Methodenartikel

3D-deeltjestracking voor niet-invasieve in vivo analyse van synaptische microtubuli-dynamiek in dendrieten en neuromusculaire juncties van Drosophila

DOI:

10.3791/61159

⸱

12 mei 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Blavatnik Institute of Cell Biology and Program in Neuroscience, Harvard Medical School, 2DRVision Technologies LLC

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie presenteert een niet-invasieve intravitale neuronale beeldvormingsstrategie in combinatie met een nieuwe softwarestrategie om geautomatiseerde, onbevooroordeelde tracking en analyse van in vivo microtubuli (MT) plus-end dynamiek in de sensorische dendrieten en de neuromusculaire juncties van Drosophila te bereiken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microtubuli (MT's) spelen een cruciale rol in de ontwikkeling van neuronen, maar er blijven veel vragen over de moleculaire mechanismen van hun regulatie en functie. Bovendien is er, ondanks de vooruitgang in het begrijpen van postsynaptische MT's, veel minder bekend over de bijdragen van presynaptische MT's aan neuronale morfogenese. In het bijzonder leverden studies van in vivo MT-dynamiek in Drosophila sensorische dendrieten significante inzichten op in het gedrag op polymeerniveau. De technische en analytische uitdagingen die gepaard gaan met live beeldvorming van de neuromusculaire overgang van de vlieg (NMJ) hebben echter beperkte vergelijkbare studies naar presynaptische MT-dynamiek. Bovendien, hoewel er veel zeer effectieve softwarestrategieën zijn voor geautomatiseerde analyse van MT-dynamiek in vitro en ex vivo, vereisen in vivo gegevens vaak aanzienlijke input van de operator of volledig handmatige analyse vanwege de inherent inferieure signaal-ruisverhouding in beelden en complexe cellulaire morfologie.  Om dit aan te pakken, optimaliseerde deze studie een nieuw softwareplatform voor geautomatiseerde en onbevooroordeelde in vivo deeltjesdetectie. Multiparametrische analyse van live time-lapse confocale beelden van EB1-GFP gelabelde MT's werd uitgevoerd in zowel dendrieten als de NMJ van Drosophila-larven en vond opvallende verschillen in MT-gedrag. MT-dynamiek werd verder geanalyseerd na knockdown van het MT-geassocieerde eiwit (MAP) dTACC, een belangrijke regulator van de ontwikkeling van de Drosophila-synaps, en identificeerde statistisch significante veranderingen in MT-dynamiek in vergelijking met wildtype. Deze resultaten tonen aan dat deze nieuwe strategie voor de geautomatiseerde multiparametrische analyse van zowel pre- als postsynaptische MT-dynamica op polymeerniveau de human-in-the-loop-criteria aanzienlijk vermindert. De studie toont bovendien het nut van deze methode aan bij het detecteren van verschillende MT-gedragingen bij dTACC-knockdown, wat wijst op een mogelijke toekomstige toepassing voor functionele schermen van factoren die MT-dynamiek in vivo reguleren. Toekomstige toepassingen van deze methode kunnen zich ook richten op het ophelderen van celtype en/of compartimentspecifiek MT-gedrag, en meerkleurige correlatieve beeldvorming van EB1-GFP met andere cellulaire en subcellulaire markers die van belang zijn.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cellen organiseren zich om functionele structuren te vormen door de coördinatie van intra- en intercellulaire veranderingen via morfogenese. Een opmerkelijk voorbeeld van morfogenese is de ontwikkeling van de zeer gespecialiseerde neuronale structuur. Neuronen vertonen een opmerkelijke polarisatie, waarbij ze twee structureel en functioneel verschillende soorten processen uitbreiden, dendrieten en axonen1, die enorme lengtes kunnen bereiken. De complexiteit van de neuronale ontwikkeling komt niet alleen voort uit de enorme omvang van dendrieten en axonen, maar ook uit de moeilijkheid om hun ingewikkeld vertakte geometrieën te vormen 2,3. Neuronale morfogenese en de gevolgen ervan voor leren en geheugen4 motiveren het voortdurende onderzoek naar zowel de genetische controle als de onderliggende celbiologische mechanismen. Dergelijke mechanismen omvatten, maar zijn niet beperkt tot, intracellulair membraantransport en de vele cytoskeletale herschikkingen die nodig zijn voor veranderingen in neuronale morfologie 1,2,3.

