Een protocol om lymfestroom te blokkeren door chirurgische hechting van afferent lymfevaten wordt gepresenteerd.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Het blokkeren van lymfestroom door het hechten van Afferent Lymfatische bloedvaten in muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Lymfevaten zijn van cruciaal belang bij het handhaven van de balans van weefselvloeistof en het optimaliseren van de immuunbescherming door het vervoer van antigenen, cytokines en cellen naar drainerende lymfeklieren (LN's). Onderbreking van de lymfestroom is een belangrijke methode bij het bestuderen van de functie van lymfevaten. De afferente lymfevaten van het murine voetpad tot de popliteale lymfeklieren (pLN's) zijn goed gedefinieerd als de enige routes voor lymfedrainage in de pLN's. Het hechten van deze afferente lymfevaten kan selectief voorkomen lymfestroom naar de pLN's. Deze methode zorgt voor interferentie in de lymfestroom met minimale schade aan de lymfe-endotheelcellen in de drainerende pLN, de afferente lymfevaten, evenals andere lymfevaten rond het gebied. Deze methode is gebruikt om te bestuderen hoe lymfe hoge endotheelvenules (HEV) en chemokine expressie in de LN beïnvloedt, en hoe lymfe stroomt door het vetweefsel rond de LN bij afwezigheid van functionele lymfevaten. Met de groeiende erkenning van het belang van lymfefunctie, zal deze methode bredere toepassingen hebben om de functie van lymfevaten verder te ontrafelen bij het reguleren van de LN-micro-omgeving en immuunresponsen.
Inleiding
De ruimtelijke organisatie van het lymfestelsel biedt structurele en functionele ondersteuning om extracellulaire vloeistof efficiënt te verwijderen en antigenen en antigeen-presenterende cellen (APC's) naar de drainerende LN's te transporteren. De eerste lymfevaten (ook wel lymfekapillaries genoemd) zijn zeer doorlatend vanwege hun discontinu intercellulaire knooppunten, die de effectieve verzameling van vloeistoffen, cellen en andere materialen uit omliggende extracellulaire ruimten1vergemakkelijken. De eerste lymfevaten fuseren tot het verzamelen van lymfevaten, die strakke intercellulaire knooppunten, een continu keldermembraan en lymfespierdekking hebben. Het verzamelen van lymfevaten zijn verantwoordelijk voor het transport van verzamelde lymfe naar de drainerende LNs en uiteindelijk terug te keren lymfe naar de circulatie2,3. De verzamelende lymfevaten die lymfe in de drainerende LN voortdrijven zijn de afferente lymfevaten4,5,6,7. Obstructie van afferent lymfevaten kan de lymfestroom in de LNs blokkeren, wat een nuttige techniek is bij het bestuderen van de functie van lymfestroom.
Eerdere studies hebben aangetoond dat lymfestroom een belangrijke rol speelt bij het transport van antigenen en APC's, evenals het behoud van LN homeostase. Het is goed begrepen dat weefsel-afgeleide APC's, meestal geactiveerd migrerende dendritische cellen (DC's), reizen door de afferent lymfevaten naar de LN te activeren T-cellen8. Het idee dat antigenen in vrije vorm, zoals microben of oplosbare antigenen, passief met lymfe naar het LN stromen om LN-resident APC's te activeren, is in het afgelopen decennium 9,10,11,12. Antigenen in vrije vorm die met lymfe reizen, duren enkele minuten na de infectie om naar de LN te reizen en de LN-resident celactivering kan binnen 20 minuten na de stimulatie optreden. Dit is veel sneller dan de activering van migrerende DC's, die meer dan 8 uur duurt om de drainerende LN9in te voeren. Naast het vervoer van antigenen om immuunbescherming te starten, draagt lymfe ook cytokines en DC's naar de LN om zijn micro-omgeving te behouden en om immuuncelhomeostase13,14te ondersteunen . Eerder, het blokkeren van lymfestroom door het hechten van de afferent lymfevaten aangetoond dat lymfe nodig is om de HEV fenotype dat nodig is voor de ondersteuning van homeostatische T-cel en B-cel homing aan de LN15,16,17te handhaven . CCL21 is een kritieke chemokine die dc- en T-celpositionering in de LN8,18regisseert. Het blokkeren van lymfestroom onderbreekt CCL21-expressie in de LN en onderbreekt mogelijk dc- en T-celpositionering en/of interactie in de LN19. Zo kan het blokkeren van lymfestroom direct of indirect antigeen/DC-toegang tot de drainerende LN intrekken door de LN-micro-omgeving te verstoren die de immuunresponsen in de LN reguleert. Om de functie van lymfestroom beter te onderzoeken, wordt een experimenteel protocol gepresenteerd (Figuur 1) om de lymfestroom bij muizen te blokkeren door de affenerende lymfevaten van het voetpad naar de pLN te hechten. Deze methode kan een belangrijke techniek zijn voor toekomstige studies over lymfefunctie bij gezonde en zieke aandoeningen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Al het dierwerk moet worden goedgekeurd door de instellings- en overheidsethiek en het comité voor de behandeling van dieren. Dit is een niet-overlevingsoperatie.
