Methodenartikel

Neuronale differentiatie van embryonale stamcellen van muizen in vitro

DOI:

10.3791/61190

⸱

2 juni 2020

 , 
1Wuhan Center for Disease Control and Prevention, 2College of Life Science and Health, Wuhan University of Science and Technology

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier hebben we een goedkope en eenvoudig te bedienen methode opgezet die een snelle en efficiënte differentiatie van embryonale stamcellen naar neuronen stuurt. Deze methode is geschikt voor popularisering onder laboratoria en kan een nuttig hulpmiddel zijn voor neurologisch onderzoek.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De neurale differentiatie van embryonale stamcellen van muizen (mESCs) is een potentieel hulpmiddel om de belangrijkste mechanismen die betrokken zijn bij neurogenese op te helderen en mogelijk te helpen bij regeneratieve geneeskunde. Hier hebben we een efficiënte en goedkope methode voor neuronale differentiatie van mESCs in vitroopgezet, met behulp van de strategie van combinatorische screening. Onder de hier gedefinieerde omstandigheden maakt het 2-daagse embryoide lichaamsvorming + 6-daags retinoïnezuurinductieprotocol een snelle en efficiënte differentiatie van mESCs in neurale precursorcellen (NPC's) mogelijk, zoals blijkt uit de vorming van goed gestapelde en neurietachtige A2lox en 129 derivaten die Nestine-positief zijn. De gezonde toestand van embryonale lichamen en het tijdstip waarop retinoïnezuur (RA) wordt toegepast, evenals de RA-concentraties, zijn daarbij van cruciaal belang. In de daaropvolgende differentiatie van NPC's in neuronen zou N2B27 medium II (aangevuld met Neurobasal medium) het onderhoud en de rijping van neuronale cellen op lange termijn beter kunnen ondersteunen. De gepresenteerde methode is zeer efficiënt, goedkoop en eenvoudig te bedienen en kan een krachtig hulpmiddel zijn voor neurobiologie en ontwikkelingsbiologieonderzoek.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embryonale stamcellen (ECC's) zijn pluripotent en kunnen zich onder bepaalde omstandigheden onderscheiden in neurale precursorcellen (NPC's) en vervolgens in neuronen1. ESC-gebaseerde neurogenese biedt het beste platform om neurogenese na te bootsen, en dient zo als een nuttig hulpmiddel voor ontwikkelingsbiologische studies en mogelijk hulp bij regeneratieve geneeskunde2,3. In de afgelopen decennia zijn veel strategieën gerapporteerd voor het induceren van embryonale neurogenese, zoals de transgene methode4, met behulp van kleinemoleculen 5, met behulp van een 3D-matrix micromilieu6, en de co-cultuurtechniek7. De meeste van deze protocollen zijn echter beperkt of moeilijk te bedienen, dus ze zijn niet geschikt voor gebruik in de meeste laboratoria.

Om een eenvoudig te bedienen en goedkope methode te vinden om efficiënte neurale differentiatie van mESCs te bereiken, werd hier een combinatorische screeningstrategie gebruikt. Zoals beschreven in figuur 1,was het hele proces van embryonale neurogenese verdeeld in 2 fasen. Fase I verwijst naar het differentiatieproces van mESC's naar NPC's, en fase II heeft betrekking op de daaropvolgende differentiatie van NPC's in neuronen. Op basis van de principes van eenvoudige bediening, lage kosten, gemakkelijk beschikbare materialen en een hoge differentiatie-efficiëntie, werden zeven protocollen in fase I en drie protocollen in fase II gekozen op basis van het traditionele aanhankelijke monolaagcultuursysteem of embryooïde lichaamsvormingssysteem8,9. De differentiatie-efficiëntie van protocollen in beide fasen werd geëvalueerd met behulp van celmorfologieobservatie en immunofluorescentietest. Door het meest efficiënte protocol van elke fase te combineren, hebben we de geoptimaliseerde methode voor neurale differentiatie van mESCs vastgesteld.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Muis embryonale stamcelcultuur