Studies naar neuronale morfogenese hebben een verscheidenheid aan geavanceerde visualisatietechnieken opgeleverd. Statische methoden, zoals elektronenmicroscopie of fluorescentiemicroscopie van vaste sondes, worden veel gebruikt om morfologische en structurele analyses met hoge resolutie uit te voeren. Echter, afgezien van de artefacten die onvermijdelijk zijn voor elke conserveringsmethode, kan statische visualisatie de dynamische veranderingen die ten grondslag liggen aan morfogenese niet vastleggen. Veel cruciale inzichten zijn dus voortgekomen uit time-lapse fluorescentiemicroscopie van levende weefsels. Vroeg werk van Lichtman en collega's 5,6,7 maakte gebruik van in vivo beeldvorming van het zenuwstelsel van zoogdieren om axonregeneratie/degeneratie, organisatie van synaptische componenten en axonaal transport over lange afstanden te onderzoeken. Bovendien waren baanbrekende studies in primaire neuronale explantaten van cruciaal belang voor het vaststellen van het belang van de dynamiek van microtubuli (MT) voor axonale rek en motiliteit 8,9. Cruciaal is dat vroege neuronale explantatiestudies het gebruik van fluorescerend gelabelde end-binding familie-eiwitten (EB's) hebben aangetoond om onschatbare inzichten te verkrijgen in de MT plus-end dynamiek bij het ontwikkelen van neuronen op het niveau van individuele MT-polymeren10. Deze studies kwamen voort uit observaties dat het EB-familielid EB1 bij voorkeur lokaliseert naar MT plus uiteinden11 in S. cerevisiae12 en in gekweekte cellen13. Sindsdien zijn EB1 en andere plus tip tracking eiwitten (+TIPs)14,15 op grote schaal gebruikt in in vivo studies naar MT dynamische instabiliteit16, ook in de context van neuronale ontwikkeling17.

Drosophila is een krachtig model voor in vivo beeldvormingsstudies van MT-dynamiek tijdens neuronale ontwikkeling vanwege de enorme genetische en beeldvormingsinstrumenten die beschikbaar zijn voor vliegenstudies18,19 en de overeenkomsten in structuur en functie tussen Drosophila en neuronen van gewervelde dieren1. Een belangrijke vroege studie van de neuromusculaire overgang (NMJ) van Drosophila-larven voerde herhaalde niet-invasieve beeldvorming uit van een fluorescerende membraanmarker door de doorschijnende cuticula van intacte dieren om presynaptische terminale morfogenese20 te documenteren. Met behulp van een vergelijkbare methode om hele, levende Drosophila-larven in beeld te brengen, werd een eerste demonstratie gegeven van subcellulaire analyse op deeltjesniveau van processieve beweging van motorladingen in de axonen21. Meer recentelijk hebben nauwgezette studies door Rolls en collega's in de sensorische dendrieten van intacte Drosophila-larven 22,23,24,25,26,27 de postsynaptische MT plus-end dynamiek gekarakteriseerd door het volgen van deeltjes en analyse van groen fluorescerend eiwit (GFP)-gelabeld EB1. Dergelijke studies in Drosophila 22,23,24,25,26,27 en andere systemen 28,29,30,31,32 hebben een aanzienlijk beter begrip van het gedrag van MT met één polymeer plus eindigt in de dendrieten van zich ontwikkelende neuronen 33.

Ondanks de indrukwekkende in vivo studies van postsynaptische MT-dynamica 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31, zijn er veel minder vergelijkbare studies geweest van presynaptische MT-dynamica aan de zich ontwikkelende axonterminal. MT-dynamiek in de Drosophila-larvale NMJ is bestudeerd met behulp van fluorescerende spikkelmicroscopie (FSM) en fluorescentieherstel na fotobleken (FRAP)34. Deze technieken evalueren de algehele tubulinekinetiek, maar niet het gedrag van individuele MT plus-uiteinden. Op het moment van schrijven is er één enkel onderzoek gedaan naar individuele MT plus-uiteinden bij de Drosophila NMJ: deze studie combineerde live time-lapse-beeldvorming met handmatige analyse van kymografen om een populatie van dynamische, EB1-GFP gelabelde "baanbrekende MT's" te karakteriseren die zich onderscheidden van een bredere populatie van gestabiliseerde MT's35. Dit gebrek aan onderzoek naar presynaptische MT-dynamiek kan op zijn minst gedeeltelijk te wijten zijn aan anatomie: hoewel het relatief eenvoudig is om beelden van dendrieten te verkrijgen vanwege hun nabijheid tot de nagelriem van de larven, worden NMJ's belemmerd door andere weefsels, waardoor het een uitdaging is om beelden te verkrijgen met voldoende signaal-ruisverhouding voor analyse op deeltjesniveau. Desalniettemin, gezien het gevestigde belang van de presynaptische MT's voor synaptische morfogenese en stabilisatie36, evenals hun verbanden met neurologische ontwikkelings- en neurodegeneratieve aandoeningen37, zal het overbruggen van deze kloof tussen begrip van pre- en postsynaptische MT's waarschijnlijk onschatbare inzichten opleveren.

Een extra uitdaging voor de analyse van in vivo MT-dynamiek in het algemeen, in tegenstelling tot in vitro of ex vivo analyse, zijn de beperkte geautomatiseerde softwaretools die dynamische parameters uit in vivo gegevens kunnen extraheren. Momenteel is een van de meest populaire en krachtige technieken voor analyse van +TIP-gelabelde MT plus-uiteinden plusTipTracker38,39, een op MATLAB gebaseerde software die het geautomatiseerd volgen en analyseren van meerdere dynamische parameters mogelijk maakt. Met name meet plusTipTracker niet alleen MT-groei, maar ook krimp en reddingen: terwijl +TIP-labels zoals EB1-GFP alleen worden geassocieerd met groeiende plus-uiteinden, kan plusTipTracker algoritmisch krimppercentages en reddingsgebeurtenissen afleiden. Hoewel plusTripTracker zeer succesvol is toegepast in vele contexten, waaronder eerdere multiparametrische analyse van ex vivo MT-dynamiek in Drosophila S2-cellen40, is plusTipTracker niet optimaal voor analyse van in vivo gegevens, gezien hun lagere signaal-ruisverhouding. Als gevolg hiervan zijn in vivo studies van plus-end dynamica bij dendrieten 22,23,24,25,26,27 en bij de NMJ 35 van Drosophila gebaseerd op het handmatig genereren en analyseren van kymografen met behulp van software zoals ImageJ41, of op semi-geautomatiseerde strategieën waarbij tal van human-in-the-loop-componenten betrokken zijn.

