vergemakkelijken hebben we Worm-align ontwikkeld. Worm-align is een eenvoudige en gebruiksvriendelijke FIJI script dat kan worden gebruikt om montages van rechtgetrokken en uitgelijnde wormen te maken. Wormen worden geselecteerd uit overzichtsbeelden door een lijn te tekenen langs de lengteas van de wormen. Elke geselecteerde worm krijgt een getal toegewezen, bijgesneden en rechtgetrokken en toegevoegd aan een montage. Montages kunnen per afbeelding worden gegenereerd of alle afbeeldingen uit de oorspronkelijke invoermap combineren.

Zoals verwacht, de output van de pijpleiding hangt grotendeels af van de kwaliteit van de lijnen getrokken op de top van de beelden. Om dit punt te illustreren, toont figuur 4 verschillende lijnvoorbeelden en hun uitvoer van Worm-align. Een complete lijn van het hoofd naar het puntje van de staart produceert een goed uitgelijnde worm (gelabeld "goed"). Figuur 4 laat ook zien hoe het traceren van onnauwkeurigheden tijdens de uitvoering van Worm-align de output van de uitlijning beïnvloedt. Van de geannoteerde montage opgenomen in figuur 4C, moet ervoor worden gezorgd om de volgende fouten te voorkomen, omdat ze belemmeren de juiste uitlijning van wormen:

• Inconsistente tracering van de worm van kop tot staart (gelabeld als "staart aan kop"). Dit resulteert in wormen worden georiënteerd in verschillende richtingen (dat wil zeggen, staart-kop versus kop-tot-staart) in de uitlijning.
• Onvolledige tracering (gelabeld als "onvolledig"). Dit resulteert in alleen het deel van de worm dat werd getraceerd te worden bijgesneden voor de montage.
• Inclusief meerdere wormen in een enkel spoor (gelabeld "worm met twee hoofden"). Dit resulteert in wormen plus (significante delen van) hun buren worden ingevoegd in hetzelfde paneel van de montage.
• Het toevoegen van willekeurige lijnen aan de afbeelding (gelabeld "willekeurig"). Dit resulteert in het inbrengen van willekeurige panelen in de montage.

Voor het maken van de montage is het geen probleem als twee afzonderlijke lijnen elkaar kruisen (gelabeld "kruisen") of worden samengevoegd aan beide kanten van de worm (gelabeld "samengevoegd"), zolang elke regel de gehele lengte van een individuele worm volgt: Het Worm-align script individueel en sequentieel selecteert elke lijn ROIs, gewassen en rechttrekt het, zodat elk paneel in de uiteindelijke montage een enkele lijn traceert. In het geval van de kruisende wormen echter, hoewel volledige lengte rechtgetrokken wormen verschijnen voor worm "kruisen1" en worm "kruisen2" in de montage (zie figuur 5A-B), is het duidelijk merkbaar dat deze wormen elkaar kruisen in het oorspronkelijke overzicht beeld. Daarom kan worden geconcludeerd dat visuele identificatie van kruislijnen mogelijk is vanuit de overlayafbeelding in de submap 'gegevens'(figuur 5A), evenalsvan de panelen van individuele wormen in de montage (figuur 5B). Bovendien kan elke overlapping van wormen/lijnen worden geïdentificeerd uit de QC-tabel (quality control) die voor elke verwerkte afbeelding wordt gegenereerd door Worm-align, en opgeslagen in de submap van de gegevens. Deze tabel registreert drie parameters voor elk van de in de afbeelding getekende lijn-ROI's (zie figuur 5C):Van deze geeft Lengte de lengte van de lijn ROI aan, wat een goede indicator is van de grootte van de worm; en het Worm-getal geeft de volgorde aan waarin de lijnen op de overzichtsafbeelding zijn getekend. Ten slotte geeft de laatste kolom aan of er overlap is tussen de worm/lijn in kwestie en een van de andere wormen/lijnen die in de afbeelding zijn geselecteerd. In het geval van overlapping zal het getal in deze kolom afwijken van het getal dat in de kolom Wormnummer wordt vermeld. In combinatie met het overlaybeeld moet de QC-tabel de onderzoeker helpen om geleerde beslissingen te nemen over welke wormen van de montage en/of kwantificering moeten worden uitgesloten.

