Methodenartikel

Directe vloeistofcultuurscreening voor het evalueren van de productie van heterologe eiwitten met behulp van een auxotrofe mutant van Aspergillus oryzae

2.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61219

⸱

12 mei 2020

 , 
1Honda Research Institute Japan Co., Ltd.

In dit artikel

Samenvatting

Er is een screeningsmethode voor directe vloeistofcultuur (DLC) ontwikkeld die de tijd die nodig is voor polyethyleenglycol (PEG)-gemedieerde protoplasttransformatie van de filamenteuze schimmel, Aspergillus oryzae, aanzienlijk verkort wanneer deze wordt gebruikt voor de evaluatie van de secretoire productie van heterologe eiwitten. Deze methode verhoogt de doorvoer van het evaluatieprotocol drastisch.

Samenvatting

Aspergillus oryzae, een filamenteuze schimmel, is een van de meest gebruikte gastheren voor industriële toepassingen, waaronder grootschalige productie van eiwitten. Een polyethyleenglycol (PEG)-gemedieerde protoplasttransformatiemethode wordt over het algemeen gebruikt voor de introductie van heterologe genen in A. oryzae. De conventionele methode vereist doorgaans drie weken voor het screenen van gunstige transformatoren. Hier wordt een nieuwe techniek geïntroduceerd, de directe vloeistofcultuur (DLC) screeningsmethode, die de screeningstijd verkort tot zes dagen in een kolfformaat van 200 ml of tot 10 dagen in een microplaatformaat met 24 putjes. De DLC-screeningmethode zorgt voor het verwerven van positieve transformanten en evaluatie van de secretoire productie van heterologe eiwitten in één stap, in tegenstelling tot de conventionele screeningmethode waarbij twee afzonderlijke stappen nodig zijn voor hetzelfde. Het protocol voor PEG-gemedieerde protoplasttransformatie van A. oryzae wordt beschreven, dat bestaat uit vijf stappen: bereiding van verse sporensuspensie, precultuur, bereiding van protoplasten, introductie van DNA en DLC-screening. Voor succesvolle resultaten bij DLC-screening is het van cruciaal belang om een voedingsstofrijk medium met geoptimaliseerde osmotische druk te gebruiken. Het protocol moet het gebruik van A. oryzae als een favoriete gastheer bij de industriële productie van eiwitten verder populariseren.

Inleiding

Aspergillus oryzae is een belangrijk micro-organisme in de Japanse voedingsindustrie dat al meer dan 1.000 jaar wordt gebruikt bij de productie van gefermenteerd voedsel, zoals sake (rijstwijn), shoyu (sojasaus) en miso (sojabonenpasta)1,2. Het heeft het vermogen om een grote hoeveelheid eiwitten af te scheiden, zoals proteasen en amylasen3. Genoomsequentie-informatie voor A. oryzae is ook beschikbaar4. Bovendien zijn er krachtige en praktisch bruikbare genetische manipulatietechnieken ontwikkeld voor deze schimmel 5,6,7,8,9,10. Gunstige transformanten zijn gebruikt als gastheren voor secretoire productie van heterologe eiwitten 11,12,13,14.

Elektroporatie, Agrobacterium-gemedieerde transformatie en polyethyleenglycol (PEG)-gemedieerde protoplasttransformatie zijn de technieken die worden gebruikt voor het introduceren van heterologe genen in A. oryzae 15,16,17. De PEG-gemedieerde protoplasttransformatiemethode wordt op grote schaal gebruikt sinds deze voor het eerst werd gerapporteerd voor Neurospora crassa in 197918. Bij deze methode worden protoplasten bereid en gemengd met PEG en het heterologe gen dat in de cellen moet worden ingebracht. De wanden van protoplasten zijn enzymatisch aangetast, waardoor de cellen kwetsbaar zijn voor fysieke stress en veranderingen in osmotische druk19,20. De conventionele screeningsmethode die wordt gebruikt bij de secretoire productie van heterologe eiwitten omvat drie stappen: acquisitie van positieve transformanten (op zachte agarplaat), selectie van echte en valse transformanten (op agarplaat) en evaluatie van de secretoire productie van heterologe eiwitten (in vloeibare cultuur); elk van deze stappen duurt zeven dagen (Figuur 1). De conventionele methode duurt dus doorgaans ongeveer drie weken.