Deze studie presenteert een experimentele en analytische workflow die de experimentele en analytische overhead vermindert die nodig is om niet-invasieve analyse op polymeerniveau uit te voeren van presynaptische MT-dynamiek in zowel sensorische dendrieten als de motoraxonterminal van Drosophila third-instar larven. Het protocol maakt gebruik van geïmmobiliseerde, intacte larven en vermijdt daarom verwondingen waarvan bekend is dat ze stressreacties veroorzaken, evenals andere niet-fysiologische aandoeningen die in vivo de MT-dynamiek kunnen verstoren. Om dynamische MT-plus-ends te labelen, wordt EB1-GFP pan-neuronaal tot expressie gebracht met behulp van het Gal4/UAS-systeem 42, waardoor visualisatie van MT's op zowel dendrieten als NMJ mogelijk is met een enkele driver. Hoewel sommige vroege stappen onvermijdelijk onderhevig zijn aan menselijke besluitvorming, zoals de selectie van dierspecimens en de identificatie van regio's die in beeld moeten worden gebracht, zijn de stappen na het verzamelen van gegevens grotendeels geautomatiseerd. Cruciaal was dat optimalisatie van nieuwe software geautomatiseerde, onbevooroordeelde analyse mogelijk maakte die minimale menselijke input vereiste. Hoewel er andere methoden voor het volgen van deeltjes beschikbaar zijn 43,44,45, maakt deze studie gebruik van eigen software omdat deze algoritmisch zeer geschikt was om de specifieke uitdagingen van deze specifieke dataset aan te pakken. De software is nu beschikbaar voor gebruikers voor een verscheidenheid aan toepassingen. Met name het gebruik van coherentiebevorderende diffusiefiltering46 is een integraal onderdeel van geautomatiseerde segmentatie en verwijdering op de achtergrond, en aangepaste algoritmen worden specifiek geïmplementeerd om deeltjesdetectie en -tracking te automatiseren. Deze strategie zou effectief kunnen omgaan met de lage signaal-ruisverhouding die inherent is aan de gegevens in deze studie, evenals andere uitdagingen, zoals de beweging van EB1-GFP-kometen door verschillende brandvlakken. Hoewel het niet haalbaar is om de prestaties van deze software uitputtend te testen ten opzichte van alle andere software voor deeltjesanalyse, evenaarden of benaderden de prestaties van de huidige strategie de standaard menselijke prestaties. Bovendien is er, voor zover de auteurs weten, geen andere software die specifiek is getraind op in vivo gegevens van sensorische dendrieten en de presynaptische terminal. Gezien het feit dat de prestaties van beeldanalyse-algoritmen vaak zeer specifiek zijn voor de gegevens waarvoor ze zijn ontworpen en dat gegeneraliseerde computervisie nog niet mogelijk is, wordt verwacht dat het trainen van de beschreven software op de specifieke in vivo gegevens die van belang zijn, de meest algoritmisch verantwoorde benadering is.

Gezien het uitgebreide werk aan dendritische MT's 22,23,24,25,26,27 en de consistente kwaliteit van de gegevens die uit dit systeem kunnen worden verkregen, werd de strategie voor beeldacquisitie en software-analyse voor het eerst gevalideerd in Drosophila sensorische dendrieten. Belangrijk is dat bij dendrieten werd gevonden dat het gebruik van verschillende neuronale Gal4-drivers, zelfs in verder identieke wildtype-achtergronden, resulteert in significante verschillen in EB1-GFP-dynamiek als gevolg van verschillen in genetische achtergrond, wat het belang benadrukt van het gebruik van een enkele Gal4-driver voor consistente resultaten. Deze strategie werd vervolgens gebruikt voor multiparametrische analyse van EB1-GFP-dynamiek aan de presynaptische terminal van de NMJ. Om de onderzoekswaarde van deze methode verder te illustreren, werd deze beeldvormings- en softwarestrategie gebruikt om zowel de pre- als de postsynaptische EB1-GFP-dynamiek te beoordelen na het uitschakelen van dTACC, de Drosophila-homoloog van de sterk geconserveerde TACC (transforming acidic coiled coil) familie47,48. Eerder werk in Drosophila S2-cellen40, evenals werk van Lowery en collega's in de Xenopus-groeikegel 49,50,51, heeft aangetoond dat TACC-familieleden de MT plus-end dynamiek reguleren. Bovendien toonde recent gerapporteerd bewijs van confocale en superresolutie-immunofluorescentiebeeldvorming aan dat dTACC een belangrijke regulator is van presynaptische MT's tijdens neuronale morfogenese52, wat de vraag oproept of dTACC de live MT-dynamiek reguleert. Dit rapport demonstreert een methode die inderdaad verschillen in live MT-gedrag kan detecteren bij dTACC knockdown. Deze studie presenteert dus een in vivo methode die de belangrijkste regulatoren van MT-dynamiek in het zich ontwikkelende neuron effectief kan identificeren en karakteriseren, met name in het presynaptische compartiment.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Generatie van Drosophila-exemplaren

