Een kleinschalige setup voor algentoxiciteitstesten van nanomaterialen en andere moeilijke stoffen

Samenvatting

We demonstreren algentoxiciteitstests voor moeilijke stoffen (bijvoorbeeld gekleurde stoffen of nanomaterialen) met behulp van een opstelling die verticaal met een LED wordt verlicht.

Samenvatting

Ecotoxiciteitsgegevens zijn een vereiste voor pre- en post-market registratie van chemische stoffen door Europese en internationale regelgeving (bijvoorbeeld REACH). De algentoxiciteitstest wordt vaak gebruikt bij de beoordeling van de regelgeving van chemische stoffen. Om een hoge betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid te bereiken is de ontwikkeling van gestandaardiseerde richtlijnen van vitaal belang. Voor algentoxiciteitstests vereisen de richtlijnen stabiele en uniforme omstandigheden van parameters zoals pH, temperatuur, kooldioxideniveaus en lichtintensiteit. Nanomaterialen en andere zogenaamde moeilijke stoffen kunnen het licht verstoren, waardoor een grote variatie in verkregen resultaten de acceptatie van de regelgeving belemmert. Om deze uitdagingen het hoofd te bieden, hebben we LEVITATT (LED Vertical Illumination Table for Algal Toxicity Tests) ontwikkeld. De setup maakt gebruik van LED-verlichting van onderen waardoor een homogene lichtverdeling en temperatuurregeling, terwijl ook het minimaliseren van intra-monster arcering. De opstelling optimaliseert het monstervolume voor biomassakwantificering en zorgt tegelijkertijd voor een voldoende instroom van CO₂ om de exponentiële groei van de algen te ondersteunen. Bovendien kan het materiaal van de testcontainers worden aangepast om adsorptie en vervluchtiging te minimaliseren. Bij het testen van gekleurde stoffen of deeltjessuspensies, het gebruik van LED-verlichting maakt het ook mogelijk voor het verhogen van de lichtintensiteit zonder extra warmteopwekking. Het compacte ontwerp en de minimale apparatuurvereisten vergroten de mogelijkheden voor de implementatie van de LEVITATT in een breed scala aan laboratoria. Hoewel levitatt voldoet aan de gestandaardiseerde ISO- en OESO-richtlijnen voor algentoxiciteitstests, vertoonde het ook een lagere variabiliteit tussen de monsters voor twee referentiestoffen (3,5-Dicholorophenol en K₂Cr₂O₇) en drie nanomaterialen (ZnO, CeO₂en BaSO₄) in vergelijking met Erlenmeyer-kolfjes en microtiterplaten.

Inleiding

De algentoxiciteitstest is een van de slechts drie verplichte tests die worden gebruikt om de ecotoxiciteitsgegevens te genereren die nodig zijn voor de pre- en post-market registratie van chemische stoffen door Europese en internationale regelgeving (bijvoorbeeld REACH¹ en TSCA (VS)). Hiervoor zijn gestandaardiseerde algentestrichtlijnen ontwikkeld door internationale organisaties (bijvoorbeeld ISO en OESO). Deze testnormen en richtlijnen schrijven ideale testomstandigheden voor in termen van pH, temperatuur, kooldioxideniveaus en lichtintensiteit. Het handhaven van stabiele testomstandigheden tijdens algentesten is in de praktijk echter moeilijk en de resultaten lijden aan problemen met reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid voor een reeks chemische stoffen en nanomaterialen (vaak aangeduid als "moeilijke stoffen")². De meeste van de bestaande algentoxiciteit testen setups werken met relatief grote volumes (100-250 mL) gelegen op een orbitale shaker in een incubator. Een dergelijke opstelling beperkt het aantal testconcentraties en repliceert haalbare en grote hoeveelheden algencultuur en testmateriaal. Bovendien hebben deze opstellingen zelden een uniform lichtveld en zijn de betrouwbare lichtomstandigheden bovendien moeilijk te verkrijgen in grote kolven, deels omdat de lichtintensiteit exponentieel afneemt naarmate het licht verder reist en deels door de kolfgeometrie. Alternatieve opstellingen omvatten kunststof microtiter^3-platen met kleine monstervolumes die niet in staat zijn om voldoende bemonsteringsvolumes mogelijk te maken om pH, aanvullende biomassametingen, pigmentextractie of andere analyses die destructieve bemonstering vereisen, te meten. Een bijzondere uitdaging met behulp van bestaande opstellingen voor algentoxiciteit testen van nanomaterialen en stoffen die gekleurde suspensies vormen is de interferentie of het blokkeren van het licht beschikbaar voor de algencellen, vaak aangeduid als "arcering"^4,5. Arcering kan optreden in flacons door het testmateriaal en/of interacties tussen het testmateriaal en de algencellen, of arcering kan optreden tussen flacons, vanwege hun positionering ten opzichte van elkaar en de lichtbron.

De methode is gebaseerd op de kleinschalige algentoxiciteitstest die Arensberg et al.⁶ heeft geïntroduceerd en die het mogelijk maakt om te testen in overeenstemming met normen zoals OESO 201⁷en ISO 8692⁸. De methode is verder geoptimaliseerd om de hierboven genoemde beperkingen aan te pakken door: 1) gebruik te maken van de LED-lichttechnologie om uniforme lichtomstandigheden te garanderen met minimale warmteopwekking, 2) het verstrekken van voldoende monstervolume voor chemische / biologische analyse met behoud van constante pH, CO₂ niveaus, en 3) waardoor het gebruik van veelzijdige testcontainer materiaal voor het testen van vluchtige stoffen of stoffen met een hoog sorptiepotentieel.

Protocol

1. Beschrijving van de LEVITATT-instelling

1. Gebruik 20 mL scintillatie glazen flacons(figuur 1, insert 1) waardoor licht penetratie. Als alternatief kunnen lichte penetrable plastic flacons worden gebruikt. Kwantificeer de lichtintensiteit met behulp van een fotometer.
2. Gebruik aan het begin van de test ten minste een testsuspensie van 4 mL om de kwantificering van biomassa mogelijk te maken en voor de karakterisering/kwantificering van nanomaterialen tijdens en na incubatie(figuur 1, wisselplaat 2).
3. Plaats de 20 mL scintillatiefluiden met een dop(figuur 1, insert 3) waar een klein gaatje wordt geboord (ongeveer 1 mm in diameter) om CO_{2-uitwisseling} met de atmosfeer mogelijk te maken. Deze uitwisseling is cruciaal om een stabiele pH- en CO_2-niveaus tijdens het testen te garanderen.
4. Gebruik voor vluchtige stoffen een luchtdichte Teflon gecoate dop om CO_2-verrijking van de hoofdruimte mogelijk te maken met behulp van een spuit⁹ of volledig gesloten kolven zonder gasfase waarin CO₂ in oplossing wordt gehouden door een verrijkt natriumbicarbonaat (NaHCO₃) buffersysteem¹⁰.
5. Bevestig de flacons met klemmen gemonteerd op de buitenbehuizing(figuur 1, insert 4).
6. Gebruik een LED-lichtbron onder de testflinzen(figuur 1, insert 5) met een uniforme fluorescerende verlichting van het type "koel-wit" of "daglicht" en een lichtintensiteit in het bereik van 60-120 μE∙m^-2∙s^-1 gemeten in het fotosynthetisch effectieve golflengtebereik van 400 nm tot 700 nm. De setup maakt gebruik van instelbare lichtintensiteit in het bereik van 5-160 μE∙m^-2∙s^-1 door een lichtdimdimer aan de bron te monteren. Dit maakt het mogelijk om te testen bij hogere en lagere lichtintensiteiten.
7. Monteer de setup op een orbitale shaker om monsters te ageren gedurende de duur van de test. Dit houdt de cellen in vrije suspensie en vergemakkelijkt co₂ massa overdracht van lucht naar water (Figuur 1, insert 6).
8. Plaats de opstelling in een temperatuurgestuurde ruimte of een thermostatische kast om stabiele temperaturen te behouden tijdens het testen(figuur 1, insert 7).

Figuur 1: Afbeelding van LED Vertical Illumination Table for Algal Toxicity Tests (LEVITATT). 1) 20 mL glas scintillatie flacons voor incubatie, 2) 4 mL monster voor analyse, 3) deksel met geboord gat voor CO₂ uitwisseling, 4) behuizing voor bepaalde lichtomstandigheden, 5) LED-lichtbron gelegen in het midden van de behuizing, 6) orbitale shaker voor agitatie tijdens het experiment, en 7) een thermostatische kast. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

2. Voorbereiding van algengroeimedium

1. Het ISO 8692 algengroeimedium bestaat uit vier verschillende voorraadoplossingen. Weeg de juiste hoeveelheid zouten af en verdun in ultrazuiver water volgens tabel 1.

Voorraadoplossingen	Nutriënten	Concentratie in voorraadoplossing	Concentratie in testoplossing
1: Macronutriënten	NH4Cl	1,5 g/L	15 mg/L (N: 3,9 mg/L)
	MgCl2∙6H2O	1,2 g/L	12 mg/L (Mg: 2,9 mg/L)
	CaCl2∙2H2O	1,8 g/L	18 mg/L (Ca: 4,9 mg/L)
	MgSO4∙7H2O	1,5 g/L	15 mg/L (S: 1,95 mg/L)
	KH2PO4	0,16 g/L	1,6 mg/L (P: 0,36 mg/L)
2: Fe-EDTA	FeCl3∙6H2O	64 mg/L	64 μg/L (Fe: 13 μg/L)
	Na2EDTA∙2H2O	100 mg/L	100 μg/L
3: Trace elementen	H3BO3a	185 mg/L	185 μg/L (B: 32 μg/L)
	MnCl2∙4H2O	415 mg/L	415 μg/L (Mn: 115 μg/L)
	ZnCl2	3 mg/L	3 μg/L (Zn: 1,4 μg/L)
	CoCl2∙6H2O	1,5 mg/L	1,5 μg/L (Co: 0,37 μg/L)
	CuCl2∙2H2O	0,01 mg/L	0,01 μg/L (Cu: 3,7 ng/L)
	Na2MoO4∙2H2O	7 mg/L	7 μg/L (Mo: 2,8 μg/L)
4: NaHCO3	NaHCO3	50 g/L	50 mg/L (C: 7,14 mg/L)

Tabel 1: Concentraties van voedingsstoffen in voorraadoplossingen voor algengroeimedium

LET OP: H₃BO₃ kan worden opgelost door 0,1 M NaOH toe te voegen. EDTA moet worden verwijderd bij het testen van metalen, om te voorkomen dat complexatie met metalen ionen. Steriliseer de voorraadoplossingen door membraanfiltratie (gemiddelde poriediameter 0,2 μm) of door autoclaving (120 °C, 15 min). Doe geen autoclave voorraad oplossingen 2 en 4, maar steriliseren ze door membraanfiltratie. Bewaar de oplossingen in het donker op 4 °C.

2. Voor de productie van 1 L algengroeimedium, breng 500 mL gesteriliseerd ultrazuiver water in een 1 L gesteriliseerde volumetric kolf en voeg 10 mL voorraadoplossing 1: Macronutriënten, 1 mL voorraadoplossing 2: Fe-EDTA, 1 mL voorraadoplossing 3: Trace elementen en 1 mL voorraadoplossing 4: NaHCO₃.
3. Vul tot 1 L met gesteriliseerd ultrazuiver water, stop de kolf en schud grondig om het algengroeimedium te homogeniseren.
4. Equilibrate de oplossing voor gebruik door het 's nachts in contact te laten met lucht of door te borrelen met steriele, gefilterde lucht gedurende 30 minuten. Pas na evenwicht de pH indien nodig aan op pH 8,1 ± 0,2, met 1 M HCl of 1 M NaOH.