De output van Worm-align kan worden gebruikt voor latere kwantificering van fluorescentie intensiteit in enkele wormen. In FIJI kan de lijn-ROI's worden gebruikt om fluorescentieintensiteit te meten in de oorspronkelijke beeldgegevens, bijvoorbeeld door het eenvoudige FIJI-script 'Worm-quant.ijm', dat ook te vinden is in de Worm-align repository op Github. Als alternatief kan de Worm-align output worden geïmporteerd in de software voor beeldanalyse van derden. We laten dit zien door de Worm-align output van twee datasets te importeren in Worm_CP, een pijplijn die we hebben gegenereerd in CellProfiler. Worm_CP gebruikt de bestanden in de submap 'CellProfiler' van de map Worm-align output om segmentatiemaskers van die afzonderlijke wormen die zijn geselecteerd tijdens de uitvoering van de worm-align macro te verfijnen. Specifiek, het maakt gebruik van de lijn masker (genaamd: Lines_) om geselecteerde wormen te isoleren van de worm populatie gezien in het binaire masker (genaamd: Mask_). Opgemerkt moet worden dat lijnen die elkaar kruisen op de overzichtsafbeelding (figuur 5A), hoewel geen probleem voor het genereren van montages, problematisch zijn voor de Worm_CP pijplijn. Waarom dit het geval is, wordt geïllustreerd in figuur 5 D-E. Worm_CP gebruikt het lijnmasker (Figuur 5D),en niet individuele ROI's om de identificatie van individuele wormen te helpen. De kruisende lijn die tweede wordt getrokken tijdens de uitvoering van Worm-align wordt op de eerste regel geplaatst en daarom zal de intensiteit langs deze lijn die van ROI2 zijn, inclusief in de bit waar lijn 1 en 2 elkaar overlappen. Als gevolg hiervan segmenteert CellProfiler lijn2 als één object, maar regel1 als twee objecten die zijn gescheiden waar deze kruist met lijn2. Dit betekent dat CellProfiler twee (halve) wormmaskers zal produceren voor worm 'intersecting1' (Figuur 5E). De eenvoudigste manier om deze gebeurtenissen uit te sluiten van de uiteindelijke analyse (indien nodig), is het wormengetal kruisende wormen uit de QC-tabel (dataubmap) te identificeren en metingen voor deze wormen uit de CellProfiler-uitvoerbestanden te verwijderen. Houd er rekening mee dat wormen niet noodzakelijkerwijs hetzelfde getal krijgen toegewezen in FIJI en CellProfiler: Om het FIJI-wormnummer in de CellProfiler-uitvoer te identificeren, moet u kijken naar de Intensity_Max_Intensity waarden in het uitvoerbestand 'Lines.csv'. Elke Intensity_Max_Intensity waarde die meer dan één keer per afbeelding in de tabel 'Lijnen.csv' wordt weergegeven, is een indicatie van die lijn ROI die resulteert in een gebroken wormmasker.