1. Bereiding van materialen
- Bereid 100 mL ethanol van 70% voor door 70 mL 100% ethanol te mengen met 30 mL steriel water. Autoclave alle chirurgische instrumenten voor de operatie en houd de tools in 70% ethanol voor en tijdens de operatie om sterilisatie te handhaven.
- Bereid een injectieapparaat voor.
- Snijd ~30 cm polyethyleenbuizen (0,28 mm in diameter). Sluit de punt van een 30 G x 1/2 naald (naald A) aan op het ene uiteinde van polyethyleenbuizen. Verjagen voorzichtig nog eens 30 G x 1/2 naald (naald B) en sluit de gebroken kant aan het andere uiteinde van polyethyleen buizen.
- Bevestig naald A aan een 1 mL tuberculin spuit.
LET OP: Voor deze polyethyleenbuizen komt 1,6 cm vloeistof in de slang overeen met 1 μL20.
- Bereid een mengsel van 10:1 ketamine/xylazine (10 mg/mL ketamine en 1 mg/mL xylazine) in zout (bacteriostatische 0,9% [w/v] natriumchloride). Bereid de oplossing voor gebruik vers.
2. Voorbereiding van het dier voor de operatie
OPMERKING: Gebruik muizen van 6−10 weken. Zowel vrouwelijke als mannelijke muizen kunnen worden gebruikt. In deze studie werden 6−10 weken oude C57BL/6 vrouwelijke muizen gebruikt. Deze methode kan worden aangepast voor andere muizenstammen.
- Verdoven de muis door intraperitoneally 250 μL van het ketamine/xylazinemengsel te injecteren. Wacht tot de muis volledig in slaap valt. Zorg ervoor dat de muis niet reageert op een teensnuifje om volledige verdovendeving te detecteren.
- Scheer bont rond de benen met haarknippers.
- Breng de ontharingscrème rond het been aan en wacht 5 minuten. Veeg de resterende vacht en de ontharingscrème af met een vochtig weefsel en maak het been schoon met steriel water. Spray 70% ethanol rond het been om het operatiegebied te steriliseren. De ethanol is beperkt tot de incisieplaats.
3. Chirurgische hechting van afferente lymfevaten
LET OP: Het rechterbeen wordt gehecht, en het linkerbeen wordt gebruikt als de schijncontrole. Het lymfehechtingsprotocol (stap 3.1−3.8) duurt 20−30 min.
- Houd de muis in een gevoelige positie en bevestig deze met chirurgische tape om het operatiegebied op het rechterbeen bloot te leggen.
- Intradermally injecteren 5 μL van 1% Evans blauwe kleurstof of 9 cm van de vloeistof van het injectieapparaat buizen in het voetpad. Masseer het voetpad voorzichtig om Evans blauw te helpen de lymfevaten binnen te komen.