  1. Bereid 0,1% gelatine gecoate celkweekgerechten of borden.
    1. Voeg 2 ml gesteriliseerde 0,1% gelatine (0,1% w/v in water) toe aan 60 mm celkweekschalen. Rock zachtjes om een gelijkmatige coating van de celcultuurgerechten te garanderen.
    2. Doe de borden in een CO2-incubator van 5% bij 37 °C en laat 1 uur coaten.
    3. Verwijder de 0,1% gelatineoplossing voordat u de cellen zaait.
      OPMERKING: Na het verwijderen van de gelatine is het niet nodig om de gecoate vaat te drogen of te wassen.
  2. Muis embryonale stamcellen (A2lox en 129) cultuur
    1. Incubeer mESCs (A2lox en 129) cellen in de 0,1% gelatine gecoate 60 mm celkweekschalen in mESC groeimedium bij respectievelijk 37 °C in een CO2 incubator van 5%. Het mESC groeimedium bestaat uit 85% knock-out DMEM/F12, 15% Knock-out serumvervanging (KSR), 0,1 mM β-mercaptoethanol (2ME), 2 mM GlutaMAX, 1% niet-essentieel aminozuur (NEAA), 1% penicilline/streptomycine (P/S), 1000 U/ml leukemieremmerfactor (LIF), 10 nM CHIR-99021 (GSK-3-remmer) en 0,33 nM PD0325901 (MEK-remmer).
      LET OP: β-mercaptoethanol is ontvlambaar en heeft inhalatietoxiciteit. Blijf uit de buurt van brandbronnen en draag een masker om inademing bij gebruik te voorkomen.
    2. Verander dagelijks het mESC groeimedium voor een betere groei van A2lox en 129.
    3. Wanneer de cellen 80% samenvloeiing bereiken, verwijdert u het medium en voegt u 1 ml trypsine van 0,1% toe aan de schaal. Schommel voorzichtig gedurende 30 s om een gelijkmatige dekking van trypsine op alle cellen te garanderen.
    4. Laat de cellen ongeveer 1 minuut om te proberenpsinize en verwijder vervolgens de trypsine met behulp van 1 ml pipet.
    5. Voeg 2 ml mESC-groeimedium toe aan de schaal, pipetteer meerdere keren op en neer om een enkele celophanging te maken.
    6. Tel de dichtheid van de cellen in de suspensie zo nauwkeurig mogelijk met behulp van hemocytometer.
    7. Verdeel de cellen in 7 groepen en induceer differentiatie met behulp van verschillende protocollen in tabel 1.