De tijd die nodig is voor het screenen van getransformeerde A. oryzae-cellen is veel langer dan die nodig is voor andere micro-organismen die vaak worden gebruikt in biotechnologisch onderzoek, waardoor het proces omslachtiger wordt. Bij gebruik van Escherichia coli als gastheer duurt het bijvoorbeeld ongeveer twee dagen vanaf de introductie van DNA tot de bevestiging van het effect21.

Om de beperking die gepaard gaat met het gebruik van A. oryzae zoals hierboven vermeld te omzeilen, wordt hierin een nieuwe screeningsmethode voor directe vloeibare cultuur (DLC) geïntroduceerd, die een snellere en eenvoudigere screening mogelijk maakt voor de evaluatie van de secretoire productie van heterologe eiwitten (Figuur 1). In de DLC-methode worden een uridine auxotrofe mutant en een voedingsrijk vloeibaar medium gebruikt. Met behulp van deze methode kan de screeningsstap worden voltooid binnen zes dagen na de introductie van DNA in de protoplasten in een kolfformaat van 200 ml of binnen 10 dagen in een microtiterplaatformaat met 24 putjes. Bovendien is de tijdrovende en arbeidsintensieve bereiding van agarplaatmedia bij deze methode niet nodig. Er is een enorm voordeel bij het gebruik van de nieuw beschreven methode, vooral gezien het feit dat de conventionele methode twee verschillende media vereist: de zachte agarplaat voor het verkrijgen van positieve transformatoren, die zorgvuldige behandeling en temperatuurregeling vereist, en vaste agarplaat voor de selectie van echte transformatoren.

figure-introduction-1
Figuur 1: Schema van polyethyleenglycol (PEG)-gemedieerde protoplasttransformatie van de filamenteuze schimmel, Aspergillus oryzae.
(Bovenste paneel) Conventionele screeningsmethode. (Onderste paneel) Directe screeningsmethode voor vloeistofcultuur (DLC). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Bereiding van verse sporensuspensie

  1. Inoculeer 20 μl van een voorraad sporensuspensie (1 x 107 sporen/ml) in het midden van een kweekplaat met Czapek-Dox (CD) medium met 20 mM uridine (geautoclaveerd bij 121 °C gedurende 20 min, tabel 1).
  2. Incubeer gedurende 7 dagen bij 30 °C om de vorming van sporen te bevorderen.
  3. Voeg 1,5 ml 0,01 % Tween 20-oplossing (geautoclaveerd bij 121 °C gedurende 20 min) toe aan de sporenkweekplaat en suspendeer de sporen door ze met een celverspreider te schrapen.
  4. Verzamel de sporensuspensie met behulp van een pipet in een steriel microcentrifugebuisje van 1,5 ml.
  5. Bewaar de suspensie tot gebruik bij 4 °C.
    OPMERKING: Gebruik de sporensuspensie in de volgende procedure binnen 2 weken. Om een bouillon te maken voor langdurige opslag, voegt u glycerol toe aan de sporensuspensie tot een eindconcentratie van 15% en bewaart u deze bij -80 °C.

2. Precultuur

  1. Voeg 100 ml polypepton-dextrine (PD) medium (tabel 2) toe aan een erlenmeyer van 500 ml en autoclaaf deze gedurende 20 minuten bij 121 °C.
  2. Nadat u hebt bevestigd dat de temperatuur van het medium is verlaagd, voegt u de uridine-oplossing toe, gesteriliseerd door een filter met een poriegrootte van 0,22 μm te leiden, tot een uiteindelijke concentratie van 20 mM.
  3. Voeg 200 μl van de sporensuspensie (1 x 107 sporen/ml) toe, bereid in stap 1.4, en incubeer bij 30 °C met schudden bij 120 tpm gedurende 36 uur.