Zodra individuele wormmaskers zijn gesegmenteerd, kunnen Worm_CP de fluorescentieintensiteit in de geselecteerde wormen voor alle geregistreerde kanalen meten. Alle metingen worden genomen uit de oorspronkelijke (ruwe) afbeeldingsgegevens, hoewel opgemerkt moet worden dat CellProfiler de pixelintensiteit automatisch reschaalt op een schaal van 0-1. Dit wordt bereikt door de waarde van de ruwe pixelintensiteit te delen door de maximaal mogelijke pixelintensiteit voor de afbeelding. In het geval van 8-bits afbeeldingen is deze waarde 255, en in het geval van 16-bits beelden is het 65535. De intensiteitswaarden van CellProfiler moeten daarom worden vermenigvuldigd met de maximaal mogelijke intensiteitswaarde om waarden te herwinnen die gelijkwaardig zijn aan de ruwe afbeeldingsgegevens. De Worm_CP output bestaat uit twee csv-bestanden, 'wormen.csv' en 'Lines.csv' die worden opgeslagen in de geselecteerde uitvoermap. Tijdens het inspecteren van deze bestanden, is het duidelijk dat CellProfiler registreert een groot aantal parameters met betrekking tot fluorescentie intensiteit. Van deze, de Intensity_IntegratedIntensity komt overeen met de totale fluorescentie per worm (dat wil zeggen, de som van de fluorescentie intensiteit binnen alle pixels die het masker van een individuele worm construeren). De parameter Intensity_MeanIntensity verwijst naar de gemiddelde fluorescentieintensiteit binnen een individuele worm (d.w.z. de gemiddelde fluorescentieintensiteit per pixel voor alle pixels in een individuele worm). Vanwege het incidentele optreden van (kleine) fouten bij het segmenteren van de wormmaskers wordt aanbevolen dat MeanIntensity-metingen worden gebruikt bij het vergelijken van fluorescentiemetingen van individuele wormen tussen twee omstandigheden. Als u de achtergrondfluorescentie wilt substracteren van gekwantificeerde metingen, gebruikt u de meetpunten met de naam MeanIntensity_Threshold.

We hebben de Worm_CP pijpleiding gebruikt om de fluorescentieintensiteit te kwantificeren van vaste dieren die zijn geëtiketteerd met een fluorescerende kleurstof die is verwerkt in lipidedruppels (LP's) (figuur 6). Om fluorescentiekwantificering van de Worm-align/Worm_CP-pijplijn te valideren, hebben we de fluorescentieintensiteit in dezelfde set wormen uit de BODY-dataset gekwantificeerd door de Worm-align/Worm_CP-pijplijn of handmatige kwantificering in FIJI/ImageJ. Handmatige kwantificering werd uitgevoerd in FIJI / ImageJ door cirkelen elke worm evenals een donkere achtergrond zone in elk beeld. De fluorescentieintensiteit werd gemeten in de ROI-manager en de waarde gemeten voor de beeldachtergrond werd afgetrokken van de wormfluorescentiemeting van elke worm, zoals beschreven¹⁷. We vergeleken wild type (WT) N2 wormen met dbl-1 (nk3) mutanten, die een verlaagd lipidedruppelgehalte^{vertonen 18}. Zoals verwacht is de groene fluorescentieintensiteit aanzienlijk verminderd tussen WT- en dbl-1(nk3) wormen met beide methoden (figuur 6A,B). Voorbeelden van uitgelijnde wormen kunnen worden waargenomen in figuur 6C, D. Het lipidedruppelgehalte wordt verminderd met 17% (p-value<0,0001, ongepaarde t-test) tussen WT en dbl-1(nk3) met behulp van handmatige kwantificering, en met 14% (p-value=0,0051 ongepaarde t-test) met behulp van de Worm_CP-pijplijn. De daling van het lipidedruppelgehalte dat hier in dbl-1(nk3) met beide kwantificeringsmethoden wordt waargenomen, is in overeenstemming met de literatuur¹⁸. Hieruit blijkt dat kwantificering van verworven fluorescentiebeelden met de Worm_CP CellProfiler-pijplijn vergelijkbaar is met handmatige kwantificering.

We hebben ook Worm_CP gebruikt om de warmteschokrespons te kwantificeren bij levende wormen die GFP uitdrukken onder controle van de hitteshock ontduceerbare gen hsp-70(C12C8.1)⁹. Figuur 7 toont representatieve beelden van levende C. elegans die de warmte-responsieve hsp-70(C12C8.1)p::GFP verslaggever. Bij afwezigheid van hittestress wekken de wormen geen GFP-expressie op(figuur 7A,B). Wanneer wormen echter worden blootgesteld aan een korte hitteschok van 30 min bij 34 °C, veroorzaken ze GFP-expressie(figuur 7C,D). GFP-expressieniveaus met en zonder warmteschok worden gekwantificeerd in figuur 7E.

