Hier hebben we een goedkope en eenvoudig te bedienen methode opgezet die een snelle en efficiënte differentiatie van embryonale stamcellen naar neuronen stuurt. Deze methode is geschikt voor popularisering onder laboratoria en kan een nuttig hulpmiddel zijn voor neurologisch onderzoek.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Neuronale differentiatie van embryonale stamcellen van muizen in vitro
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De neurale differentiatie van embryonale stamcellen van muizen (mESCs) is een potentieel hulpmiddel om de belangrijkste mechanismen die betrokken zijn bij neurogenese op te helderen en mogelijk te helpen bij regeneratieve geneeskunde. Hier hebben we een efficiënte en goedkope methode voor neuronale differentiatie van mESCs in vitroopgezet, met behulp van de strategie van combinatorische screening. Onder de hier gedefinieerde omstandigheden maakt het 2-daagse embryoide lichaamsvorming + 6-daags retinoïnezuurinductieprotocol een snelle en efficiënte differentiatie van mESCs in neurale precursorcellen (NPC's) mogelijk, zoals blijkt uit de vorming van goed gestapelde en neurietachtige A2lox en 129 derivaten die Nestine-positief zijn. De gezonde toestand van embryonale lichamen en het tijdstip waarop retinoïnezuur (RA) wordt toegepast, evenals de RA-concentraties, zijn daarbij van cruciaal belang. In de daaropvolgende differentiatie van NPC's in neuronen zou N2B27 medium II (aangevuld met Neurobasal medium) het onderhoud en de rijping van neuronale cellen op lange termijn beter kunnen ondersteunen. De gepresenteerde methode is zeer efficiënt, goedkoop en eenvoudig te bedienen en kan een krachtig hulpmiddel zijn voor neurobiologie en ontwikkelingsbiologieonderzoek.
Inleiding
Embryonale stamcellen (ECC's) zijn pluripotent en kunnen zich onder bepaalde omstandigheden onderscheiden in neurale precursorcellen (NPC's) en vervolgens in neuronen1. ESC-gebaseerde neurogenese biedt het beste platform om neurogenese na te bootsen, en dient zo als een nuttig hulpmiddel voor ontwikkelingsbiologische studies en mogelijk hulp bij regeneratieve geneeskunde2,3. In de afgelopen decennia zijn veel strategieën gerapporteerd voor het induceren van embryonale neurogenese, zoals de transgene methode4, met behulp van kleinemoleculen 5
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Muis embryonale stamcelcultuur
- Bereid 0,1% gelatine gecoate celkweekgerechten of borden.
- Voeg 2 ml gesteriliseerde 0,1% gelatine (0,1% w/v in water) toe aan 60 mm celkweekschalen. Rock zachtjes om een gelijkmatige coating van de celcultuurgerechten te garanderen.
- Doe de borden in een CO2-incubator van 5% bij 37 °C en laat 1 uur coaten.
- Verwijder de 0,1% gelatineoplossing voordat u de cellen zaait.
OPMERKING: Na het verwijderen van de gelatine is het niet nodig om de gecoate vaat te drogen of te wassen.