2. Differentiatie van mESCs naar NPC's (Fase I)

  1. Bereid 0,1% gelatine gecoate celkweekplaten of coverslips voor.
    1. Bereid voor gebruik 0,1% gelatine gecoate 6-put platen of coverslips zoals in stap 1.1.
  2. Fase I differentiatie met protocol 1 (Tabel 1)
    1. Zaai ongeveer 2 x 104 mESCs in 2 ml basaal differentiatiemedium I per put in de 0,1% gelatine gecoate 6-putplaten. Controleer de celdichtheid onder een microscoop.
    2. Incubeer de cellen bij 37 °C gedurende 6 uur in een CO2-incubator van 5% om aanhechting mogelijk te maken.
    3. Haal na de bevestiging de cellen uit de incubator en was de cellen twee keer met 2 ml PBS.
    4. Voeg 2 ml basaal differentiatiemedium I (tabel 1) toe aan elke put en plaats de cellen terug in de incubator.
    5. Laat de cellen 8 dagen differentiëreren. Vervang het basale differentiatiemedium I om de 2 dagen.
  3. Fase I differentiatie met protocol 2 (Tabel 1)
    1. Voeg 1,5 x 106 mESCs toe aan een niet-adhesieve bacteriële schaal in 10 ml basaaldifferentiatiemedium I om embryoide lichaamsvorming bij 37 °C in een CO2-incubator van 5% mogelijk te maken.
    2. Breng na 2 dagen celaggregaten over in centrifugebuizen van 15 ml en laat ze bezinken door de zwaartekracht.
    3. Verwijder het supernatant en voeg 10 ml vers basaaldifferentiatiemedium I toe om de embryonale lichamen opnieuw te gebruiken. Herplant ze in een nieuwe niet-adhesieve bacteriële schaal en laat differentiatie nog 2 dagen toe.
    4. Controleer de vorming van embryonale lichamen onder de microscoop (figuur 2A).
    5. Verzamel embryonale lichamen zoals beschreven in de stappen 2.3.2-2.3.3. Zaai ongeveer 50 embryonale lichamen in 2 ml basaal differentiatiemedium I per put op 0,1% gelatinegecoate 6-putplaten.
    6. Bereid 1 mM all-trans RA voorraad (in DMSO) en bewaar uit de buurt van licht in een -80 °C vriezer na subverpakking.
      OPMERKING: RA is onstabiel en er moet aandacht worden besteed aan het uit de buurt houden van licht en het verminderen van luchtcontact tijdens de voorbereiding van RA-voorraad.
    7. Voeg voor RA-inductie 2 μL RA-voorraad toe aan elke put om een uiteindelijke concentratie van 1 μM te maken.
    8. Plaats de plaat in de 5% CO2 incubator bij 37 °C en onderscheid nog 4 dagen.
    9. Verander elke 2 dagen de volledige 2 ml basaal differentiatiemedium I (met 1 μM RA).
  4. Fase I differentiatie met protocol 3 (Tabel 1)
    1. Plant 1,5 x 106 mESCs in een niet-adhesieve bacteriële schaal in 10 ml basale differentiatiemedium I. Laat 2 dagen voor embryoide lichaamsvorming bij 37 °C in een CO2-incubator van 5%.
    2. Controleer de vorming van embryonale lichamen onder een microscoop (figuur 2B).
    3. Breng celaggregaten over in centrifugebuizen van 15 ml en laat ze bezinken door de zwaartekracht.
    4. Verwijder het supernatant voorzichtig en voeg 10 ml vers basaaldifferentiatiemedium I toe om ze opnieuw te gebruiken.
    5. Zaai ongeveer 50 embryonale lichamen in 2 ml basaal differentiatiemedium I per put op 0,1% gelatinegecoate 6-putplaten.
    6. Voeg voor RA-inductie 2 μL RA-voorraad toe aan elke put om een uiteindelijke concentratie van 1 μM te maken.
    7. Plaats de plaat in de 5% CO2 incubator bij 37 °C en differentieert nog 6 dagen. Verander elke 2 dagen het gehele basale differentiatiemedium I (met 1 μM RA).
  5. Fase I differentiatie met protocol 4 (Tabel 1)
    1. Zaai ongeveer 2 x 104 mESCs binnen 2 ml basaaldifferentiatiemedium I per put op de 0,1% gelatine gecoate 6-putplaten. Plaats de plaat in de 5% CO2 incubator bij 37 °C om 6 uur te kunnen worden vastgehecht.
    2. Was de cellen na het bevestigen tweemaal met 2 ml PBS. Voeg 2 ml basale differentiatiemedium I toe aan elke put en zorg voor differentiatie gedurende 4 dagen in de 5% CO2 incubator bij 37 °C.
    3. Voeg voor RA-inductie 2 μL all-trans RA-bestand toe aan elke put (de werkconcentratie is 1 μM) om nog 4 dagen differentiatie te induceren.
    4. Vervang in het hele proces het hele medium om de 2 dagen.
  6. Fase I differentiatie met protocol 5 (Tabel 1)
    1. Zaai ongeveer 2 x 104 mESCs binnen 2 ml basaaldifferentiatiemedium I per put op de 0,1% gelatine gecoate 6-putplaten. Plaats de plaat in de 5% CO2 incubator bij 37 °C om 6 uur te kunnen worden vastgehecht.
    2. Was de cellen tweemaal met 2 ml PBS. Voeg 2 ml basale differentiatiemedium I toe aan elke put en zorg voor differentiatie gedurende 2 dagen in de 5% CO2 incubator bij 37 °C.
    3. Voeg voor de daaropvolgende RA-inductie 2 μL RA-bestand toe aan elke put om een uiteindelijke concentratie van 1 μM te maken. Plaats de plaat in de 5% CO2-incubator bij 37 °C om nog 6 dagen differentiatie te induceren.
    4. Vervang in het hele proces het hele medium om de 2 dagen.
  7. Fase I differentiatie met protocol 6 (Tabel 1)
    1. Plant 1,5 x 106 mESCs in een niet-adhesieve bacteriële schaal in 10 ml N2B27 medium II (tabel 1) om de vorming van embryonale lichamen mogelijk te maken.
    2. Verzamel op de2e dag de celaggregaten zoals beschreven in stap 2.3.2-2.3.3 en resuspendeer de embryonale lichamen met 10 ml verse N2B27 medium II.
    3. Herplant ze in een nieuwe niet-adhesieve bacteriële schaal en laat nog 2 dagen differentiëring toe in de 5% CO2 incubator bij 37 °C. Controleer de vorming van embryonale lichamen onder de microscoop.
    4. Verzamel op de4e dag embryonale lichamen. Zaai ongeveer 50 embryonale lichamen per put op 0,1% gelatine-gecoate 6-put platen met 2 ml N2B27 medium II.
    5. Voeg 2 μL all-trans RA voorraad toe aan elke put en induceer differentiatie gedurende nog eens 4 dagen. Vervang het gehele medium (N2B27 medium II door 1 μM RA) om de twee dagen.
  8. Fase I differentiatie met protocol 7 (Tabel 1)
    1. Zaai ongeveer 2 x 104 mESCs binnen 2 ml basaaldifferentiatiemedium I per put op de 0,1% gelatine gecoate 6-putplaten. Plaats de plaat in de 5% CO2 incubator bij 37 °C om 6 uur te kunnen worden vastgehecht.
    2. Was de cellen twee keer met PBS. Voeg vervolgens 2 ml N2B27 medium II toe aan elke put en zorg voor differentiatie gedurende 8 dagen bij 37 °C in een CO2-incubator van 5%.
    3. Wijzig elke 2 dagen het gehele N2B27 medium II.

3. Celmorfologie observatie

  1. Controleer dagelijks de differentiatiestatus van de bovengenoemde 7 groepen onder een omgekeerde fasecontrastlichtmicroscoop.
  2. Selecteer willekeurig ten minste 12 velden en maak foto's om de morfologische wijzigingen van elke groep op D8 vast te leggen.

4. Immunofluorescentiekleuring

  1. Monstervoorbereiding: Zaai mESCs op 0,1% gelatine gecoate coverslips en maak differentiatie gedurende 8 dagen mogelijk met behulp van de in stap 2 genoemde protocollen.
  2. Spoelen: Haal op de8e dag de monsters uit de incubator en verwijder het differentiatiemedium door aspiratie. Spoel de cellen één keer voorzichtig af met 1 ml PBS gedurende 5 minuten.
  3. Fixatie: Voeg 1 ml paraformaldehyde van 4% toe aan elk monster en fixeer de cellen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (RT).
  4. Spoelen: Spoel de cellen na fixatie voorzichtig 3 keer af met 1 ml PBS, telkens gedurende 5 minuten.
  5. Permeabilisatie: Voeg 1 ml van 0,2% TritonX-100 in PBS toe aan elk monster en laat 8 minuten bij RT staan.
  6. Spoelen: Spoel de cellen na permeabilisatie voorzichtig 3 keer af met 1 ml PBS, telkens gedurende 5 minuten.
  7. Blokkeren: Voeg 1 ml 10% geitenserum in PBS toe aan elk monster en incubeer gedurende 1 uur bij RT om niet-specifieke interacties te blokkeren.
  8. Incubatie met primair antilichaam
    1. Verdun het anti-Nestine antilichaam in een verhouding van 1:100 met 5% geitenserum in PBS.
    2. Breng 500 μL verdund antilichaam aan op verschillende monsters en broed 's nachts bij 4 °C.
  9. Spoelen: Verwijder het antilichaam en spoel de monsters voorzichtig af met 1 ml PBS 3 keer gedurende 8 minuten per stuk.
  10. Incubatie met secundair antilichaam
    1. Verdun de Alexa Fluor 488-gelabelde geitenantimuis IgG in een verhouding van 1:500 met behulp van 5% geitenserum in PBS.
    2. Breng 500 μL verdund antilichaam aan op verschillende monsters en incub in het donker gedurende 2 uur bij RT.
      OPMERKING: Voer na het aanbrengen van fluorescerend secundair antilichaam alle volgende stappen in het donker uit om fluorescentielessen te voorkomen.
  11. Spoelen: Verwijder het secundaire antilichaam en spoel de monsters voorzichtig af met 1 ml PBS 3 keer gedurende 8 minuten per stuk.
  12. Nucleaire kleuring en montage
    1. Plaats één druppel DAPI-montagemedium op de schone microslide.
    2. Haal voorzichtig de monsters uit de platen en plaats het monster bovenop het DAPI-montagemedium met de cel naar beneden. Laat 5 minuten in het donker staan bij RT.
    3. Verwijder overtollig DAPI-montagemedium met absorberend papier.
  13. Fluorescentiemicroscopie observatie
    1. Plaats de monsters onder de fluorescentiemicroscopie en detecteer het signaal voor DAPI en Alexa Fluor 488 met behulp van de juiste filters.
    2. Kies gelijkmatig en willekeurig 10-15 verschillende gezichtsvelden voor elk voorbeeld en neem de beelden op met een CCD-camera.

5. Differentiatie van NPC's naar neuronen (Fase II)

  1. Bereid mESC-derivaten voor onder fase I-differentiatie met behulp van protocol 3 (8 dagen, tabel 1)zoals beschreven in stap 2.4, dat de hoogste differentiatie-efficiëntie heeft (zie figuur 3).
    OPMERKING: Na fase I-differentiatie moet kwaliteitscontrole worden uitgevoerd met behulp van celmorfologieobservatie en immunofluorescentietest die hierboven wordt genoemd, om een gezonde en hoogrenderende NPC's te garanderen.
  2. Zaai ongeveer 5 x 105 mESC derivaten binnen 2 ml basaal differentiatiemedium I per put op de 0,1% gelatine gecoate 6-put platen. Verdeel de mESC-derivaten willekeurig in 3 groepen, zoals respectievelijk fase II-protocol 1, protocol 2 en protocol 3.
  3. Plaats de plaat in de 5% CO2 incubator bij 37 °C om 6 uur te kunnen worden vastgehecht. Was ze twee keer met 2 ml PBS.
  4. Voeg respectievelijk 2 ml basaal differentiatiemedium I, N2B27 medium I en N2B27 medium II (tabel 2) toe aan elke put van de bovenstaande groepen.
  5. Plaats de platen in de incubator en laat nog 10 dagen differentiëren. Wijzig het bijbehorende medium om de 2 dagen.
  6. Controleer de differentiatiestatus en noteer de morfologische veranderingen zoals vermeld in stap 3.
  7. Evalueer op dag 18 de generatie neuronen (β-Tubuline III positief) en bepaal de differentiatie-efficiëntie van de 3 protocollen met behulp van stap 4.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

2-daagse embryoide lichaamsvorming + 6-daagse RA-inductie werkt het beste bij het sturen van de differentiatie van mESC's naar NPC's (fase I). Om het optimale protocol te bepalen dat de differentiatie van mESCs in NPC's (Fase I) het beste bevordert, werden 7 protocollen getest op zowel A2lox als 129 mESCs (tabel 1) en werd de differentiatiestatus van elke groep gecontroleerd met behulp van een lichtmicroscoop. Zoals getoond in figuur 3A, vertoonden de meeste A2lox en 129 der...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze studie hebben we een eenvoudige en effectieve methode voor neuronale differentiatie van mESCs vastgesteld, met lage kosten en gemakkelijk te verkrijgen materialen. Bij deze methode kunnen 2 dagen embryoide lichaamsvorming gevolgd door 6 dagen RA-inductie de differentiatie van mESC's in NPC's effectief bevorderen (fase I-protocol 3). Voor de fase II-differentiatie induceert N2B27 medium II (Fase II-protocol 3) het meest effectief de differentiatie van NPC's in neuronen. Om succes te garanderen, moet meer aandacht ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nr. 31501099) en de middelbare leeftijd en jongeren van het ministerie van Onderwijs van de provincie Hubei, China (nr. Het jaar 20191104). En we danken professor Wensheng Deng van wuhan University of Science and Technology voor het leveren van de muis embryonale stamcellijnen A2lox.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Anti-Nestin antibody [Rat-401]AbcamAb11306bewaard op -80 °C, herhaaldelijk invriezen en ontdooien vermijden
Anti-&bèta;-Tubulin III antibody geproduceerd in konijnSigma AldrichT2200bewaard op -80 °C, herhaaldelijk invriezen en ontdooien vermijden
Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgGBeyotimeA0428bewaard op -20 °C en beschermd tegen licht
B-27 Supplement (50X), serumvrijGibco17504044bewaard op -20 °C, en beschermd tegen licht
CHIR-99021 (CT99021)SelleckS1263bewaard op -20 °C
DekglasjesNEST801007
Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgGBeyotimeA0516bewaard op -20 °C en beschermd tegen licht
DME/F-12 1:1 (1x)HyCloneSH30023.01Bbewaard op 4 °C
Foetaal runderserumHyCloneSH30084.03bewaard op -20 °C, herhaaldelijk invriezen en ontdooien vermijden
FluorescentiemicroscopieOlympusCKX53
GelatineGibcoCM0635Bbewaard op kamertemperatuur
GlutaMAX SupplementGibco35050061bewaard op 4 °C
Immunol Kleuring Primaire Antilichaam verdunning BufferBeyotimeP0103bewaard op 4 °C
KnockOut DMEM/F-12Gibco12660012bewaard op 4 °C
KnockOut Serum ReplacementGibco10828028bewaard op -20 °C, herhaaldelijk invriezen en ontdooien vermijden
Leukemie Inhibitory Factor humaanSigmaL5283bewaard op -20 °C
Montage Medium Met DAPI - Waterig, FluoroshieldAbcamab104139bewaard op 4 °C en beschermd tegen licht
MEM Niet-essentiële aminozuurloosGibco11140076bewaard op 4 °C
N-2 Supplement (100X)Gibco17502048bewaard op -20 °C en beschermd tegen licht
Normaal geitenserumJackson005-000-121bewaard op -20 °C
Neurobasal MediumGibco21103049bewaard op 4 °C
Niet-adhesieve bacteriële schaalCorning3262
Fosfaatgebufferde zoutoplossing (1X)HyCloneSH30256.01Bbewaard op 4 °C
Penicilline/Streptomycine oplossingHyCloneSV30010bewaard op 4 °C
PD0325901(Mirdametinib)SelleckS1036bewaard op -20 °C
RetinoïnezuurSigmaR2625bewaard op -80 °C en beschermd tegen licht
Stam 129 muis embryonale stamcellenCyagenMUAES-01001Gehandhaafd in feeder-vrije kweeksysteem
Stem-Cellbanker (DMSO-vrij)ZENOAQstem cellbanker DMSO-vrijbewaard op -20 °C, herhaaldelijk invriezen en ontdooien vermijden
Trypsine 0,25% (1X) oplossingHyCloneSH30042.01bewaard op 4 °C
Triton X-100SigmaT8787
2-MercaptoethanolGibco21985023bewaard op 4 °C en beschermd tegen licht
4% paraformaldehydeBeyotimeP0098bewaard op -20 °C
6 - welplaatCorning3516
60 mm celkweekschaalCorning430166
15 ml centrifugeerbuisNUNC339650