Zoals het er nu uitziet, is Worm_CP een zeer eenvoudige pijplijn. Deze aanpak maakt echter wel een nauwkeurigere segmentatie van individuele wormmaskers mogelijk, wat een nauwkeurigere kwantificering van de fluorescentieintensiteit mogelijk maakt bij de wormen die uit het beeld zijn geselecteerd. Om deze reden geven we de voorkeur aan deze aanpak boven een ruwe kwantificering in FIJI, met alleen de lijnmaskers. Daarnaast biedt CellProfiler het voordeel dat extra analysemodules eenvoudig in de pijplijn kunnen worden opgenomen. Voor de gegevensset die bijvoorbeeld naar lipidedruppelinhoud kijkt, kan het inbrengen van extra modules in de Worm_CP-pijplijn lipidedruppelnummers en fluorescentieintensiteit van individuele druppeltjes in de wormen die in de overzichtsafbeeldingen zijn geselecteerd, onderzoeken.

Figuur 1: Het genereren van een mond micropipet. Een glazen capillair wordt uitgebreid in de vlam van een Bunsen brander(A), totdat het zorgt voor dunne langwerpige ledematen(B). De verlengde glazen capillaire wordt vervolgens aangesloten op de adapter stuk van de mond micropipet. (C) Schematisch van een mondmicropipet. De mondmicropipet werd gemonteerd met een glazen capillair aangesloten op een adapter. Een siliconen buis van 6 mm verbindt de adapter met een spuitfilter van 0,2 μm, gebruikt voor de veiligheid. Het andere uiteinde van het filter is bevestigd aan een 3 mm siliconen buis eindigend met een 1mL filtertip. De experimentator kan via de filterpunt aanzuigen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: Aspiratie van de vloeistof rond de wormpellet, met behulp van de mondmicropipet. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: Het toevoegen van de coverslip op de wormen tot op de agarose pad Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: Voorbeelden van worm rechttrekken met behulp van Worm-align op fluorescentie beelden verkregen van levende dieren die de transcriptie verslaggever fat-7p::GFP in de darm en een rode co-injectie marker in de keelholte (myo-2p::tdtomato). (A) Screenshot van een samengestelde afbeelding verworven op de fluorescerende microscoop van levende wormen op dag 3 van de volwassenheid. Het beeld werd geopend met Worm_align en lijnen werden getrokken langs de lengteas van de wormen met behulp van Worm-align. (B) Screenshot van dezelfde afbeelding als in (A), met voorbeelden becommentarieerd van goede en slechte tekening van de lijnen langs de as van de wormen, met behulp van Worm-align. (C) Voorbeelden van lijnen getrokken op de top van wormen die kunnen oplopen tot verkeerd uitgelijnde wormen. Worm-align output van de wormen geselecteerd in B. Beelden werden genomen met een 20x doelstelling op een omgekeerde breedveld microscoop (zie Tabel Materialen) met groene fluorescentie intensiteit = 1, exposure = 60 ms en rode fluorescentie intensiteit = 8, exposure = 60 ms. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: Voorbeelden van wormentrekken met behulp van Worm-align op kruisende wormen. (A) Screenshot van een samengestelde afbeelding verworven op de fluorescerende microscoop van levende wormen op dag 3 van volwassenheid dieren die de transcriptie verslaggever fat-7p::GFP in de darm en een rode co-injectie marker in de keelholte(myo-2p::tdtomato). Kruisende wormen worden aangeduid als "kruisen1" en "kruisen2", terwijl niet-overlappende wormen worden geëtiketteerd "good3" en "good4". (B) Montage gemaakt door Worm-align vertegenwoordigen rechtgetrokken wormen geselecteerd in (A). Het is merkbaar in de montage dat de wormen 1 en 2 elkaar kruisten op het oorspronkelijke