  1. Kies een geschikte MT plus-end marker. Deze studie maakte gebruik van GFP-gelabelde EB1, een goed gekarakteriseerde plus-end marker met een sterk, duidelijk signaal11,12. Alternatieven zijn onder meer andere +TIP's zoals EB310,13, CLASP/Orbit53 en CLIP-17054.
  2. Verkrijg of genereer vliegen met de MT-marker onder controle van een UAS-promotor (bijv. UAS-EB1-GFP).
  3. Kies de juiste weefselspecifieke Gal4-driver. Deze studie gebruikte de pan-neuronale driver elaV-Gal458,59 om expressie te stimuleren in zowel sensorische dendrieten als bij de NMJ en 221-Gal460,61 voor dendrietspecifieke expressie.
  4. Kweek vliegen op met behulp van standaard vliegenhouderijtechnieken55,56. Het wordt aanbevolen om vliegen in bevochtigde broedmachines bij 25 °C te houden voor een optimale Gal4/UAS-expressie.
  5. Voer met behulp van standaard genetische vliegtechnieken55,56 kruisingen uit om vliegen te genereren om de MT plus-end marker in de gewenste cellen/weefsels tot expressie te brengen.
    OPMERKING: Voor elke combinatie van Gal4-driver en -transgen moet het experimentele ontwerp proof-of-concept- en validatie-experimenten bevatten om het systeem te karakteriseren en artefacten van overexpressie te voorkomen.

2. Installatie van de apparatuur

  1. Zet een werkstation op, inclusief de vliegen, anesthesiereagentia, bouwmaterialen voor dia's, stereomicroscoop en verlichtingsbron, dicht bij de confocale microscoop (dwz in dezelfde kamer) om de tijd die wordt besteed tussen de voorbereiding van het monster en de beeldvorming te minimaliseren om de gezondheid en levensvatbaarheid van de larven te verlengen.
  2. Bereid de verdoving voor door een mengsel van 9% chloroform (0,1 ml chloroform en 1,0 ml halogeenkoolwaterstofolie) te mengen in een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Om scheiding te voorkomen, mengt u goed door de buis om te keren voordat u elk nieuw glaasje voorbereidt.
  3. Bereid de glasplaat voor: Knip vier stroken dubbelzijdig plakband (~15 mm breed). Lijn twee van de stukken op de glasplaat uit en laat een ruimte van ~5 mm tussen de stroken. Leg de resterende twee stukken op de eerste twee om de dikte van de tape te verdubbelen (Figuur 1C).
  4. Voeg een grote druppel (~100 μL) chloroform/oliemengsel toe op het glasplaatje in de ruimte van 5 mm tussen de tapestukken (Figuur 1C).

3. Voorbereiding van larvale monsters voor beeldvorming

  1. Vul een container (bijv. een plaat met 6 putjes) met 1x PBS.
  2. Verzamel 3e instar-larven uit de vliegenflacon met behulp van een tang of een soortgelijk instrument. Identificeer larven in het juiste stadium aan hun kruipgedrag en aan de aanwezigheid van 9-12 prominente, gekartelde mondhaken. Gebruik een stereomicroscoop om te helpen bij het stadiëren van larven (Figuur 1D).
  3. Plaats een larve in de PBS en beweeg deze voorzichtig om eventuele voedselresten of ander vuil weg te spoelen. Droog de larve voorzichtig af op een delicate tissue.
  4. Verdoof de larve door deze in chloroform/oliedruppel op het objectglaasje uit sectie 2 te plaatsen (Figuur 1C).
    OPMERKING: De dorsale/ventrale oriëntatie van de larve is niet kritisch, omdat zowel sensorische als motorneuronen kunnen worden gedetecteerd door de doorschijnende cuticula door de microscooptafel op het juiste brandpuntsvlak in te stellen, ongeacht de oriëntatie van het preparaat.
  5. Leg er een #1.5 dekglaasje op. Plak het dekglaasje op de tape door lichte druk uit te oefenen, waardoor de larve wordt geïmmobiliseerd zonder deze te beschadigen (Figuur 1C).
  6. Sluit de kamer af met vaseline of nagellak.