3. Instelling van de algentest

OPMERKING: In figuur 2wordt een stroomdiagram van de algentestprocedure weergegeven.

Figuur 2: Stroomdiagram van de algentestopstelling. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

1. Bereid een voorraadoplossing van de teststof voor bij de gewenste hoogste testconcentratie in het algengroeimedium dat volgens stap 2 is bereid. Voor de voorbereiding van voorraadoplossingen/-schorsingen volgt u OESO 201 (voor oplosbare verbindingen) of OESO 318 (voor nanomaterialen).
2. Meet de pH in de voorraadoplossing. Als het meer dan één eenheid afwijkt van het algengroeimedium, past u de pH aan op 8 met 1 M HCl of 1 M NaOH.
3. Bereken het entmateriaalvolume dat nodig is om een uiteindelijke celconcentratie van 1 x 10⁴ cellen/mL te bereiken in een testoplossing van 25 mL.
   OPMERKING: Het entmateriaal moet afkomstig zijn van een cultuur van niet-verontreinigde exponentieel groeiende Raphidocelis subcapitata geteeld met behulp van de LEVITATT setup.
4. Bereken de hoeveelheid voorraadoplossing om aan elke 25 mL volumetrische kolf toe te voegen om de gewenste testconcentraties te verkrijgen. De factor tussen elke concentratie mag niet meer bedragen dan 3,2.
5. Markeer één volumekolf van 25 mL voor elke gekozen concentratie en een extra 25 mL volumetricmkolf gemarkeerde regeling.
6. Voeg de hoeveelheid voorraadoplossing van de testverbinding toe die nodig is om de gewenste concentraties te bereiken aan de 25 mL volumetrische kolf. Voeg geen voorraadoplossing toe aan het besturingselement.
7. Voeg het medium toe aan elke 25 mL volumetrische kolf om een volume van ongeveer 20 mL te bereiken.
8. Voeg het volume van het entmateriaal berekend in stap 3.3 toe aan elke 25 mL volumetrice kolf. Voeg het medium toe aan elke volumekolf van 25 mL tot een uiteindelijk totaal volume van 25 mL.
9. Stop de kolven en meng grondig door de kolven twee keer verticaal te draaien.
10. Breng 0,4 mL van elke kolf over in afzonderlijke schroefdopflesjes en voeg 1,6 mL aceton toe (verzadigd met MgCO_3):één monster voor elke testconcentratie en de controle. Sluit de deksels goed en bewaar in het donker bij kamertemperatuur tot fluorescentiemetingen (sectie 4).
11. Pipet 4 mL van elke testoplossing in 20 mL scintillatie flacons (3 repliceert per concentratie en 5 replica's voor de controle). Schroefdeksels op de scintillatie flesjes. Vergeet niet dat de deksels een geboord gat (ongeveer 1 mm in diameter) moeten hebben om CO_{2-uitwisseling} mogelijk te maken.
12. Na 24 uur, 48 uur en 72 uur, pipet 0,4 mL van elke flacon in schroefdop flacons en voeg 1,6 mL aceton (verzadigd met MgCO₃). Sluit de deksels goed en bewaar in het donker bij kamertemperatuur tot fluorescentiemetingen (sectie 4).
13. Nadat het laatste monster is genomen om 72 uur, veromzelt u voorzichtig de drie replica's voor een bepaalde concentratie in één flacon en meet de pH. Herhaal dit voor alle concentraties en de controle. De pH mag voor geen van de gemeten monsters meer dan 1,5 eenheden afwijken van de initiële pH.
14. Lozing de resterende vloeistoffen in een afvalcontainer volgens uw institutionele regels en voorschriften.