beeld (wormen geëtiketteerd als "kruisen1" en "kruisen2"). (C) Screenshot van de QC tabel van Worm-align die het mogelijk maakt om gevallen waar wormen elkaar kruisen ter plaatse. Lengte: lengte van de ROI-lijn; wormnummer: volgorde waarin de lijnen werden getrokken; laatste kolom geeft aan of er een overlap is tussen de worm/lijn van belang en een andere worm. In dit voorbeeld overlapt de worm in de eerste ruwe (wormnummer1) met wormnummer 2, zoals aangegeven door het getal "2" in de laatste kolom. (D) Screenshot van de lijnen getekend met Worm-align op de vier wormen geselecteerd in A. (E) Screenshot van de maskers gegenereerd door Worm-uitlijnen op de vier wormen geselecteerd in A, waaruit blijkt hoe de maskers voor de twee kruisende wormen worden weergegeven. In dit geval zijn twee maskers in plaats van een nu overeenkomend met de worm "kruisen1". Beelden werden genomen met een 20x doelstelling op een omgekeerde breedveldmicroscoop (zie Tabel Materialen) met groene fluorescentieintensiteit=1, exposure=60ms en rode fluorescentieintensiteit = 8, belichting = 60 ms. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 6: De Worm_CP pijpleiding kwantificeert fluorescentie net zo nauwkeurig als handmatige kwantificering. Vergelijking van fluorescentie kwantificering van jongvolwassen wormen vast en gekleurd voor lipide druppelgehalte met de groene fluorescerende kleurstof BODIPY, met behulp van Worm_CP pijpleiding(A)of handmatige kwantificering (B). Het lipidedruppelgehalte van WT en dbl-1 (nk3) werd gecontroleerd door dieren met BODIPY te fixeren en te bevlekken, die intercaleert in vetzuren van lipidedruppels (zie protocol A). Jongvolwassen dieren werden vastgesteld met 60% isopropanol en gekleurd met BODIPY voor 1u. Dezelfde set dieren werd gekwantificeerd met behulp van de Worm_CP pijpleiding (zie stap 7) of door handmatige kwantificering volgens standaardprocedures¹⁷. a) Kwantificering van fluorescentie met behulp van Worm_CP pijpleiding. WT: n=22 dieren, gemiddelde fluorescentie= 1.016 (A.U) ± 0,206 SD; dbl-1(nk3):n=25 dieren, gemiddelde fluorescentie= 0,8714 (A.U) ± 0,126 SD. Ongepaarde t-test. B) Handmatige kwantificering van fluorescentie. WT: n=22 dieren, gemiddelde fluorescentie = 1,048 ± 0,153 SD; dbl-1(nk3):n=25 dieren, gemiddelde fluorescentie = 0,8632 ± 0,109 SD. Ongepaarde t-test. C, D) Representatief voorbeeld of Worm-Align output voor WT (C) en dbl-1(nk3) (D) dieren rechtgetrokken met de Worm-align pijplijn. Beelden werden genomen met een 20x doelstelling op een omgekeerde breedveldmicroscoop (zie Tabel Materialen) met groene fluorescentieintensiteit=2, exposure=60ms. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 7: Voorbeeld van fluorescentie kwantificering en uitlijning van levende wormen van fluorescentiebeelden van levende wormen die de transcriptieverslaggever hsp-70(C12C8.1)p (C12C8.1)p::GFP na hitteschok dragen. a) Bij een korte hitteschok (30 min bij 34 °C) werden jonge volwassen wormen teruggewonnen bij hun teelttemperatuur (25 °C) en vervolgens 3,5 uur na de hitteschok gemonteerd. Ongeveer 30 wormen werden gekwantificeerd na hitteschok met behulp van de Worm-align pijpleiding. (A-B) Voorbeelden van uitgelijnde wormen die niet zijn blootgesteld aan hitteschok. (C-D) Voorbeelden van hitte-geschokte wormen die hsp-70(C12C8.1)p::GFP met behulp van Worm-align. (E) de GFP-gemiddelde intensiteit (Worm_CP parameter: MeanIntensity_Threshold) van wt-jongvolwassen wormen die worden geteeld, zonder hitteschok of bij blootstelling aan hitteschok (34 °C gedurende 30 min). De beelden werden genomen met een 20x doelstelling op een omgekeerde breedveldmicroscoop (zie De lijst van materialen) met groene fluorescentieintensiteit=1, blootstelling=60ms; geen GS: n=12, GS: n=32. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Locatie in FIJI waar de Worm-align macro kan worden gevonden, eenmaal geïnstalleerd. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Selectie van de map met alle afbeeldingen die met dezelfde instellingen zijn gemaakt. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 3: Generatie van 4 submappen in de uitvoermap in FIJI. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 4: Tekening van een lijn over de breedte van de worm en kanaal instellingen voor de montage. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 5: Voorbeeld van de afbeelding met de toegepaste instellingen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend figuur 6: Tekening van een lijn langs de lengteas van de wormen van belang voor opname in de montage en/of kwantificering. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 7: Montage van de geselecteerde wormen in de uitvoermap, onder "uitgelijnde" map. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 8: Vorige afbeeldingen wissen uit eerdere analyses in Cell Profiler. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 9: Metagegevens importeren in CellProfiler vanuit de map Met worm uitlijnen door de submap Instellingen .csv te selecteren. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 10: De CellProfiler-pijplijn Worm_CP.cpproj gebruikt de Lines_ afbeeldingen om de geselecteerde wormen (A) te selecteren en produceert enkele wormmaskers van de wormen van belang (C). De pijpleiding meet ook de achtergrondintensiteit (B). Outlook van alle parameters gemeten door de pijplijn Worm_CP.ccproj die worden geëxporteerd in een csv-bestand (D). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 11: Selectie van uitvoerbestanden in de pijplijn "ExportToSpreadsheet in de Worm_CP.cpproj-pijplijn. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Worm-align is een FIJI-gebaseerde beeldverwerkingspijplijn die gemakkelijk montages van door de gebruiker geselecteerde wormen genereert, waarin wormen worden rechtgetrokken en uitgelijnd om visuele vergelijking, classificatie en representatie te helpen. Hoewel deze functie ook wordt aangeboden door een aantal bestaande tools, met name de WormToolbox module in CellProfiler⁷, Worm-align vereist relatief weinig eerdere beeldanalyse ervaring: Gebruikers hoeven alleen maar te traceren die wormen die ze willen selecteren voor de montage (en analyse). Hoewel het traceren van de wormen op de ruwe beeldgegevens een eenvoudig proces is - vooral wanneer een touch-screen computer of tablet beschikbaar is- is het van het grootste belang dat lijnen correct worden getrokken langs de lengteas van de wormen. Onvolledige lijnen, die slechts een deel van de worm volgen, zullen resulteren in gedeeltelijke wormen in de montage (d.w.z. wormen die kop van staarteinden missen) en gedeeltelijke segmentatiemaskers tijdens de analyse van CellProfiler. Ook, als lijnen van twee individuele wormen kruisen, zullen de wormen niet correct worden verwerkt in de worm uitlijning montage evenals voor fluorescentie kwantificering. Voor kwaliteitscontrole wordt een overlayafbeelding van de lijnselecties op de oorspronkelijke afbeelding opgeslagen in de gegevensmap, samen met een QC-tabel. Van deze, problematische lijnen die zullen leiden tot onjuist gesegmenteerde wormen kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd en uitgesloten van montage en / of latere analyse.

