Het doel van het protocol is om verschillende extracellulaire matrix (ECM) coatingcondities te vergelijken om te beoordelen hoe differentiële coating de groeisnelheid van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) beïnvloedt. In het bijzonder streven we ernaar om voorwaarden te creëren om een optimale groei van iPSC-culturen te verkrijgen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Het meten van de samenvloeiing van iPSC's met behulp van een geautomatiseerd beeldvormingssysteem.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Deze studie richt zich op het begrijpen hoe het kweken van iPSC's op verschillende ECM-coatingsubstraten de celconfluentie kan beïnvloeden. Er is een protocol opgesteld om iPSC-samenvloeiing in realtime te beoordelen zonder dat cellen in eencellige suspensie hoeven te worden geteld om groeiverstoring te voorkomen. Een high-content beeldanalysesysteem werd gebruikt om de samenvloeiing van iPCS op 4 verschillende ECM's in de loop van de tijd op een geautomatiseerde manier te beoordelen. Verschillende analyse-instellingen werden gebruikt om de celconfluentie van adherente iPSC's te beoordelen en slechts een klein verschil (na 24 en 48 uur met laminine) is waargenomen of een 60, 80 of 100% masker werd toegepast. We laten ook zien dat laminine leidt tot de beste samenvloeiing in vergelijking met Matrigel, vitronectine en fibronectine.
Inleiding
Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) worden verkregen uit somatische cellen en kunnen worden gedifferentieerd in verschillende celtypen. Ze worden vaak gebruikt als een systeem om ziektepathogenese te modelleren of geneesmiddelenscreening uit te voeren, en bieden ook het potentieel om te worden gebruikt in de context van gepersonaliseerde geneeskunde. Aangezien iPSC's een groot potentieel hebben, is het belangrijk om ze volledig te karakteriseren voor gebruik als een betrouwbaar modelsysteem. We toonden eerder het belang aan van het kweken van iPSC's in een hypoxische omgeving, omdat deze cellen afhankelijk zijn van glycolyse en een aerobe omgeving redox-onbalans kan veroorzaken1. iPSC's zijn ook kwetsbaar voor andere kweekomstandigheden, met name de extracellulaire omgeving. Optimalisatie van cultuuromstandigheden is een belangrijk probleem om ze gezond en proliferatief te houden. Een gezonde iPSC-cultuur zal leiden tot gezonde gedifferentieerde cellen die over het algemeen het eindpunt zijn van het model dat wordt gebruikt om moleculaire, cellulaire en functionele kenmerken van specifieke menselijke aandoeningen of cellulaire processen te begrijpen.
In deze studie is een eenvoudig protocol gebruikt om de samenvloeiing van iPSC's te testen met behulp van verschillende coatingcondities in afzonderlijke putten. iPSC's hebben een feederlaag van murine embryonale fibroblasten (MEF) nodig om zich goed te hechten, maar de coëxistentie van iPSC's en MEF maakt het moeilijk om analyses zoals RNA of eiwitextractie uit te voeren, omdat er twee populaties cellen aanwezig zijn. Om de feederlaag te vermijden, zijn verschillende eiwitten die behoren tot de extracellulaire matrix (ECM) gebruikt om de natuurlijke celniche te recreëren en om feedervrije iPSC-cultuur te hebben. In het bijzonder is Matrigel een opgelost keldermembraanpreparaat geëxtraheerd uit het Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) muizensarcoom, dat is verrijkt met extracellulaire matrixeiwitten (d.w.z. laminine, collageen IV, heparansulfaatproteoglycanen, entactine / nidogeen en groeifactoren)2,3. De andere gebruikte coatingcondities zijn in plaats daarvan gezuiverde eiwitten met bekende relevantie bij het bouwen van de ECM's: laminine-521 is bekend dat het wordt uitgescheiden door menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's) in de binnenste celmassa van het embryo en het is een van de meest voorkomende lamininen in het lichaam na de geboorte 4,5,6,7,8,9, 10,11; vitronectine is een xenovrije celkweekmatrix waarvan bekend is dat het de groei en differentiatie van hPSC 12,13,14,15,16 ondersteunt; fibronectine is een ECM-eiwit dat belangrijk is voor de ontwikkeling van gewervelde dieren en de aanhechting en het onderhoud van embryonale stamcellen in een pluripotente toestand 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Omdat er verschillende coatingcondities beschikbaar zijn, vergelijken we ze in termen van hun effect op de samenvloeiing van iPSC's.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Coating 96 putplaten
OPMERKING: Verschillende coatings werden getest in dezelfde plaat, maar afzonderlijke putten (zie aanvullend bestand).
- Verdun de Matrigel 1:100 in DMEM. Voeg 100 μL per put toe aan de 96 putplaten en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Verwijder hierna de oplossing en was de putjes tweemaal met 100 μL DMEM.