LET OP: De insulinespuit is niet gemakkelijk te controleren voor kleine volumeinjectie. Het volume kan nauwkeuriger worden geregeld met behulp van het injectieapparaat. Lymfevaten worden gevisualiseerd door blauwe kleurstof onder de huid. Met uitgebreide training kunnen beide afferente lymfevaten met het blote oog worden gezien als transparante bloedvaten in het vetweefsel, parallel aan de Saphenous-slagader. Met uitgebreide training is het mogelijk om de vaten te hechten zonder Evans Blue dye te injecteren in gevallen waarin er zorgen zijn over mogelijke verstoringen van de kleurstof. - Kies onder een ontledenmicroscoop een incisieplaats van 5 mm van de onderrand van de popliteal fossa. Maak een kleine incisie (~ 5 mm) in de huid met een schaar. Met behulp van fijne werking tangen, strek de incisie, en bloot de verzamelende lymfevaten (Figuur 1A).
OPMERKING: Indien nodig kan een klein huidfragment worden verwijderd om de lymfevaten bloot te leggen. - Identificeer beide afferente lymfevaten die leiden tot de pLN's onder de ontledenmicroscoop(figuur 1B).
OPMERKING: Er zijn twee afferente lymfevaten van het voetpad naar de pLN. Beide moeten worden gehecht om de lymfestroom volledig te blokkeren. - Steek met behulp van een naaldhouder voorzichtig de hechtaald (0,7 metrische of kleinere) tussen het afferentelymfevat en de Saphenous-slagader en trek de naald voorzichtig uit rond het afferente lymfevat. Trek voorzichtig aan de hechtsnaar en laat ongeveer 2 cm van de hechtsnaar achter. Gebruik de naaldhouder om de snaar stevig te binden om een lymfevat te hechten met de knoop van een chirurg(figuur 1C).
OPMERKING: Het weefsel onder de incisie kan uitdrogen bij langdurige blootstelling aan lucht. Door de incisie zo klein mogelijk te maken en de hechting snel uit te voeren (d.w.z. binnen 5 min) wordt voorkomen dat het weefsel uitdroogt. Houd het weefselvocht aan door een klein zoutgehalte aan te brengen met een wattenstaafje. - Masseer het voetpad voorzichtig om ervoor te zorgen dat er geen Evans Blue kleurstof de hechtplaats passeert en snijd vervolgens de overtollige snaar met een schaar.
- Voer dezelfde hechtstappen uit (d.w.z. stappen 3.5 en 3.6) op het andere afferente lymfevat(figuur 1D). Sluit de huidincisie met dezelfde hechting die werd gebruikt om de vaten in stap 3.5(figuur 1E) te hechten.
- Voor de schijncontrole injecteer intradermally 5 μL van 1% Evans blauwe kleurstof aan het linker voetpad en masseer het voetpad om de lymfevaten te visualiseren. Open de huid met een excisie en sluit de wond zonder het vat te hechten (figuur 1F).
- Controleer optioneel de bediende muizen op 2−4 uur. De hechting kant van het been moet oedeem met Evans Blue verspreid naar de dij, terwijl de controle been zal tonen beperkte Evans blauwe kleurstof in het voetpad. Als muizen ontwaken, zal een extra ketamine/xylazine mix worden geïnjecteerd om verdoofd te blijven tot euthanasie.
4. Het volgen van de lymfestroom
- Onmiddellijk na de operatie injecteer intradermally 10 μL van 2% fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) in het voetpad van zowel het controle- als het lymfesige been.
- Euthanasereer de muizen met 400 μL ketamine/xylazine mengsel en voer cervicale dislocatie uit wanneer de muizen volledig verdoofd zijn.
- Verzamel pLN's van de popliteal fossa en verwijder het perinodal vetweefsel rond de pNN's voorzichtig onder de dissectiemicroscoop op 2, 6 en 12 uur na de FITC-injectie.
- Sluit de pLN's in met het medullaire sinusgebied dat naar de zijkant van de cryomold wordt gericht in een optimale snijtemperatuur (OCT) compound(figuur 1G,H).
- Bereid 20 μm bevroren secties met behulp van een cryotoom.