Hoewel de directe input van de experimentator in de selectie van wormen misschien een beetje tijdrovend lijkt, presenteert het een duidelijk voordeel van de workflow ten opzichte van anderen in experimenten waar wormen uit verschillende ontwikkelingsstadia aanwezig zijn in hetzelfde beeld: Wormen kunnen worden geselecteerd tijdens de "traceringsstap", door alleen die wormen te schetsen die zich in de juiste ontwikkelingsfase bevinden. Als alternatief kunnen wormen worden gefilterd met behulp van de uitvoer van Worm_CP op basis van de lengte van de traceringslijn, of het gebied van het segmentatiemasker, beide betrouwbare indicatoren van de lengte/grootte van de wormen. Ongetwijfeld, machine-learning algoritmen kunnen moeite hebben om wormen te herkennen uit verschillende ontwikkelingsstadia, als hun grootte en uiterlijk in de DIC-beelden is zo verschillend.

De output van Worm-align kan worden gebruikt voor latere kwantificering van fluorescentie intensiteit in enkele wormen, hetzij in FIJI direct, of in andere beeldanalyse software platforms. We hebben dit aangetoond door de Worm-align output te importeren in een eenvoudige CellProfiler-pijplijn (Worm_CP), die de kwantificering van multi-channel fluorescentieintensiteit mogelijk maakt in die individuele wormen die zijn geselecteerd tijdens het uitvoeren van de Worm-align-pijplijn. We kozen voor deze aanpak vanwege de flexibiliteit van de CellProfiler-software: Het is eenvoudig om extra modules in de pijplijn op te nemen om extra functies in individuele wormen te analyseren (bijvoorbeeld het meten van de grootte van lipidedruppels, of stresskorrels, kernen, mitochondriën). Bovendien kunnen de enkele wormmaskers mogelijk worden gebruikt om een nieuw model voor WormToolbox⁷te trainen.

De belangrijkste voordelen van deze methode zijn dat het snel is en vereist een eenvoudige worm montage set-up. Deze methode is sneller omdat het geen tijd nodig heeft om software te leren werken of trainingssets uit te voeren via een machinealgoritme^7. Bovendien werkt deze methode met levende of vaste wormen die eenvoudig op gewone agarosepads zijn gemonteerd. Het is niet nodig om complexe microfluïde kamers te gebruiken, zoals ontwikkeld in andere methoden^5,6.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Agarose	MeLford Biolaboratories Ltd	MB1200
Aspiratiebuis	Sigma-Aldrich	A5177	om een micropipet voor de mond te maken (zie protocol stap)
Beker
BODIPY 493/593	Invitrogen	D3922	voorraadoplossing bereid in DMSO op 1 mg/mL
Centrifuge	MSE MISTRAL 1000
Konische kolf
Dekglas	VWR	631-0120
Filter 0,2 µm voor spuit	Sartrius	16534-K	Filter, om een micropipet voor de mond te maken (zie protocol stap)
Isopropanol
Levamisolhydrochloride	Sigma-Aldrich	BP212	3 mM oplossing bereid door levamisol op te lossen in M9
Vloeibare stikstof			Vloeibare stikstofvoorziening
Tip met lage retentie 1000µL	Starlab	S1182-1830
Methanol	VWR chemicals	20847.307
Microscoopglazen, MENZEL GLASSER	Thermo Scientific	BS7011/2
Microscoop	Nikon		Eclipse Ti
Microgolfoven	Delongi
M9			bereid in het lab volgens15
9 cm NGM-platen			bereid in het lab volgens15
PBS			bereid in het lab
Protein LoBind buis 2 ml	Eppendorf	22431102
Triton	SIGMA	T9284-500ML
Ringdoppen	SIGMA-ALDRICH	Z611247-250EA	glas microcapillaire buisjes om een micropipet voor de mond te maken (zie protocol stap)
Rotator	Stuart Scientific
Siliconen buisje doorschijnend	Scientific Laboratory Suppliers	TSR0600200P	6,0 mm x 2,0 mm wand - om een micropipet voor de mond te maken (zie protocol stap)
Gesteriliseerd H2O			MilliQ-water geautoclaveerd in het lab
10µL tips	Starlab	S1120-3810
200µL tips	Starlab	S1120-8810
1000µL tips	Starlab	S1122-1830
15 mL centrifugebuis	CORNING	430791
Vecta Shield	VECTOR	94010	antifade montagemedium (H-1000) zonder DAPI