4. Time-lapse confocale beeldvorming van live samples

  1. Bereid de confocale microscoop en de 60x objectieflens voor met olie-onderdompeling. Plaats het monster op de tafel (Figuur 1A,B).
  2. Gebruik de acquisitiesoftware om experimenten te configureren.
    OPMERKING: Voor deze studie werd elke beeldvormingsreeks verkregen op een enkel brandvlak in plaats van een z-stack.
    1. Stel de time-lapse-duur in op 30 s met een interval van 2 s, voor een totaal van 16 frames.
    2. Stel de laserbelichting en -intensiteit in om voldoende signaal te garanderen en tegelijkertijd verzadiging en fotobleken te vermijden.
    3. Voor EB1-GFP-beeldvorming werd de 488 nm-laser ingesteld op een belichtingstijd van 100 ms en een intensiteit van 30%. Deze waarden kunnen variëren voor verschillende toepassingen van dit protocol en moeten empirisch worden gewijzigd.
  3. Gebruik de oculairs van de microscoop om de larve te vinden in breedveldgroene verlichting. Vind de dendrieten of NMJ's door de trap langzaam aan te passen. Stel larven niet langer dan nodig bloot aan verlichting (breedveld of confocaal).
    1. Dendrieten verschijnen als dunne heldergroene webben van zenuwen die gemakkelijk te onderscheiden zijn van dikke lange axonbundels (Figuur 1E).
    2. NMJ's verschijnen als groepen heldergroene individuele boutonen met een diameter van ongeveer 5 μm, aan de uiteinden van dikke lange axonbundels die afwijken van het zenuwkoord (Figuur 1F).
  4. Gebruik de live camerafeed om snel scherp te stellen op het interessegebied met behulp van 488 nm verlichting. Stop onmiddellijk met verlichten zodra de juiste focus is gevonden om fototoxiciteit te voorkomen.
  5. Initieer beeldacquisitie. EB1-kometen zijn herkenbaar als heldere, beweeglijke punctae.
  6. Raadpleeg eerder gepubliceerde protocollen voor aanvullende details en richtlijnen over fluorescentie live beeldvorming57.

5. Softwarematige beeldverwerking en -analyse

  1. Analyseer elk videobestand afzonderlijk. Selecteer in de software (gebruikersinterface weergegeven in afbeelding 2) de optie Bestand | Invoer | Afbeeldingsreeks en sleep TIF-bestanden in het vak dat verschijnt. Bekijk een voorbeeld van de video.
  2. Stem in het menu Detectieparameters de softwareparameters af om ervoor te zorgen dat alleen duidelijk zichtbare punctae worden gedetecteerd en om detectie van valse objecten te voorkomen. Het verminderen van de deeltjesintensiteit resulteert bijvoorbeeld in een grotere gevoeligheid van software voor punctae, maar verhoogt de potentiële valse positieven. De precieze waarden van de parameters zullen empirisch variëren. Beschrijvingen van de detectie- en volgparameters zijn op aanvraag verkrijgbaar bij de auteurs.
  3. Pas het Neuron Particle Tracking-recept toe om de afbeelding te analyseren met behulp van de knop Vanaf het begin (blauwe pijl, Figuur 2B). De software voert resultaten voor de trackingparameters die worden vermeld in tabel 1 uit naar de resultatenspreadsheet (groen vak, afbeelding 2B). Om latere analyse en interpretatie te vergemakkelijken, kunnen de resultaten worden opgeslagen in spreadsheetsoftware met behulp van de exportfunctie in de sectie Resultatenspreadsheet .
  4. Navigeer met de cursor naar puncta die in de vorige stap is gedetecteerd en klik met de linkermuisknop om te selecteren of te deselecteren. Meerdere puncta kunnen tegelijkertijd worden geselecteerd met Ctrl + linksklikken.
    OPMERKING: Afhankelijk van de doelstellingen en toepassingen van het project kunnen aanvullende heuristieken worden gebruikt om de punctae te filteren. Punctae met een levensduur van minder dan 8-10 s (4-5 frames) kunnen bijvoorbeeld worden weggelaten omdat ze niet voldoende informatie geven over de gehele groeigebeurtenis. De behoefte aan dergelijke heuristieken zal empirisch variëren. Aanvullende details over de softwarefunctionaliteit zijn op verzoek verkrijgbaar bij de auteurs.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vliegen werden gekweekt uit stabiele voorraden die het UAS-EB1-GFP-transgen constitutief tot expressie brengen, hetzij pan-neuronaal (elaV-Gal4; UAS-EB1-GFP)58,59 of in sensorische neuronen (221-Gal4; UAS-EB1-GFP)60,61. EB1 werd gekozen voor deze studie omdat het specifiek lokaliseert naar groeiende uiteinden en onmiddellijk dissocieert bij pauze en krim...