3. Bereiding van protoplasten

  1. Oogst de in stap 2.3 voorbereide schimmelbiomassa op een glasfilter met een poriegrootte van 30 μm (geautoclaveerd bij 121 °C gedurende 20 min).
  2. Giet 100 ml gedestilleerd water (DW) (geautoclaveerd op 121 °C gedurende 20 min) op de glasfilter en roer meerdere keren met een spatel (geautoclaveerd op 121 °C gedurende 20 min).
  3. Giet na het wassen met DW 100 ml natriumchloride (NaCl) buffer (geautoclaveerd bij 121 °C gedurende 20 min, tabel 3) op de glasfilter en roer meerdere keren met een spatel.
  4. Breng ongeveer 1-2 ml (nat volume) van de cellen over in een conische buis van 50 ml met behulp van een spatel (geautoclaveerd bij 121 °C gedurende 20 min).
  5. Na het toevoegen van 15 ml van de enzymoplossing (gesteriliseerd door het passeren van een filter ter grootte van een porie van 0,22 μm, tabel 4) aan een conische buis van 50 ml, voegt u NaCl-buffer toe totdat het totale volume 30 ml bereikt.
  6. Sluit het deksel en sluit af met paraffinefolie. Incubeer bij 30 °C en schud gedurende 2 uur bij 60 tpm.
  7. Laat de resulterende oplossing door een celzeef van 70 μm stromen die is bevestigd aan de conische buis van 50 ml om de niet-gereageerde mycelium te verwijderen.
  8. Centrifugeer de protoplastoplossing in een conische buis van 50 ml bij 2.150 x g en 4 °C gedurende 20 min.
  9. Gooi het bovenstaande voorzichtig weg om te voorkomen dat de pellet losraakt. Voeg 1 ml ijskoude gesteriliseerde oplossing B toe (geautoclaveerd bij 121 °C gedurende 20 min, tabel 5) en suspendeer de neergeslagen protoplasten voorzichtig door te pipetteren.
  10. Breng de gesuspendeerde protoplasten over in een steriele buis van 1,5 ml.
  11. Centrifugeer bij 2.220 x g en 4 °C gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant. Voeg vervolgens 1 ml ijskoude oplossing B toe en suspendeer de pellet voorzichtig door te pipetteren.
  12. Herhaal stap 3.9.
  13. Meet met behulp van een hemocytometer het aantal protoplasten onder een microscoop.
  14. Bereid een protoplastsuspensie (1−3 x 107 protoplasten/ml) in oplossing B en bewaar deze op ijs tot gebruik.
    OPMERKING: Gebruik de protoplastuspensie onmiddellijk in de volgende procedure.

4. Introductie van DNA voor secretoire productie van eiwitten

  1. Met behulp van een plasmide met een DNA-cassette voor secretoire productie van eiwit als sjabloon, wordt het DNA-fragment dat nodig is voor secretoire productie door PCR geamplificeerd.
  2. Bereid het DNA-monster voor op transformatie door het PCR-product te verwerken met behulp van een PCR-zuiveringskit.
  3. Voeg 1 ml protoplastoplossing, 200 μl oplossing C (geautoclaveerd bij 121 °C gedurende 20 min, tabel 6) en 50 μl van het DNA-monster (0,5-1 μg/μl) toe in een steriele, voorgekoelde conische buis van 15 ml en meng de oplossing voorzichtig door te pipetteren.
    OPMERKING: Oplossing C is zeer stroperig en kan moeilijk te hanteren zijn; Zorg voor een grondige menging door middel van pipetteren.
  4. Incubeer de buis 30 minuten op ijs.
  5. Voeg 1,5 ml oplossing C toe, meng voorzichtig door te pipetteren en laat de oplossing vervolgens 20-30 minuten op kamertemperatuur staan.

5. Directe screening van vloeibare cultuur

OPMERKING: Selecteer het kweeksysteem met behulp van erlenmeyers (punt 5.1) of microtiterplaten (punt 5.2).