- Verdun laminine (20 μg/ml, LN-521) in PBS (met calcium en magnesium). Voeg 100 μL toe aan de put en incubeer bij 4 °C een nacht. Voer de volgende dag twee wasbeurten uit met DMEM voordat u de cellen zaait.
- Verdun vitronectine (10 μg/ml) in verdunningsbuffer. Voeg 100 μL per put toe aan de 96 putplaat en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Was de putjes met PBS (zonder calcium en magnesium) voordat u de cellen platlegt.
- Verdun HU-Fibronectine (30 μg/ml) in ddH2O. Voeg 100 μL toe aan de putjes en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 45 minuten. Was hierna de putten met het medium voordat u de cellen zaait.
2. Onderhoud van iPSC's in cultuur
OPMERKING: iPSC's werden commercieel gekocht. De iPSC's zijn afgeleid van gezonde menselijke fibroblasten en geherprogrammeerd met behulp van episomale technologie.
- Ontdooi de gecryreserveerde iPSC's in een waterbad van -80 °C of vloeibare stikstof. Reinig de injectieflacon met de cellen met 70% ethanol voordat u deze in de biologische veiligheidskast plaatst.
- Voeg de celsuspensie druppelsgewijs toe aan 5 ml voorverwarmde celkweekmedia (bijv. mTeSR1) met een pipet van 1000 μL in een steriele conische buis van 15 ml.
- Centrifugeer de cellen bij 304 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Verwijder de media en resuspendeer de celkorrel in 4 ml celkweekmedium.
- Plaats de celsuspensie in twee putten van de 6 putplaten (105 iPSC's per 6-well celkweekschaal), waar de muis embryonale fibroblasten (MEFs) eerder zijn verguld. Zaad MEFs twee dagen voor het plating van iPSC's met een dichtheid van 2,4 x 104/cm2 in DMEM (met 10% foetaal runderserum, 1% L-glutamine en 1% penicilline-streptomycine).
- Vul na het zaaien de celmedia aan met 10 μM ROCK-remmer Y-27632.
- Laat de iPSC's de eerste 4-5 weken groeien op MEF's en vervolgens in feedervrije toestand (MEF-vrije toestand), met behulp van een van de interessante coating (zie stap 1 en tabel 1) in mTeSR1.
- Wanneer de iPSC's 70-80% confluent zijn, passage 1:4 met behulp van 0,5 mM EDTA-behandeling gedurende 3-5 minuten bij RT. Voeg 1 ml 0,5 mM EDTA toe voor een 6-putplaat (of proportionele hoeveelheden voor andere soorten platen). Breng over naar nieuwe putten in feedervrije omstandigheden en incubeer bij 37 °C, 5% CO2, 20% O2.
- Verander de media met verse mTeSR1 elke dag en splits de cellen om de 2 dagen.
3. Karakterisering van celconfluence
- Gebruik 96 putplaten voor de experimenten.
- Zaad 10.000 cellen per put na ten minste 1 maand kweken in feedervrije toestand om er zeker van te zijn dat de MEF's niet werden doorgegeven. Gebruik wegwerptelglaasjes om de cellen te tellen met de optische microscoop.
- Voer de experimenten in drievoud uit. Test daarom elke zaaiconditie in drie putten.
- Voer geautomatiseerde beeldacquisitie uit vanaf dag 1 na het zaaien met behulp van een cytometer in de bright-field-modus. Voer gedurende 5 dagen elke 24 uur geautomatiseerde beeldacquisitie uit. Voor gedetailleerde informatie over de experimentele parameters raadpleegt u het aanvullend bestand.
- Gebruik automatisch contrast en automatische belichting om cellen beter te visualiseren.
- Stel de analyse-instelling (zie Aanvullend bestand) voor confluentieanalyse in om een masker van 60%, 80% en 100% per put toe te passen, om de veranderingen in focus als gevolg van de lichtbreking aan de rand van de putten te evalueren. Gebruik de hierboven genoemde instelling voor maskeranalyse om de celconfluentie op elk tijdstip te analyseren.
4. Statistische analyses
- Rapporteer kwantitatieve resultaten als middel ± standaardfout van het gemiddelde (SEM).
- Voor het vergelijken van algemene verschillen van de verschillende coatingcondities, verkrijgt u gegevens met dezelfde monsters en voert u de t-test van de student uit. P-waarden kleiner dan 0,05 worden als statistisch significant beschouwd en alle gerapporteerde p-waarden zijn tweezijdig.
5. Karakterisering van de cytoskeletale microfilamenten
- Fix cellen met 4% paraformaldehyde (4% PFA) in PBS gedurende 10 minuten bij RT, gevolgd door twee wasbeurten in PBS (10 min totaal).