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel bespreekt een protocol voor het uitvoeren van niet-invasieve intravitale beeldvorming van MT-dynamiek in de dendrieten en bij de NMJ tijdens de ontwikkeling. Menselijke inbreng is vereist tijdens de experimentele stappen, zoals bij het selecteren van dieren om in beeld te brengen, en kan leiden tot vertekening in het gegevensverzamelingsproces die redelijkerwijs niet kan worden verwijderd. Een belangrijk doel van het protocol is dus om vooringenomenheid waar mogelijk te minim...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs Hoyin Lai, Michael Jones, Hideki Sasaki, Luciano A.G. Lucas, Sam Alworth (voorheen) en James Shih-Jong Lee zijn werknemers van DRVision Technologies LLC, dat de software produceert die in dit protocol wordt gebruikt.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken onze collega's in het Van Vactor-lab en bij DRVision, naast Drs. Max Heiman, Pascal Kaeser, David Pellman en Thomas Schwarz voor de nuttige discussie. We danken Dr. Melissa Rolls voor het genereus verstrekken van de elaV-Gal4; UAS-EB1-GFP; UAS-Dcr2 en 221-Gal4; UAS-EB1-GFP-aandelen die in deze studie zijn gebruikt. We danken Drs. Jennifer Waters en Anna Jost van het Nikon Imaging Center aan Harvard voor hun expertise op het gebied van lichtmicroscopie. Dit werk wordt gefinancierd door de National Institutes of Health (F31 NS101756-03 tot V.T.C., SBIR 1R43MH100780-01D tot J.S.L.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 mL microcentrifuge tubeEppendorf21008-959Sample preparation
1000 µL TipOne pipette tipsUSA Scientific1111-2721Sample preparation
200 µL TipOne pipette tipsUSA Scientific1120-8710Sample preparation
221-Gal4 fliesBloomington Drosophila Stock Center (US)26259Drosophila genetics/crosses
60x Objective LensNikonPlan Apo 60x OilImage acquisition
6-well plateBD Falcon353224Sample preparation
AgarMoorAgar41084Drosophila food
AiviaDRVision LLCOptimized as part of this study
Chloroform (stabilized with amylenes)Sigma-AldrichC2432Sample preparation
CO2 blowgun (for selection of flies for crosses)Genesee54-104Drosophila genetics/crosses
CO2 bubbler (for selection of flies for crosses)Genesee59-180Drosophila genetics/crosses
Cooled CCD cameraHamamatsuORCA-R2Image acquisition
CornmealGenesee62-101Drosophila food
Distilled WaterDrosophila food
Double-sided tapeScotchSample preparation
Drosophila vialsGenesee32-109Drosophila food
Droso-plugs (foam plugs for vials)Genesee59-200Drosophila food
Dumont #5 Biologie Inox ForcepsFine Science Tools11252-20Sample preparation
elaV-Gal4;UAS-EB1-GFP;UAS-Dcr2 fliesGift of Melissa Rolls (Penn State University)N/ADrosophila genetics/crosses
Ethanol (95%)VWR75811-022Drosophila food
Fiber optic illuminator/light source for stereomicroscopeNikonNI-150Sample preparation
Flypad (for selection of flies for crosses)Genesee59-172Drosophila genetics/crosses
Forma Environmental Chamber/IncubatorThermoFisher3940Drosophila genetics/crosses
Halocarbon oil 700Sigma-AldrichH8898Sample preparation
Immersion OilNikonMXA22168Image acquisition
Kimwipe Delicate WipesFisher Scientific34120Sample preparation
Laser Merge ModuleSpectral Applied ResearchLMM-5Image acquisition
Light Source for ConfocalLumencorSOLA 54-10021Image acquisition
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis SoftwareMolecular DevicesImage acquisition
Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2 (#1.5)VWR48366-205Sample preparation
Motorized inverted microscope with Perfect Focus SystemNikonTI-ND6-PFS-SImage acquisition
Motorized stage and shuttersPriorProscan IIIImage acquisition
Multi-purpose scissorsScotchMMM1428Sample preparation
Nail PolishSally Hansen784179032016 074170382839Sample preparation
Optical FilterChromaET480/40mImage acquisition
P1000 PipetmanGilsonF123602Sample preparation
P200 PipetmanGilsonF123601Sample preparation
PBS (10X) ph 7.4ThermoFisher70011044Sample preparation
Propionic AcidFisherA258-500Drosophila food
Spinning disk confocal scanner unitYokagawaCSU-X1Image acquisition
StereomicroscopeNikonSMZ800NSample preparation
Sugar (Sucrose)Genesee62-112Drosophila food
Superfrost SlideVWR48311-600Sample preparation
TegoseptGenesee20-258Drosophila food
UAS-dtacc-RNAi fliesVienna Drosophila Resource Center (Vienna, Austria)VDRC-101439Drosophila genetics/crosses
Vaseline petroleum jellyWB MasonDVOCB311003Sample preparation
Winsor & Newton Brush Regency Gold 520, Size 0Staples5012000Drosophila genetics/crosses
YeastVWRTorula Yeast IC90308580Drosophila food
Yokogawa dichroic beamsplitterSemrockDi01-T405/488/568/647-13x15x0.5Image acquisition

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rolls, M. M. Neuronal polarity in Drosophila: Sorting out axons and dendrites. Developmental Neurobiology. 71 (6), 419-429 (2011).
  2. Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: Mechanisms of dendritic arborization. Nature Reviews Neuroscience. 11 (5), 316-328 (2010).
  3. Lewis, T. L., Courchet, J., Polleux, F. Cell biology in neuroscience: Cellular and molecular mechanisms underlying axon formation, growth, and branching. Journal of Cell Biology. 202 (6), 837-848 (2013).
  4. Kandel, E. R. The Molecular Biology of Memory Storage: A Dialogue Between Genes and Synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
  5. Turney, S. G., Lichtman, J. W. Chapter 11: Imaging Fluorescent Mice In Vivo Using Confocal Microscopy. Methods in Cell Biology. 89 (8), 309-327 (2008).
  6. McCann, C. M., Lichtman, J. W. In vivo imaging of presynaptic terminals and postsynaptic sites in the mouse submandibular ganglion. Developmental Neurobiology. 68 (6), 760-770 (2008).
  7. Turney, S. G., Walsh, M. K., Lichtman, J. W. In vivo imaging of the developing neuromuscular junction in neonatal mice. Cold Spring Harbor Protocols. 7 (11), 1166-1176 (2012).
  8. Tanaka, E., Ho, T., Kirschner, M. W. The role of microtubule dynamics in growth cone motility and axonal growth. Journal of Cell Biology. 128 (1-2), 139-155 (1995).
  9. Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation. Journal of Cell Biology. 115 (2), 345-363 (1991).
  10. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  11. Tirnauer, J. S., Bierer, B. E. EB1 proteins regulate microtubule dynamics, cell polarity, and chromosome stability. Journal of Cell Biology. 149 (4), 761-766 (2000).
  12. Schwartz, K., Richards, K., Botstein, D. BIM1 encodes a microtubule-binding protein in yeast. Molecular Biology of the Cell. 8 (12), 2677-2691 (1997).
  13. Juwana, J. P., et al. EB/RP gene family encodes tubulin binding proteins. International Journal of Cancer. 81 (2), 275-284 (1999).
  14. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (4), 309-322 (2008).
  15. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Control of microtubule organization and dynamics: Two ends in the limelight. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (12), 711-726 (2015).
  16. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic Instability of microtubule growth. Nature. 312 (15), 237-242 (1984).
  17. Van De Willige, D., Hoogenraad, C. C., Akhmanova, A. Microtubule plus-end tracking proteins in neuronal development. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (10), 2053-2077 (2016).
  18. Rebollo, E., Karkali, K., Mangione, F., Martín-Blanco, E. Live imaging in Drosophila: The optical and genetic toolkits. Methods. 68 (1), 48-59 (2014).
  19. Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nature Reviews Genetics. 6 (1), 9-23 (2005).
  20. Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila. Neuron. 22 (4), 719-729 (1999).
  21. Miller, K. E., et al. Direct observation demonstrates that Liprin-alpha is required for trafficking of synaptic vesicles. Current Biology. 15 (7), 684-689 (2005).
  22. Rao, K., et al. Spastin, atlastin, and ER relocalization are involved in axon but not dendrite regeneration. Molecular Biology of the Cell. 27 (21), 3245-3256 (2016).
  23. Hill, S. E., et al. Development of dendrite polarity in Drosophila neurons. Neural Development. 7, 34(2012).
  24. Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. Global up-regulation of microtubule dynamics and polarity reversal during regeneration of an axon from a dendrite. Molecular Biology of the Cell. 21 (5), 767-777 (2010).
  25. Mattie, F. J., et al. Directed microtubule growth, +TIPs, and kinesin-2 are required for uniform microtubule polarity in dendrites. Current Biology. 20 (24), 2169-2177 (2010).
  26. Stone, M. C., Roegiers, F., Rolls, M. M. Microtubules Have Opposite Orientation in Axons and Dendrites of Drosophila Neurons. Molecular Biology of the Cell. 19 (10), 4122-4129 (2008).
  27. Rolls, M. M., et al. Polarity and intracellular compartmentalization of Drosophila neurons. Neural Development. 2, 7(2007).
  28. Hu, X., Viesselmann, C., Nam, S., Merriam, E., Dent, E. W. Activity-dependent dynamic microtubule invasion of dendritic spines. Journal of Neuroscience. 28 (49), 13094-13105 (2008).
  29. Merriam, E. B., et al. Dynamic microtubules promote synaptic NMDA receptor-dependent spine enlargement. PLoS One. 6 (11), 27688(2011).
  30. Hu, X., et al. BDNF-induced increase of PSD-95 in dendritic spines requires dynamic microtubule invasions. Journal of Neuroscience. 31 (43), 15597-15603 (2011).
  31. Merriam, E. B., et al. Synaptic regulation of microtubule dynamics in dendritic spines by calcium, F-actin, and drebrin. Journal of Neuroscience. 33 (42), 16471-16482 (2013).
  32. Jaworski, J., et al. Dynamic Microtubules Regulate Dendritic Spine Morphology and Synaptic Plasticity. Neuron. 61 (1), 85-100 (2009).
  33. Dent, E. W. Of microtubules and memory: Implications for microtubule dynamics in dendrites and spines. Molecular Biology of the Cell. 28 (1), 1-8 (2017).
  34. Yan, Y., Broadie, K. In vivo assay of presynaptic microtubule cytoskeleton dynamics in Drosophila. Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 198-205 (2007).
  35. Pawson, C., Eaton, B. A., Davis, G. W. Formin-dependent synaptic growth: evidence that Dlar signals via Diaphanous to modulate synaptic actin and dynamic pioneer microtubules. Journal of Neuroscience. 28 (44), 11111-11123 (2008).
  36. Ruiz-Cañada, C., Budnik, V. Synaptic cytoskeleton at the neuromuscular junction. International Review of Neurobiology. 75 (6), 217-236 (2006).
  37. Bodaleo, F. J., Gonzalez-Billault, C. The presynaptic microtubule cytoskeleton in physiological and pathological conditions: lessons from Drosophila Fragile X syndrome and hereditary spastic paraplegias. Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 60(2016).