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vieira, M. S., et al. Neural stem cell differentiation into mature neurons: mechanisms of regulation and biotechnological applications. Biotechnology Advances. 36 (7), 1946-1970 (2018).
  2. Yang, J. R., Lin, Y. T., Liao, C. H. Application of embryonic stem cells on Parkinson's disease therapy. Genomic Medicine, Biomarkers, and Health Sciences. 3 (1), 17-26 (2011).
  3. Liu, C., Zhong, Y. W., Apostolou, A., Fang, S. Y. Neural differentiation of human embryonic stem cells as an in vitro tool for the study of the expression patterns of the neuronal cytoskeleton during neurogenesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 439 (1), 154-159 (2013).
  4. Khramtsova, E. A., Mezhevikina, L. M., Fesenko, E. E. Proliferation and differentiation of mouse embryonic stem cells modified by the Neural Growth Factor (NGF) gene. Biology Bulletin. 45 (3), 219-225 (2018).
  5. Yoshimatsu, S., et al. Evaluating the efficacy of small molecules for neural differentiation of common marmoset ESCs and iPSCs. Neuroscience research. , (2019).
  6. Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. 3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages. Biomaterials. 34, 5995-6007 (2013).
  7. Gazina, E. V., et al. Method of derivation and differentiation of mouse embryonic stem cells generating synchronous neuronal networks. Journal of Neuroscience Methods. 293, 53-58 (2018).
  8. Ohnuki, Y., Kurosawa, H. Effects of hanging drop culture conditions on embryoid body formation and neuronal cell differentiation using mouse embryonic stem cells: Optimization of culture conditions for the formation of well-controlled embryoid bodies. Journal of Bioscience and Bioengineering. 115 (5), 571-574 (2013).
  9. Wongpaiboonwattana, W., Stavridis, M. P. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells in serum-free monolayer culture. Journal of Visualized experiments. (99), e52823(2015).
  10. Li, Y., et al. An optimized method for neuronal differentiation of embryonic stem cells in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 330 (15), 108486(2020).
  11. Zhou, P., et al. Investigation of the optimal suspension culture time for the osteoblastic differentiation of human induced pluripotent stem cells using the embryoid body method. Biochemical and Biophysical Research Communications. 515 (4), 586-592 (2019).
  12. Lu, J. F., et al. All-trans retinoic acid promotes neural lineage entry by pluripotent embryonic stem cells via multiple pathways. BMC Cell Biology. 10, 57(2009).
  13. Kanungo, J. Retinoic acid signaling in P19 stem cell differentiation. Anticancer Agents in Medicinal Chemistry. 17 (9), 1184-1198 (2017).
  14. Rochette-Egly, C. Retinoic acid signaling and mouse embryonic stem cell differentiation: Cross talk between genomic and non-genomic effects of RA. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1851 (1), 66-75 (2015).
  15. Wang, R., et al. Retinoic acid maintains self-renewal of murine embryonic stem cells via a feedback mechanism. Differentiation. 76 (9), 931-945 (2008).
  16. Wu, H. B., et al. Retinoic acid-induced upregulation of miR-219 promotes the differentiation of embryonic stem cells into neural cells. Cell Death Disease. 8, 2953(2017).
  17. Chen, W., et al. Retinoic acid regulates germ cell differentiation in mouse embryonic stem cells through a Smad-dependent pathway. Biochemical and Biophysical Research Communications. 418 (3), 571-577 (2012).
  18. Nakayama, Y., et al. A rapid and efficient method for neuronal induction of the P19 embryonic carcinoma cell line. Journal of Neuroscience Methods. 227, 100-106 (2014).
  19. Bibel, M., et al. Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage. Nature neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).
  20. Coyle, D. E., Li, J., Baccei, M. Regional Differentiation of Retinoic Acid-Induced Human Pluripotent Embryonic Carcinoma Stem Cell Neurons. PLoS ONE. 6 (1), 16174(2011).
  21. Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. Developmental Biology. 275, 124-142 (2004).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Vorming van embryo de lichaampjesinductie met retino nezuurneurale precursorcellenN2B27 mediumimmunofluorescentie assaynestine positieve cellenb ta tubuline IIIgelatinegecoate platen

Gerelateerde artikelen