- Muis embryonale stamcellen (A2lox en 129) cultuur
- Incubeer mESCs (A2lox en 129) ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
2-daagse embryoide lichaamsvorming + 6-daagse RA-inductie werkt het beste bij het sturen van de differentiatie van mESC's naar NPC's (fase I). Om het optimale protocol te bepalen dat de differentiatie van mESCs in NPC's (Fase I) het beste bevordert, werden 7 protocollen getest op zowel A2lox als 129 mESCs (tabel 1) en werd de differentiatiestatus van elke groep gecontroleerd met behulp van een lichtmicroscoop. Zoals getoond in figuur 3A, vertoonden de meeste A2lox en 129 der.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In deze studie hebben we een eenvoudige en effectieve methode voor neuronale differentiatie van mESCs vastgesteld, met lage kosten en gemakkelijk te verkrijgen materialen. Bij deze methode kunnen 2 dagen embryoide lichaamsvorming gevolgd door 6 dagen RA-inductie de differentiatie van mESC's in NPC's effectief bevorderen (fase I-protocol 3). Voor de fase II-differentiatie induceert N2B27 medium II (Fase II-protocol 3) het meest effectief de differentiatie van NPC's in neuronen. Om succes te garanderen, moet meer aandacht .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nr. 31501099) en de middelbare leeftijd en jongeren van het ministerie van Onderwijs van de provincie Hubei, China (nr. Het jaar 20191104). En we danken professor Wensheng Deng van wuhan University of Science and Technology voor het leveren van de muis embryonale stamcellijnen A2lox.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Anti-Nestin antibody [Rat-401] | Abcam | Ab11306 | bewaard op -80 °C, herhaaldelijk invriezen en ontdooien vermijden |
| Anti-&bèta;-Tubulin III antibody geproduceerd in konijn | Sigma Aldrich | T2200 | bewaard op -80 °C, herhaaldelijk invriezen en ontdooien vermijden |
| Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG | Beyotime | A0428 | bewaard op -20 °C en beschermd tegen licht |
| B-27 Supplement (50X), serumvrij | Gibco | 17504044 | bewaard op -20 °C, en beschermd tegen licht |
| CHIR-99021 (CT99021) | Selleck | S1263 | bewaard op -20 °C |
| Dekglasjes | NEST | 801007 | |
| Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0516 | bewaard op -20 °C en beschermd tegen licht |
| DME/F-12 1:1 (1x) | HyClone | SH30023.01B | bewaard op 4 °C |
| Foetaal runderserum | HyClone | SH30084.03 | bewaard op -20 °C, herhaaldelijk invriezen en ontdooien vermijden |
| Fluorescentiemicroscopie | Olympus | CKX53 | |
| Gelatine | Gibco | CM0635B | bewaard op kamertemperatuur |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | bewaard op 4 °C |
| Immunol Kleuring Primaire Antilichaam verdunning Buffer | Beyotime | P0103 | bewaard op 4 °C |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | bewaard op 4 °C |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | bewaard op -20 °C, herhaaldelijk invriezen en ontdooien vermijden |
| Leukemie Inhibitory Factor humaan | Sigma | L5283 | bewaard op -20 °C |
| Montage Medium Met DAPI - Waterig, Fluoroshield | Abcam | ab104139 | bewaard op 4 °C en beschermd tegen licht |
| MEM Niet-essentiële aminozuurloos | Gibco | 11140076 | bewaard op 4 °C |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | bewaard op -20 °C en beschermd tegen licht |
| Normaal geitenserum | Jackson | 005-000-121 | bewaard op -20 °C |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | bewaard op 4 °C |
| Niet-adhesieve bacteriële schaal | Corning | 3262 | |
| Fosfaatgebufferde zoutoplossing (1X) | HyClone | SH30256.01B | bewaard op 4 °C |
| Penicilline/Streptomycine oplossing | HyClone | SV30010 | bewaard op 4 °C |
| PD0325901(Mirdametinib) | Selleck | S1036 | bewaard op -20 °C |
| Retinoïnezuur | Sigma | R2625 | bewaard op -80 °C en beschermd tegen licht |
| Stam 129 muis embryonale stamcellen | Cyagen | MUAES-01001 | Gehandhaafd in feeder-vrije kweeksysteem |
| Stem-Cellbanker (DMSO-vrij) | ZENOAQ | stem cellbanker DMSO-vrij | bewaard op -20 °C, herhaaldelijk invriezen en ontdooien vermijden |
| Trypsine 0,25% (1X) oplossing | HyClone | SH30042.01 | bewaard op 4 °C |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | bewaard op 4 °C en beschermd tegen licht |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0098 | bewaard op -20 °C |
| 6 - welplaat | Corning | 3516 | |
| 60 mm celkweekschaal | Corning | 430166 | |
| 15 ml centrifugeerbuis | NUNC | 339650 |
Referenties
- Vieira, M. S., et al. Neural stem cell differentiation into mature neurons: mechanisms of regulation and biotechnological applications. Biotechnology Advances. 36 (7), 1946-1970 (2018).
- Yang, J. R., Lin, Y. T., Liao, C. H.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