  38. Applegate, K. T., et al. PlusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).
  39. Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nature Methods. 7 (9), 761-768 (2010).
  40. Long, J. B., et al. Multiparametric analysis of CLASP-interacting protein functions during interphase microtubule dynamics. Molecular and Cellular Biology. 33 (8), 1528-1545 (2013).
  41. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  42. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  43. Ma, Y., Wang, X., Liu, H., Wei, L., Xiao, L. Recent advances in optical microscopic methods for single-particle tracking in biological samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (19), 4445-4463 (2019).
  44. Shen, H., et al. Single Particle Tracking: From Theory to Biophysical Applications. Chemical Reviews. 117 (11), 7331-7376 (2017).
  45. Zwetsloot, A. J., Tut, G., Straube, A. Measuring microtubule dynamics. Essays in Biochemistry. 62 (6), 725-735 (2018).
  46. Weickert, J. Coherence-Enhancing Diffusion Filtering. International Journal of Computer Vision. 31 (2-3), 111-127 (1999).
  47. Peset, I., Vernos, I. The TACC proteins: TACC-ling microtubule dynamics and centrosome function. Trends in Cell Biology. 18 (8), 379-388 (2008).
  48. Hood, F. E., Royle, S. J. Pulling it together. Bioarchitecture. 1 (3), 105-109 (2011).
  49. Lucaj, C. M., et al. Xenopus TACC1 is a microtubule plus-end tracking protein that can regulate microtubule dynamics during embryonic development. Cytoskeleton. 72 (5), 225-234 (2015).
  50. Nwagbara, B. U., et al. TACC3 is a microtubule plus end-tracking protein that promotes axon elongation and also regulates microtubule plus end dynamics in multiple embryonic cell types. Molecular Biology of the Cell. 25 (21), 3350-3362 (2014).
  51. Rutherford, E. L., et al. Xenopus TACC2 is a microtubule plus end-tracking protein that can promote microtubule polymerization during embryonic development. Molecular Biology of the Cell. 27 (20), 3013-3020 (2016).
  52. Chou, V. T., Johnson, S., Long, J., Vounatsos, M. dTACC restricts bouton addition and regulates microtubule organization at the Drosophila neuromuscular junction. Cytoskeleton. 77 (1-2), 4-15 (2019).
  53. Maiato, H., et al. Human CLASP1 Is an Outer Kinetochore Component that Regulates Spindle Microtubule Dynamics. Cell. 113 (7), 891-904 (2003).
  54. Komarova, Y. A., Vorobjev, I. A., Borisy, G. G. Life cycle of MTs persistent growth in the cell interior , asymmetric transition frequencies and effects of the cell boundary. Journal of Cell Science. 115, Pt 17 3527-3539 (2002).
  55. Greenspan, R. J. Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).
  56. Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: A primer on the drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
  57. Waters, J. C. Live-cell fluorescence imaging. Methods in Cell Biology. 114, 125-150 (2007).
  58. Berger, C., Renner, S., Lüer, K., Technau, G. M. The commonly used marker ELAV is transiently expressed in neuroblasts and glial cells in the Drosophila embryonic CNS. Developmental Dynamics. 236 (12), 3562-3568 (2007).
  59. Robinow, S., White, K. Characterization and spatial distribution of the ELAV protein during Drosophila melanogaster development. Journal of Neurobiology. 22 (5), 443-461 (1991).
  60. Parrish, J. Z., Kim, M. D., Lily, Y. J., Yuh, N. J. Genome-wide analyses identify transcription factors required for proper morphogenesis of Drosophila sensory neuron dendrites. Genes and Development. 20 (7), 820-835 (2006).
  61. Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Different levels of the homeodomain protein cut regulate distinct dendrite branching patterns of Drosophila multidendritic neurons. Cell. 112 (6), 805-818 (2003).
  62. Zhang, T., et al. Microtubule plus-end binding protein EB1 is necessary for muscle cell differentiation, elongation and fusion. Journal of Cell Science. 122 (9), 1401-1409 (2009).
  63. Yang, C., et al. EB1 and EB3 regulate microtubule minus end organization and Golgi morphology. Journal of Cell Biology. 216 (10), 3179-3198 (2017).
  64. Allison, A., Nunn, J. Effect of general anaesthetics on microtubules. Lancet. 292 (7582), 1326-1329 (1968).
  65. Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, drosophila and zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (67), e3780(2012).
  66. Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. Journal of Visualized Experiments. (84), e50998(2014).
  67. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible neurotechnique cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (5), 451-461 (1999).
  68. Resh, M. D. Fatty acylation of proteins: New insights into membrane targeting of myristoylated and palmitoylated proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1451 (1), 1-16 (1999).
  69. Edwards, K. A., Demsky, M., Montague, R. A., Weymouth, N., Kiehart, D. P. GFP-moesin illuminates actin cytoskeleton dynamics in living tissue and demonstrates cell shape changes during morphogenesis in Drosophila. Developmental Biology. 191 (1), 103-117 (1997).
  70. Riedl, J., et al. Lifeact a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  71. Dent, E. W., Kalil, K. Axon Branching Requires Interactions between Dynamic Microtubules and Actin Filaments. Journal of Neuroscience. 21 (24), 9757-9769 (2001).
  72. Schaefer, A. W., Kabir, N., Forscher, P. Filopodia and actin arcs guide the assembly and transport of two populations of microtubules with unique dynamic parameters in neuronal growth cones. Journal of Cell Biology. 158 (1), 139-152 (2002).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Neuromusculaire junctie van DrosophilaEB1 GFP gelabelde microtubuliconfocale beeldanalysedTACC knockdowngeautomatiseerde particledetectiemultiparametrische analyselive time lapse beeldvormingpresynaptische microtubulidynamiek
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen