Hier introduceren en beschrijven we een niet-radioactieve en niet-invasieve methode om de novo-eiwitsynthese in vivo te beoordelen, waarbij gebruik wordt gemaakt van de nematode Caenorhabditis elegans en fluorescentieherstel na fotobleaching (FRAP). Deze methode kan worden gecombineerd met genetische en/of farmacologische schermen om nieuwe modulatoren van eiwitsynthese te identificeren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Beoordeling van de novo Eiwit synthese tarieven in Caenorhabditis elegans
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het handhaven van een gezond proteoom is essentieel voor cel- en organismale homeostase. Verstoring van het evenwicht tussen eiwit translationele controle en afbraak veroorzaakt een veelheid van leeftijdsgebonden ziekten. De achteruitgang van de proteostasekwaliteitscontrolemechanismen is een kenmerk van veroudering. Biochemische methoden om de novo eiwitsynthese te detecteren zijn nog steeds beperkt, hebben verschillende nadelen en kunnen niet worden uitgevoerd in levende cellen of dieren. Caenorhabditis elegans, transparant en gemakkelijk genetisch gemodificeerd, is een uitstekend model om eiwitsynthese tarieven te controleren met behulp van beeldvormende technieken. Hier introduceren en beschrijven we een methode om de novo-eiwitsynthese in vivo te meten met behulp van fluorescentieherstel na fotobleaching (FRAP). Transgene dieren die fluorescerende eiwitten uitdrukken in specifieke cellen of weefsels worden bestraald door een krachtige lichtbron die resulteert in fluorescentie fotobleaching. Op zijn beurt betekent de beoordeling van fluorescentieherstel nieuwe eiwitsynthese in cellen en/of weefsels van belang. Vandaar dat de combinatie van transgene aaltjes, genetische en/of farmacologische interventies samen met live beeldvorming van eiwitsynthesesnelheden licht kan werpen op mechanismen die leeftijdsafhankelijke proteostaseinstorten.
Inleiding
Eiwitsynthese en afbraak is essentieel voor organismale homeostase. Een veelheid van leeftijdsgebonden ziekten wordt aangespoord door gebrekkige eiwitproductie1,2. Om de wereldwijde eiwitvertalingssnelheden te meten, zijn er biochemische technieken zoals ribosomale profilering, waarbij diepe sequencing van ribosoom-beschermde mRNA-fragmenten wordt betrokken om expressie te monitoren, evenals nieuwe eiwitsynthese3. Deze methode, naast het feit dat een indirecte uitlezing van de translationele tarieven, zoals toegenomen RNA associatie met ribosomen betekent niet noodzakelijkerwijs meer ve....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: Zowel transcriptie- als translationele fusies met fluoroforen kunnen worden gebruikt om de novo-eiwitvertaling in verschillende weefsels te evalueren. Eiwitsynthese tarieven kunnen worden beoordeeld voor meerdere eiwitfamilies die gelokaliseerd in verschillende cellulaire compartimenten, met inbegrip van cytoplasma, mitochondriën en kern7. De volgende stammen worden gebruikt om wereldwijde en neuronale eiwitsynthese tarieven te controleren, N2; Ex[pife-2GFP, pRF4], ife-2(ok306); Ex[pife-2GFP, pRF4], N2; Ex[punc-119GFP, pRF4], edc-3(ok1....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Met behulp van de procedure hier gepresenteerd, wilde type en mutant transgene nematoden uitdrukken van de volgende somatische verslaggevers, pife-22GFP, psod-3GFP en punc-119GFP, werden gebruikt om eiwitsynthese tarieven te beoordelen volgens de respectieve protocollen. In het bijzonder werden wilde type- en ife-2 gemuteerde wormen die cytoplasmische GFP in hun somatische weefsels uitdrukken met behulp van de
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Eiwitsynthese modulatie is essentieel voor organismale homeostase. Tijdens de vergrijzing wordt zowel de wereldwijde als de specifieke eiwitsynthese verstoord. Recente studies tonen aan dat eiwitvertaalbalans senesescentie en veroudering direct controleert, is niet alleen een bijproduct van het verouderingsproces. In het bijzonder, kerncomponenten van de vertaalmachines zoals eukaryotische initiatiefactor 4E (eIF4E), die mRNA-aftopping tijdens de inleiding van de vertaling vergemakkelijkt, en dus de snelheid van cap-afha.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.
Dankbetuigingen
Wij danken Chaniotakis M. en Kounakis K. voor het opnemen en bewerken van video's. K.P. wordt gefinancierd met een subsidie van de Helleense Stichting voor Onderzoek en Innovatie (HFRI) en het Secretariaat-generaal voor Onderzoek en Technologie (GSRT). N.T. wordt gefinancierd door subsidies van de Europese Onderzoeksraad (ERC – GA695190 – MANNA), de kaderprogramma's van de Europese Commissie en het Griekse ministerie van Onderwijs.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| Agarose pads 2% | |||
| Calcium chloride dehydrate (CaCl2?2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholesterol | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| cycloheximide | Sigma-Aldrich | C-7698 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| edc-3(ok1427);Ex[punc-119GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Houd dieren bij 20 °C | |
| Epifluorescentiemicroscoop | Zeiss | Axio Imager Z2 | |
| Escherichia coli OP50-stam | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescentie dissecting stereomicroscoop | Zeiss | SteREO Lumar V12 | |
| Greiner Petri schotels (60 x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| ife-2(ok306);Ex[pife-2GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Houd dieren bij 20 °C | |
| Afbeeldinganalysesoftware | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| LB vloeibaar medium | |||
| M9-buffer | |||
| Magnesiumsulfaat (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microscoopglaasjes (75 x 25 x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microsoft Office 2011 Excel softwarepakket | Microsoft Corporation, Redmond, VS | ||
| N2;Ex[pife-2GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Houd dieren bij 20 °C | |
| N2;Ex[psod-3GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Houd dieren bij 20 °C | |
| N2;Ex[punc-119GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Houd dieren bij 20 °C | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Nematodengroeimedium (NGM) agarplaten | |||
| Nystatine-stamfoplossing | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Pepton | BD, Bacto | 211677 | |
| Fosfaatbuffer | |||
| Natriumchloride (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Standaardapparatuur voor het bereiden van agarplaten (autoclaaf, petrischalen, enz.) | |||
| Standaardapparatuur voor het onderhouden van wormen (platinadraad, incubators, enz.). | |||
| Statistische analysesoftware | GraphPad Software Inc., San Diego, VS | GraphPad Prism softwarepakket | |
| Streptomycine | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| UV Crosslinker | Vilber Lourmat BIO-LINK BLX 254 | ||
| Worm pick |
Referenties
- Syntichaki, P., Troulinaki, K., Tavernarakis, N. eIF4E function in somatic cells modulates ageing in Caenorhabditis elegans. Nature. 445 (7130), 922-926 (2007).
- Charmpilas, N., Daskalaki, I., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. Protein synthesis as an integral quali....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