- Voeg 100 μL blokkeringsoplossing (samengesteld uit 5% BSA, 0,1% Triton in PBS) toe aan elk putje gedurende 1 uur bij RT.
- Verwijder de blokkeeroplossing en was de monsters tweemaal met PBS gedurende 10 minuten.
- Voeg 100 μL van de falloïdine-geconjugeerde werkoplossing per monster toe en incubeer gedurende 1 uur bij RT.
- Wascellen twee keer met PBS (10 min bij RT).
- Vlekkernen met Hoechst 33342 verdund 1:10000 in PBS gedurende 10 minuten bij RT.
- Verwijder de Hoechst-oplossing en was de cellen twee keer met PBS gedurende 10 minuten per keer.
- Was het monster met H2O en laat drogen onder een chemische kap.
- Voeg 100 μL montagemedia (d.w.z. PBS:glycerol, 1:1) toe om de cellen te bedekken en de fluorescentie van monsters te behouden.
- Observeer de cel bij Ex/Em 493/517 nm op een laserscanconfiscale microscoop uitgerust met een witlichtlaser (WLL) en een 405 nm diodelaser. Verkrijg opeenvolgende confocale beelden met behulp van een HC PLAPO 40x olie-immersie objectief. Gebruik hetzelfde laservermogen, bundelsplitsers, filterinstellingen, gaatjesdiameters en scanmodus voor alle onderzochte monsters.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In deze studie onderzochten we de samenvloeiing van iPSC's wanneer ze op verschillende coatingomstandigheden worden gekweekt. Met behulp van een cytometer waren we in staat om gemakkelijk informatieve resultaten te verkrijgen in drievoud in 5 dagen. Omdat iPSC's zich nauwelijks hechten aan plastic vaten en een coating nodig is om hun proliferatie te ondersteunen, hebben we besloten om de samenvloeiing van menselijke iPSC's te monitoren, omdat dit indicatief is voor de gezondheid van de celcultuur en het kan reflecteren o...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het gebruik van iPSC's voor ziektemodellering en toekomstige geneesmiddelenscreening, samen met hun mogelijke toepassing in precisiegeneeskunde, maakt het een technologie van groot belang en om deze reden zijn wij van mening dat het noodzakelijk is om de in vitro kweekconditie duidelijk te begrijpen die beter lijkt op de fysiologische situatie van embryonale stamcellen. In deze context hebben we verschillende ECM-coatings getest met behulp van wild type iPSC's om de omstandigheden te begrijpen die de cellen in staat stel...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De studie werd ondersteund door subsidies van de Fondazione Bambino Gesù en Ricerca Corrente (Italiaans ministerie van Volksgezondheid) aan C.C. We willen graag Dr. Enrico Bertini (Afdeling Neurowetenschappen, Eenheid Neuromusculaire en Neurodegeneratieve Ziekten, Laboratorium voor Moleculaire Geneeskunde, Bambino Gesù Children's Research Hospital), Dr Stefania Petrini (Confocale Microscopie Core Facility, Onderzoekslaboratoria, Bambino Gesù Children's Research Hospital), Giulia Pericoli (Afdeling Onco-hematologie, Gen- en Celtherapie, Kinderonderzoeksziekenhuis Bambino Gesù) bedanken. en Roberta Ferretti (afdeling Onco-hematologie, Gen- en Celtherapie, Children's Research Hospital Bambino Gesù) voor wetenschappelijke discussies en technische hulp. Maria Vinci is ontvanger van een "Children with Cancer UK fellowship".
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 10 mL Stripette Serologische Pipetten, Polystyreen, Individueel verpakt in papier/plastic, sterieel | Corning | 4488 | Tool |
| 15 mL hoge helderheid polypropyleen (PP) conische centrifugebuizen | Falcon | 352097 | Tool |
| 1x PBS (met Ca2+; Mg2+) | Thermofisher | 14040133 | Medium |
| 1x PBS (zonder Ca2+; Mg2+) | Euroclone | ECB4004L | Medium |
| 5 mL Stripette Serologische Pipetten, Polystyreen, Individueel verpakt in papier/plastic, sterieel | Corning | 4487 | Tool |
| Celcultuur microplaat, 96 WELL, PS, F-Bottom | Greiner Bio One | 655090 | Support |
| Celcultuurplaat, 6 well | Costar | 3516 | Support |
| DMEM (Dulbecco's Gemodificeerd Eagle's Medium- hoge glucose) | Sigma | D5671 | Medium |
| EDTA | Sigma | ED4SS-500g | Reagent |
| Epi Episomal iPSC Reprogramming Kit | Invitrogen | A15960 | Reagent |
| FAST - READ 102 | Biosigma | BVS100 | Tool |
| Fetaal Rund Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | Medium |
| Fibronectin | Merck | FC010 | Coating |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Reagent |
| H2O | MILLIQ | ||
| Hoechst | Thermofisher | 33342 | Reagent |
| Laminin 521 | Stem Cell Technologies | 77003 | Coating |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | LS25030081 | Reagent |
| Matrigel | Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | 354277 | Coating |
| Muis embryonale fibroblasten (MEF) | Life Technologies | A24903 | Coating |
| MTESR1 Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | Medium |
| MTESR1 Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | Medium |
| Penicilline-Streptomycine (10.000 U/mL) | Gibco | 15140122 | Reagent |
| Phalloidin | Sigma | P1951 | Reagent |
| Vitronectin | Stem Cell Technologies | 7180 | Coating |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Reagent |
Referenties
- Masotti, A., et al. Aged iPSCs display an uncommon mitochondrial appearance and fail to undergo in vitro neurogenesis. Aging (Albany NY). 6 (12), 1094-1108 (2014).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
- Kleinman, H. K., et al. Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma. Biochemistry. 21 (24), 6188-6193 (1982).
- Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5, 3195(2014).
- Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521 based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).
- Laperle, A., et al. α-5 Laminin Synthesized by Human Pluripotent Stem Cells Promotes Self-Renewal. Stem Cell Reports. 5 (2), 195-206 (2015).
- Albalushi, H., et al. Laminin 521 stabilizes the pluripotency expression pattern of human embryonic stem cells initially derived on feeder cells. Stem Cell International. 2018, 7127042(2018).
- Zhang, D., et al. Niche-derived laminin-511 promotes midbrain dopaminergic neuron survival and differentiation through YAP. Science Signaling. 10 (493), (2017).
- Lu, H. F., et al. A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (9), 2816-2826 (2015).
- Miyazaki, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. Optimization of slow cooling cryopreservation for human pluripotent stem cells. Genesis. 52 (1), 49-55 (2014).
- Bergström, R., Ström, S., Holm, F., Feki, A., Hovatta, O. Xeno-free culture of human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 767, 125-136 (2011).
- Braam, S. R., et al. Recombinant vitronectin is a functionally defined substrate that supports human embryonic stem cell self-renewal via alphavbeta5 integrin. Stem Cells. 26 (9), 2257-2265 (2008).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2008).
- Li, J., et al. Impact of vitronectin concentration and surface properties on the stable propagation of human embryonic stem cells. Biointerphases. 5 (3), 132-142 (2010).
- Prowse, A. B., et al. Long-term culture of human embryonic stem cells on recombinant vitronectin in ascorbate free media. Biomaterials. 31 (32), 8281-8288 (2010).
- Rowland, T. J., et al. Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin. Stem Cells and Development. 19 (8), 1231-1240 (2010).
- Ruoslahti, E., Engvall, E., Hayman, E. G., Spiro, R. G. Comparative studies on amniotic fluid and plasma fibronectins. Biochemistry. 193 (1), 295-299 (1981).
- Ni, H., Li, A., Simonsen, N., Wilkins, J. A. Integrin activation by dithiothreitol or Mn2+ induces a ligand-occupied conformation and exposure of a novel NH2-terminal regulatory site on the beta1 integrin chain. Biological Chemistry. 273 (14), 7981-7987 (1998).
- Seltana, A., Basora, N., Beaulieu, J. F. Intestinal epithelial wound healing assay in an epithelial-mesenchymal co-culture system. Wound Repair & Regeneration. 18 (1), 114-122 (2010).
- Amit, M., Shariki, C., Margulets, V., Itskovitz-Eldor, J. Feeder layer-and serum-free culture of human embryonic stem cells. Biology of Reproduction. 70 (3), 837-845 (2004).
- Vaheri, A., Mosher, D. F. High molecular weight, cell surface-associated glyco-protein (fibronectin) lost in malignant transformation. Biochimica et Biophysica Acta. 516 (1), 1-25 (1978).
- Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process. Matrix Biology. 24 (6), 389-399 (2005).
- Polyak, K., Weinberg, R. A. Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits. Nature Reviews Cancer. 9 (4), 265-273 (2009).
- Kadler, K. E., Hill, A., Canty-Laird, E. G. Collagen fibrillogenesis: fibronectin, integrins, and minor collagens as organizers and nucleators. Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 495-501 (2008).
- Hunt, G. C., Schwarzbauer, J. E. Tightening the connections between cadherins and fibronectin matrix. Developmental Cell. 16 (3), 327-328 (2009).
- Villa-Diaz, L. G., Ross, A. M., Lahann, J., Krebsbach, P. H. Concise review: The evolution of human pluripotent stem cell culture: from feeder cells to synthetic coatings. Stem Cells. 31 (1), 1-7 (2013).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Vigilante, A., et al. Identifying Extrinsic versus Intrinsic Drivers of Variation in Cell Behavior in Human iPSC Lines from Healthy Donors. Cell Reports. 26 (8), 2078-2087 (2019).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
