Het doel van het protocol is om verschillende extracellulaire matrix (ECM) coatingcondities te vergelijken om te beoordelen hoe differentiële coating de groeisnelheid van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) beïnvloedt. In het bijzonder streven we ernaar om voorwaarden te creëren om een optimale groei van iPSC-culturen te verkrijgen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Het meten van de samenvloeiing van iPSC's met behulp van een geautomatiseerd beeldvormingssysteem.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Deze studie richt zich op het begrijpen hoe het kweken van iPSC's op verschillende ECM-coatingsubstraten de celconfluentie kan beïnvloeden. Er is een protocol opgesteld om iPSC-samenvloeiing in realtime te beoordelen zonder dat cellen in eencellige suspensie hoeven te worden geteld om groeiverstoring te voorkomen. Een high-content beeldanalysesysteem werd gebruikt om de samenvloeiing van iPCS op 4 verschillende ECM's in de loop van de tijd op een geautomatiseerde manier te beoordelen. Verschillende analyse-instellingen werden gebruikt om de celconfluentie van adherente iPSC's te beoordelen en slechts een klein verschil (na 24 en 48 uur met laminine) is waargenomen of een 60, 80 of 100% masker werd toegepast. We laten ook zien dat laminine leidt tot de beste samenvloeiing in vergelijking met Matrigel, vitronectine en fibronectine.
Inleiding
Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) worden verkregen uit somatische cellen en kunnen worden gedifferentieerd in verschillende celtypen. Ze worden vaak gebruikt als een systeem om ziektepathogenese te modelleren of geneesmiddelenscreening uit te voeren, en bieden ook het potentieel om te worden gebruikt in de context van gepersonaliseerde geneeskunde. Aangezien iPSC's een groot potentieel hebben, is het belangrijk om ze volledig te karakteriseren voor gebruik als een betrouwbaar modelsysteem. We toonden eerder het belang aan van het kweken van iPSC's in een hypoxische omgeving, omdat deze cellen afhankelijk zijn van glycolyse en een aerobe omgeving redox-onba....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Coating 96 putplaten
OPMERKING: Verschillende coatings werden getest in dezelfde plaat, maar afzonderlijke putten (zie aanvullend bestand).
- Verdun de Matrigel 1:100 in DMEM. Voeg 100 μL per put toe aan de 96 putplaten en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Verwijder hierna de oplossing en was de putjes tweemaal met 100 μL DMEM.
- Verdun laminine (20 μg/ml, LN-521) in PBS (met calcium en magnesium). Voeg 100 μL toe aan de put en incubeer bij 4 °C een nacht. Voer de volgende dag twee wasbeurten uit met DMEM voordat u de cellen zaait.
- Verdun vitronectine (10 μg/ml) in verdunningsbuffer....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In deze studie onderzochten we de samenvloeiing van iPSC's wanneer ze op verschillende coatingomstandigheden worden gekweekt. Met behulp van een cytometer waren we in staat om gemakkelijk informatieve resultaten te verkrijgen in drievoud in 5 dagen. Omdat iPSC's zich nauwelijks hechten aan plastic vaten en een coating nodig is om hun proliferatie te ondersteunen, hebben we besloten om de samenvloeiing van menselijke iPSC's te monitoren, omdat dit indicatief is voor de gezondheid van de celcultuur en het kan reflecteren o.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het gebruik van iPSC's voor ziektemodellering en toekomstige geneesmiddelenscreening, samen met hun mogelijke toepassing in precisiegeneeskunde, maakt het een technologie van groot belang en om deze reden zijn wij van mening dat het noodzakelijk is om de in vitro kweekconditie duidelijk te begrijpen die beter lijkt op de fysiologische situatie van embryonale stamcellen. In deze context hebben we verschillende ECM-coatings getest met behulp van wild type iPSC's om de omstandigheden te begrijpen die de cellen in staat stel.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De studie werd ondersteund door subsidies van de Fondazione Bambino Gesù en Ricerca Corrente (Italiaans ministerie van Volksgezondheid) aan C.C. We willen graag Dr. Enrico Bertini (Afdeling Neurowetenschappen, Eenheid Neuromusculaire en Neurodegeneratieve Ziekten, Laboratorium voor Moleculaire Geneeskunde, Bambino Gesù Children's Research Hospital), Dr Stefania Petrini (Confocale Microscopie Core Facility, Onderzoekslaboratoria, Bambino Gesù Children's Research Hospital), Giulia Pericoli (Afdeling Onco-hematologie, Gen- en Celtherapie, Kinderonderzoeksziekenhuis Bambino Gesù) bedanken. en Roberta Ferretti (afdeling Onco....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 10 mL Stripette Serologische Pipetten, Polystyreen, Individueel verpakt in papier/plastic, sterieel | Corning | 4488 | Tool |
| 15 mL hoge helderheid polypropyleen (PP) conische centrifugebuizen | Falcon | 352097 | Tool |
| 1x PBS (met Ca2+; Mg2+) | Thermofisher | 14040133 | Medium |
| 1x PBS (zonder Ca2+; Mg2+) | Euroclone | ECB4004L | Medium |
| 5 mL Stripette Serologische Pipetten, Polystyreen, Individueel verpakt in papier/plastic, sterieel | Corning | 4487 | Tool |
| Celcultuur microplaat, 96 WELL, PS, F-Bottom | Greiner Bio One | 655090 | Support |
| Celcultuurplaat, 6 well | Costar | 3516 | Support |
| DMEM (Dulbecco's Gemodificeerd Eagle's Medium- hoge glucose) | Sigma | D5671 | Medium |
| EDTA | Sigma | ED4SS-500g | Reagent |
| Epi Episomal iPSC Reprogramming Kit | Invitrogen | A15960 | Reagent |
| FAST - READ 102 | Biosigma | BVS100 | Tool |
| Fetaal Rund Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | Medium |
| Fibronectin | Merck | FC010 | Coating |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Reagent |
| H2O | MILLIQ | ||
| Hoechst | Thermofisher | 33342 | Reagent |
| Laminin 521 | Stem Cell Technologies | 77003 | Coating |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | LS25030081 | Reagent |
| Matrigel | Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | 354277 | Coating |
| Muis embryonale fibroblasten (MEF) | Life Technologies | A24903 | Coating |
| MTESR1 Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | Medium |
| MTESR1 Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | Medium |
| Penicilline-Streptomycine (10.000 U/mL) | Gibco | 15140122 | Reagent |
| Phalloidin | Sigma | P1951 | Reagent |
| Vitronectin | Stem Cell Technologies | 7180 | Coating |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Reagent |
Referenties
- Masotti, A., et al. Aged iPSCs display an uncommon mitochondrial appearance and fail to undergo in vitro neurogenesis. Aging (Albany NY). 6 (12), 1094-1108 (2014).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated hu....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