  1. Kweeksysteem met een erlenmeyer van 200 ml
    1. Voeg 50 ml PD-medium met 0,8 M sorbitol toe aan een erlenmeyer van 200 ml en steriliseer door middel van autoclaveren bij 121 °C gedurende 20 min.
    2. Nadat is gecontroleerd of de temperatuur van het medium is verlaagd, voegt u de in stap 4.5 voorbereide protoplastsuspensie toe aan een eindconcentratie van 1 x 105 protoplasten/ml.
    3. Incubeer de cultuur gedurende 6 dagen bij 30 °C met schudden bij 120 rpm.
    4. Vang 1 ml van het medium op en bewaar in een tube van 1,5 ml bij 4 °C. Bewaar het kweekmonster bij -20 ° C, als het niet onmiddellijk wordt geanalyseerd.
    5. Meng 20 μL kweekmonster en 20 μL natriumdodecylsulfaat (SDS) monsterbuffer (Tabel 7) in een buis van 1,5 ml en kook bij 95 ° C gedurende 5 min.
    6. Laad na afkoeling op ijs 20 μL van het gekookte monster en 5 μL voorgekleurd eiwit standaard op een geprefabriceerde gel en analyseer de secretoire productie van het heterologe doeleiwit door natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE)10.
  2. Kweeksysteem met behulp van een microplaat met 24 putjes
    1. Voeg de in stap 4.5 bereide protoplastsuspensie toe aan het gesteriliseerde 0,8 M sorbitolhoudende PD-medium tot een eindconcentratie van 1 x 105 protoplasten/ml en meng voorzichtig door te pipetteren.
    2. Voeg 1 ml van de in stap 5.2.1 bereide oplossing toe aan drie putjes in een microplaat met 24 putjes.
    3. Bevestig het deksel en incubeer bij 30 °C en schud gedurende 10 dagen bij 175 omw/min.
    4. Verzamel 1 ml medium en bewaar in een tube van 1,5 ml bij 4 ° C. Bewaar het kweekmonster bij -20 ° C, indien niet onmiddellijk geanalyseerd.
    5. Meng 20 μL van het kweekmonster en 20 μL SDS-monsterbuffer in een buis van 1,5 ml en kook 5 minuten bij 95 ° C.
    6. Na afkoeling op ijs, laadt u 20 μL van het gekookte monster en 5 μL voorgekleurd eiwit standaard op een geprefabriceerde gel en analyseert u de secretoire productie van het doelheterologe eiwit door SDS-PAGE10.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De resultaten voor de introductie van de DNA-expressiecassettecodering voor Talaromyces cellulolyticus cellobiohydrolase (CBH: GenBank Accession Number E39854) in een uridine-auxotroop van A. oryzae stam HO422 en screening op de secretoire productie van het heterologe eiwit worden hieronder beschreven.

Bereiding van verse sporensuspensie

De uiteindelijke opbrengst van sporen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