- Beeld de cryosections onder een confocale microscoop om fitc distributie te bepalen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Lymfevat hechting is gebruikt in eerdere studies15,16,17,19, waar het diende als een belangrijk instrument om de functie van lymfestroom te bestuderen voordat de moleculaire biologie van lymfevaten beter werd begrepen. Het blokkeren van lymfestroom onderbreekt LN homeostase, wat leidt tot HEV's verliezen van de kritische genexpressie die nodig is voor een optimale lymfocyten homing aan de LN
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het blokkeren van lymfestroom zal brede toepassingen hebben bij het manipuleren van antigeenlevering aan de LN in gezonde en zieke omstandigheden. Het is mogelijk om deze methode te gebruiken om de timing van de levering van antigeen te controleren om te bestuderen hoe continue lymfestroom de immuunrespons regelt bij het aftappen van LNs. Deze methode van lymfestroom onderbreking kan ook worden gebruikt om te bestuderen hoe lymfe effecten cel compartimentalisatie, celactivering, celmigratie, en celcel interacties in de L...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs danken Ava Zardynezhad voor het proeflezen van het manuscript. Dit werk wordt ondersteund door het Canadian Institute of Health Research (CIHR, PJT-156035) en de Canada Foundation for Innovation for SL (32930) en de National Natural Science Foundation of China voor Yujia Lin (81901576).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.9% Sodium Chloride Saline | Baxter | JB1323 | |
| 100% ethanol | Greenfield Global | University of Calgary distributiediensten UN1170. | |
| Depilatory cream | Nair | Nair Sensitive Formula Hair Removal Crème met zoete amandel olie en baby olie, 200-ml. Of soortgelijk product. | |
| Evans Blue kleurstof | Sigma Life Science | E2129-10G | Voor 1 ml van Evans Blue kleurstof, voeg 0,1g Evans Blue toe aan 10 ml PBS. De Evens Blue oplossing zal worden gefilterd door 0,22 mm filters en steriel worden bewaard in 1 ml aliquots. |
| Fluoresceïne isothiocyanate isomeer I (FITC) | Sigma Life Science | F7250-1G | |
| Forceps Dumont #3 | WPI | 500337 | |
| Forceps Dumont #5 | WPI | 500233 | |
| Injectie-apparaat | Verbind één uiteinde van polyethyleen buis met 30G × ½ naald. Bevestig een 1ml TB-spuit aan de naald. Ontdoe de naaldas van een andere 30G × ½ naald. Steek het stompe uiteinde van de 30G × ½ naaldas in het andere uiteinde van de buis. De binnendiameter van deze buis is 0,28 mm. Dus, 1,6 cm van vloeistof in de buis is 1 µl. | ||
| Insulinespuit | Becton Dickinson and Company (BD) | 329461 | |
| IRIS Forcep recht | WPI | 15914 | |
| IRIS schaar | WPI | 14218-G | |
| Ketamine | Narketan | DIN 02374994 | De leveranciers van Ketamine en Xylazine vallen meestal onder institutionele en overheidsregelgeving. |
| Naalden (26Gx3/8) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305110 | |
| Naalden (30Gx1/2) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305106 | |
| Paton naaldhouder | ROBOZ | RS6403 | Recht, Zonder vergrendeling; Gerifd |
| Fosfaat-gebufferde saline (PBS) | Sigma Life Science | P4417-100TAB | |
| Polyethyleen buis | Becton Dickinson and Company (BD) | 427401 | |
| Chirurgisch tape (1,25 cmx9,1m ) | Transpore | 1527-0 | |
| Chirurgisch tape (2,5cmx9,1m ) | Transpore | 1527-1 | |
| Hechtdraad | Davis and Geck CYANAMID Canada | 11/04 | 0,7 metrische monofilament polypropyleen |
| Spuit (1ml) | Becton Dickinson and Company (BD) | 309659 | |
| VANNAS schaar | World Precision Instruments (WPI) | 14122-G | |
| Xylazine | Rompun | DIN02169606 | De leveranciers van Ketamine en Xylazine vallen meestal onder institutionele en overheidsregelgeving. |
| Apparatuur | |||
| Dissectiemicroscoop | Olympus | Olympus S261 (522-STS OH141791) met lichtbron: Olympus Highlight 3100 | |
| Confocale microscoop | Leica | SP8 |
Referenties
- Pflicke, H., Sixt, M. Preformed portals facilitate dendritic cell entry into afferent lymphatic vessels. The Journal of Experimental Medicine. 206, 2925-2935 (2009).
- Schmid-Schonbein, G. W. Microlymphatics and lymph flow. Physiological Reviews. 70, 987-1028 (1990).
- Skalak, T. C., Schmid-Schonbein, G. W., Zweifach, B. W. New morphological evidence for a mechanism of lymph formation in skeletal muscle. Microvascular Research. 28, 95-112 (1984).
- Johnston, M. G., Hay, J. B., Movat, H. Z. Kinetics of prostaglandin production in various inflammatory lesions, measured in draining lymph. The American Journal of Pathology. 95, 225-238 (1979).
- Eisenhoffer, J., Yuan, Z. Y., Johnston, M. G. Evidence that the L-arginine pathway plays a role in the regulation of pumping activity in bovine mesenteric lymphatic vessels. Microvascular Research. 50, 249-259 (1995).
- Gasheva, O. Y., Zawieja, D. C., Gashev, A. A. Contraction-initiated NO-dependent lymphatic relaxation: a self-regulatory mechanism in rat thoracic duct. Journal of Physiology. 575, 821-832 (2006).
- Breslin, J. W., et al. Vascular endothelial growth factor-C stimulates the lymphatic pump by a VEGF receptor-3-dependent mechanism. American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 293, 709-718 (2007).
- Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nature Reviews. Immunology. 5, 617-628 (2005).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-159 (2004).
- Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity. The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).
- Kastenmuller, W., Torabi-Parizi, P., Subramanian, N., Lammermann, T., Germain, R. N. A spatially-organized multicellular innate immune response in lymph nodes limits systemic pathogen spread. Cell. 150, 1235-1248 (2012).
- Gerner, M. Y., Torabi-Parizi, P., Germain, R. N. Strategically localized dendritic cells promote rapid T cell responses to lymph-borne particulate antigens. Immunity. 42, 172-185 (2015).
- Moussion, C., Girard, J. P. Dendritic cells control lymphocyte entry to lymph nodes through high endothelial venules. Nature. 479, 542-546 (2011).
- Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex. The Journal of Experimental Medicine. 192, 1425-1440 (2000).
- Mebius, R. E., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. The function of high endothelial venules in mouse lymph nodes stimulated by oxazolone. Immunology. 71, 423-427 (1990).
- Mebius, R. E., Streeter, P. R., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. The influence of afferent lymphatic vessel interruption on vascular addressin expression. Journal of Cell Biology. 115, 85-95 (1991).
- Mebius, R. E., et al. Expression of GlyCAM-1, an endothelial ligand for L-selectin, is affected by afferent lymphatic flow. Journal of Immunology. 151, 6769-6776 (1993).
- Drayton, D. L., Liao, S., Mounzer, R. H., Ruddle, N. H. Lymphoid organ development: from ontogeny to neogenesis. Nature Immunology. 7, 344-353 (2006).
- Tomei, A. A., Siegert, S., Britschgi, M. R., Luther, S. A., Swartz, M. A. Fluid flow regulates stromal cell organization and CCL21 expression in a tissue-engineered lymph node microenvironment. Journal of Immunology. 183, 4273-4283 (2009).
- Liao, S., Jones, D., Cheng, G., Padera, T. P. Method for the quantitative measurement of collecting lymphatic vessel contraction in mice. Journal of Biological Methods. 1, 6(2014).
- Lin, Y., et al. Perinodal Adipose Tissue Participates in Immune Protection through a Lymphatic Vessel-Independent Route. Journal of Immunology. 201, 296-305 (2018).
- Gardenier, J. C., et al. Diphtheria toxin-mediated ablation of lymphatic endothelial cells results in progressive lymphedema. Journal of Clinical Investigation Insight. 1, 84095(2016).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