4. Analyse van algentestmonsters

1. Gebruik een fluorescentiespectrometer om de algenbiomassa te meten (hier uitgedrukt als chlorofyl A). De piekemissie voor chlorofyl A is 420 nm voor de excitatiegolflengte en 671 nm voor de emissiegolflengte.
2. Meet de fluorescentie van elk afzonderlijk monster drie keer en bereken de gemiddelde waarde voor elk monster.
3. Gebruik vergelijking 1 om het groeipercentage te berekenen. De gemeten fluorescentie (relatieve eenheden) kan direct worden gebruikt als de biomassaparameter in vergelijking 1.
   Vergelijking 1: μ = (in N_t – ln N₀) / t
   waar μ het groeipercentage is (d^-1), is N₀ de eerste biomassa, N_t is de biomassa op het moment t, en t is de lengte van de testperiode (d). Let op, N₀ en N_t moeten in dezelfde eenheid worden uitgedrukt.
4. Gebruik een statistische software om een niet-lineaire regressiecurve (bijvoorbeeld een log-logistic of Weibull-functie) aan te passen aan de groeisnelheidsgegevens om effectieve concentratiewaarden te verkrijgen bij 10%, 20% en 50% remming. In de aanvullende informatie wordt een voorbeeld gegeven van code voor het passen in de statistische software R met behulp van het DRC-pakket^11.

Resultaten

Er wordt een eerste test met een referentiestof uitgevoerd om de gevoeligheid van de algenstam te bepalen. Referentiestoffen die regelmatig voor R. subcapitata worden gebruikt, zijn kaliumdichromaat en 3,5-Dichloodfenol^7,8. Figuur 3 en tabel 2 laten een representatief resultaat zien van een algentest, met inbegrip van curvefitting en statistische output wanneer het DRC-pakket in R wordt toegepast op de groei...

Discussie

Fytoplankton zet zonne-energie en kooldioxide om in organisch materiaal en speelt daarmee een centrale rol in het aquatische ecosysteem. Om deze reden worden algengroeiremmingstests opgenomen als een van de drie verplichte aquatische toxiciteitstests die nodig zijn voor de wettelijke risicobeoordeling van chemische stoffen. De mogelijkheid om een betrouwbare en reproduceerbare algentoxiciteitstest uit te voeren is in dit verband essentieel. Testopstellingen met Erlenmeyer-kolven introduceert een reeks variabiliteiten en ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Acetone	Sigma-Aldrich	V179124
Ammoniumchloride	Sigma-Aldrich	254134
BlueCap flessen (1L)	Buch & Holm A/S	9072335
Boorzuur	Sigma-Aldrich	B0394
Calciumchloridedihydraat	Sigma-Aldrich	208290
Doorzichtige acrylplaat (40x40 cm)
Kobalt(II)chloride hexahydraat	Sigma-Aldrich	255599
Koper(II)chloridedihydraat	Sigma-Aldrich	307483
Etheen-diaminetetraazijnzuur dinatriumzout dihydraat	Sigma-Aldrich	E5134
Fluorescentiespectrofotometer F-7000	Hitachi
Zoutzuur	Sigma-Aldrich	258148
IJzer(III)chloride hexahydraat	Sigma-Aldrich	236489
LED-lichtbron	Helmholt Elektronik A/S	H35161	Neutraal Wit, 6500K
Magnesiumchloride hexahydraat	Sigma-Aldrich	M9272
Magnesiumsulfaat heptahydraat	Sigma-Aldrich	230391
Mangaan(II)chloride tetrahydraat	Sigma-Aldrich	221279
Orbitaal shaker	IKA	2980200
Kaliumfosfaat monobasic	Sigma-Aldrich	P0662
Raphidocelis subcapitata	NORCCA		NIVA-CHL1 strain
Scintillatieglasjes (20 mL)	Fisherscientific	11526325
Natriumbicarbonaat	Sigma-Aldrich	S6014
Natriumhydroxide	Sigma-Aldrich	415413
Natriummolybdaat dihydraat	Sigma-Aldrich	331058
Vederklem	Frederiksen Scientific A/S	472002
Thermostaatkast	VWR	WTWA208450	Alternatief: temperatuur gecontroleerde ruimte
Ventilatiepijp (Ø125 mm)	Silvan	22605630165
Volumetrische kolven (25 mL)	DWK Life Sciences	246781455
Zinkchloride	Sigma-Aldrich	208086