We hebben een systeem ontwikkeld dat het mogelijk maakt om A. oryzae-transformatoren sneller te screenen dan de conventionele methode, door vloeistofcultuur van de protoplasten uit te voeren. Het meest kritische aspect van deze methode is de osmotische druk van het vloeibare medium. De osmotische druk die geschikt is voor vloeibare cultuur werd geoptimaliseerd met behulp van sorbitol. De groei van A. oryzae stam HO4 was het meest actief in aanwezigheid van 0,8 M sorbito...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs erkennen Rinkei Okano voor zijn hulp bij de experimenten. De auteurs danken professor Katsuya Gomi van de Tohoku University en professor Masayuki Machida van het Kanazawa Institute of Technology voor waardevolle discussies. Dit werk werd gefinancierd door Honda Research Institute Japan Co., Ltd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 M NaOHNACALAI TESQUE, INC.37421-05
1 M Tris-HCl (pH 7.5)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation318-90225
1 M Tris-HCl (pH 6.8)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation2106-100
1.5-mL Microcentrifuge tubeAS ONE Corporation1-1600-03
15-mL Conical centrifuge tubeBecton, Dickinson and Company352196
2-mercaptoethanolBio-Rad Laboratories, Inc.1610710
24-well MicroplateAGC TECHNO GLASS CO., LTD.3820-024
50-mL Conical centrifuge tubeBecton, Dickinson and Company352070
70-µm Cell strainerBecton, Dickinson and Company352350
AgarFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation010-15815
AutoclaveTOMY SEIKO CO.,LTD.LSX-700
Bromophenol blueFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation021-02911
CaCl2FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation038-24985
Casamino acidFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation393-02145
Cellulase R-10Cosmo Bio Co., Ltd.16419
Dextrin hydrateFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation044-00585
D-SorbitolFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation191-14735
e-PAGELATTO CORPORATIONE-T/R1020LGebruikt voor precast gel in SDS-PAGE
Electrophoresis deviceATTO CORPORATIONWSE-1150Gebruikt voor SDS-PAGE
FeSO4·7H2OFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation098-01085
Glass filter 17G3Tokyo Garasu Kikai Co., Ltd.0000094147
GlycerolFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation070-04941
HemocytometerFunakoshi Co., Ltd.521-10
High speed refrigerated centrifugeKUBOTA CORPORATION7780Gebruikt voor centrifugatie van monsters in 50-mL conische centrifugeerbuizen
IncubatorTAITEC CORPORATION.G·BR-200Gebruikt voor vloeistofcultuur in kolven en bereiding van protoplasten
IncubatorTAITEC CORPORATION.BR-43FLGebruikt voor vloeistofcultuur in microplates en plaatcultuur
KClFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation163-03545
KH2PO4NACALAI TESQUE, INC.28721-55
Lysing enzymeSigma-AldrichL1412-10G
MgSO4·7H2OFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation131-00405
Micro refrigerated centrifugeKUBOTA CORPORATION3740Gebruikt voor centrifugatie van monsters in 1,5-mL microcentrifugebuizen
MicroscopeLeica MicrosystemsDMI6000 B
NaClFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation190-13921
NaH2PO4·2H2ONACALAI TESQUE, INC.31718-15
NaNO3FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation195-02545
Parafilm MBemis Company, IncPM-996
PCR Purification KitQIAGEN K.K28104
Petri dishSumitomo Bakelite Co., Ltd.MS-11900Gebruikt als kweekplaat
Polyethylene glycolSigma-AldrichP3640-500G
Polypeptone peptoneBecton, Dickinson and Company211910
Protein laddersBio-Rad Laboratories, Inc.161-0377Gebruikt als molecuulgewichtsmarker in SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulfateBio-Rad Laboratories, Inc.1610301
Sterile filterMerck KGaASLGP033RB
SucroseNACALAI TESQUE, INC.30404-45
Tween 20Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.T0543
UridineSigma-AldrichU3750-25G
YatalaseTakara Bio Inc.T017

Referenties

  1. Tsuboi, H., et al. Improvement of the Aspergillus oryzae enolase promoter (P-enoA) by the introduction of cis-element repeats. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 69, 206-208 (2005).
  2. Nemoto, T., Maruyama, J. -I., Kitamoto, K. Contribution ratios of amyA, amyB, amyC genes to high-level α-amylase expression in Aspergillus oryzae. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 76, 1477-1483 (2012).
  3. Shinkawa, S., Mitsuzawa, S. Feasibility study of on-site solid-state enzyme production by Aspergillus oryzae. Biotechnology for Biofuels. 13, 31(2020).
  4. Machida, M., et al. Genome sequencing and analysis of Aspergillus oryzae. Nature. 438 (7071), 1157-1161 (2005).
  5. Veenstra, A. E., van Solingen, P., Bovenberg, R. A. L., vander Voort, L. H. M. Strain improvement of Penicillium chrysogenum by recombinant DNA techniques. Journal of Biotechnology. 17 (1), 81-90 (1991).
  6. Takahashi, T., Masuda, T., Koyama, Y. Enhanced gene targeting frequency in ku70 and ku80 disruption mutants of Aspergillus sojae and Aspergillus oryzae. Molecular Genetics and Genomics. 275 (5), 460-470 (2006).
  7. Mizutani, O., et al. A defect of LigD (human Lig4 homolog) for nonhomologous end joining significantly improves efficiency of gene-targeting in Aspergillus oryzae. Fungal Genetics and Biology. 45 (6), 878-889 (2008).
  8. Bergès, T., Barreau, C. Isolation of uridine auxotrophs from Trichoderma reesei and efficient transformation with the cloned ura3 and ura5 genes. Current Genetics. 19 (5), 359-365 (1991).
  9. Takeno, S., et al. Cloning and sequencing of the ura3 and ura5 genes, and isolation and characterization of uracil auxotrophs of the fungus Mortierella alpina 1S-4. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 68 (2), 277-285 (2004).
  10. Ji, Y. W., et al. Application of membrane filtration method to isolate uninuclei conidium in Aspergillus oryzae transformation system based on the pyrG marker. Food Science and Biotechnology. 22 (1), 93-97 (2013).
  11. Mitsuzawa, S., Fukuura, M., Shinkawa, S., Kimura, K., Furuta, T. Alanine substitution in cellobiohydrolase provides new insights into substrate threading. Scientific Reports. 7 (1), 16320(2017).
  12. Fleissner, A., Dersch, P. Expression and export: recombinant protein production systems for Aspergillus. Applied Microbiology and Biotechnology. 87, 1255-1270 (2010).
  13. Yoon, J., Maruyama, J. -I., Kitamoto, K. Disruption of ten protease genes in the filamentous fungus Aspergillus oryzae highly improves production of heterologous proteins. Applied Microbiology and Biotechnology. 89, 747-759 (2011).
  14. Lin, H., et al. Engineering Aspergillus oryzae A-4 through the chromosomal insertion of foreign cellulase expression cassette to improve conversion of cellulosic biomass into lipids. PLoS One. 9, 108442(2014).
  15. Chakraborty, B. N., Patterson, N. A., Kapoor, M. An electroporation-based system for high-efficiency transformation of germinated conidia of filamentous fungi. Canadian Journal of Microbiology. 37 (11), 858-863 (1991).
  16. Sun, Y., et al. A dual selection marker transformation system using Agrobacterium tumefaciens for the industrial Aspergillus oryzae 3.042. Journal of Microbiology and Biotechnology. 29 (2), 230-234 (2019).
  17. Gomi, K., Iimura, Y., Hara, S. Integrative transformation of Aspergillus oryzae with a plasmid containing the Aspergillus nidulans argB Gene. Agricultural and Biological Chemistry. 51 (9), 2549-2555 (1987).
  18. Case, M. E., Schweizer, M., Kushner, S. R., Giles, N. H. Efficient transformation of Neurospora crassa by utilizing hybrid plasmid DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (10), 5259-5263 (1979).
  19. Lim, F. Y., Sanchez, J. F., Wang, C. C., Keller, N. P. Toward awakening cryptic secondary metabolite gene clusters in filamentous fungi. Methods in Enzymology. 517, 303-324 (2012).
  20. Li, D., Tang, Y., Lin, J., Cai, W. Methods for genetic transformation of filamentous fungi. Microbial Cell Factories. 16 (1), 168(2017).
  21. Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (7), 2172-2175 (1989).
  22. Shinkawa, S., et al. Base sequence for protein expression and method for producing protein using same. U.S. Patent. , 15/745,030 Application No. 15/745,030. Minato-Ku, Tokyo, Japan (2018).
  23. Tamano, K., et al. The β-1, 3-exoglucanase gene exgA (exg1) of Aspergillus oryzae is required to catabolize extracellular glucan, and is induced in growth on a solid surface. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 71 (4), 926-934 (2007).
  24. Endo, Y., et al. Novel promoter sequence required for inductive expression of the Aspergillus nidulans endoglucanase gene eglA. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 72 (2), 312-320 (2008).
  25. Kubodera, T., Yamashita, N., Nishimura, A. Pyrithiamine resistance gene (ptrA) of Aspergillus oryzae: cloning, characterization and application as a dominant selectable marker for transformation. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 64 (7), 1416-1421 (2000).
  26. Yamada, O., Lee, B. R., Gomi, K. Transformation system for Aspergillus oryzae with double auxotrophic mutations, niaD and sC. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 61 (8), 1367-1369 (1997).
  27. Nødvig, C. S., Nielsen, J. B., Kogle, M. E., Mortensen, U. H. A CRISPR-Cas9 system for genetic engineering of filamentous fungi. PLoS One. 10 (7), 0133085(2015).
  28. Shi, T. Q., et al. CRISPR/Cas9-based genome editing of the filamentous fungi: the state of the art. Applied Microbiology and Biotechnology. 101 (20), 7435-7443 (2017).
  29. Katayama, T., et al. Forced recycling of an AMA1-based genome-editing plasmid allows for efficient multiple gene deletion/integration in the industrial filamentous fungus Aspergillus oryzae. Applied Environmental Microbiology. 85 (3), 01896-01918 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

PEG gemedieerde protoplasttransformatieheterologe eiwitproductieprotoplastbereidingsporen pensienutri ntenrijk mediumoptimalisatie van de osmotische drukscreening van transformanten
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen