Beoordeling van cellulaire oxidatie met behulp van een subcellulair compartiment-specifieke Redox-gevoelige groene fluorescerende eiwitten

Summary

Dit protocol beschrijft de beoordeling van de subcellulaire compartimentspecifieke redox-status in de cel. Een redoxgevoelige fluorescerende sonde maakt een handige ratiometrische analyse in intacte cellen mogelijk.

Abstract

Het meten van de intracellulaire oxidatie/reductiebalans geeft een overzicht van de fysiologische en/of pathofysiologische redox-status van een organisme. Thiolen zijn vooral belangrijk voor het verlichten van de redox-status van cellen via hun verminderde dithiol en geoxideerde disulfide ratio's. Engineered cysteïne-bevattende fluorescerende eiwitten openen een nieuw tijdperk voor redox-gevoelige biosensoren. Een van hen, redox-gevoelige groene fluorescerende eiwitten (roGFP), kan gemakkelijk worden geïntroduceerd in cellen met adenovirale transductie, waardoor de redox-status van subcellulaire compartimenten kunnen worden geëvalueerd zonder cellulaire processen te verstoren. Verminderde cysteines en geoxideerde cystines van roGFP hebben excitatie maxima op respectievelijk 488 nm en 405 nm, met emissie op 525 nm. Door de verhoudingen van deze verlaagde en geoxideerde vormen te beoordelen, kan de balans van redox in de cel gemakkelijk worden berekend. In deze methode artikel, vereeuwigd menselijke drievoudige negatieve borstkankercellen (MDA-MB-231) werden gebruikt om redox status te beoordelen binnen de levende cel. De protocolstappen omvatten MDA-MB-231 cellijntransductie met adenovirus om cytosolische roGFP uit te drukken, behandeling met H₂O₂, en beoordeling van cysteïne en cystineverhouding met zowel stroomcytometrie als fluorescentiemicroscopie.

Introduction

Oxidatieve stress werd gedefinieerd in 1985 door Helmut Sies als "een verstoring in prooxidant-antioxidant evenwicht ten gunste van de eerste"¹, en een overvloed aan onderzoek is uitgevoerd om ziekte-, voeding-, en veroudering-specifieke redox status van organismen^1,2,3te verkrijgen . Sindsdien is het begrip van oxidatieve stress breder geworden. Het testen van de hypothesen van het gebruik van antioxidanten tegen ziekten en/of veroudering heeft aangetoond dat oxidatieve stress niet alleen schade veroorzaakt, maar ook andere rollen in cellen heeft. Bovendien hebben wetenschappers aangetoond dat vrije radicalen een belangrijke rol spelen bij signaaltransductie². Al deze studies versterken het belang van het bepalen van de veranderingen in de reductie-oxidatie (redox) verhouding van macromoleculen. Enzymactiviteit, antioxidanten en/of oxidanten en oxidatieproducten kunnen met verschillende methoden worden beoordeeld. Onder deze, methoden die thiol oxidatie te bepalen zijn misschien wel de meest gebruikte omdat ze rapporteren over de balans tussen antioxidanten en prooxidanten in cellen, evenals organismen⁴. Specifiek worden verhoudingen tussen glutathion (GSH)/glutathione disulfide (GSSG) en/of cysteïne (CyS)/cystine (CySS) gebruikt als biomarkers voor het monitoren van de redoxstatus van organismen².

Methoden die worden gebruikt voor het testen van de balans tussen prooxidanten en antioxidanten zijn voornamelijk afhankelijk van de niveaus van verminderde / geoxideerde eiwitten of kleine moleculen in cellen. Westerse vlekken en massaspectrometrie worden gebruikt om de verhoudingen van verminderde/geoxideerde macromoleculen (eiwit, lipiden enz.) breed te beoordelen, en GSH/GSSG-verhoudingen kunnen worden beoordeeld met spectrofotometrie⁵. Een gemeenschappelijk kenmerk van deze methoden is de fysieke verstoring van het systeem door cellyse en/of weefselhomogenisatie. Deze analyses worden ook uitdagend wanneer het nodig is om de oxidatiestatus van verschillende cellulaire compartimenten te meten. Al deze verstoringen veroorzaken artefacten in de testomgeving.

Redox-gevoelige fluorescerende eiwitten openden een gunstig tijdperk voor het evalueren van de redoxbalans zonder een verstoring in de cellen⁶te veroorzaken. Ze kunnen zich richten op verschillende intracellulaire compartimenten, waardoor de kwantificering van compartimentspecifieke activiteiten (bijvoorbeeld de redoxtoestand van mitochondriën en de cytosol) kan worden geflankeerd om kruisspraak tussen cellulaire organellen te onderzoeken. Geel fluorescerend eiwit (YFP), groen fluorescerend eiwit (GFP) en HyPeR-eiwitten worden beoordeeld door Meyer en collega's^6. Onder deze eiwitten is redox-gevoelige GFP (roGFP) uniek vanwege verschillende fluorescerende uitlezingen van zijn CyS (ex. 488 nm/em. 525 nm) en CySS (ex. 405 nm/525 nm) residuen, waardoor ratiometrische analyse mogelijk is, in tegenstelling tot andere redoxgevoelige eiwitten zoals YFP^7,8. Ratiometrische output is waardevol omdat het een tegenwicht biedt aan de verschillen tussen expressieniveaus, detectiegevoeligheden en photobleaching⁸. Subcellulaire compartimenten van cellen (cytosol, mitochondriën, kern) of verschillende organismen (bacteriën en zoogdiercellen) kunnen worden gericht door roGFP^7,9,10te wijzigen .

roGFP-testen worden uitgevoerd met behulp van fluorescerende beeldvormingstechnieken, vooral voor real-time visualisatie-experimenten. Flow cytometrische analyses van roGFP's zijn ook mogelijk voor experimenten met vooraf bepaalde tijdstippen. Het huidige artikel beschrijft zowel het gebruik van fluorescerende microscopie als stroomcytometrie om een ratiometrische beoordeling van de redox-toestand in zoogdiercellen uit te voeren die roGFP (gericht op cytosol) via adenovirale transductie overpreiden.

Protocol

OPMERKING: Dit protocol is geoptimaliseerd voor 70%-80% confluent MDA-MB-231 cellen. Voor andere cellijnen moet het aantal cellen en de veelheid van infectie (MOI) opnieuw worden geoptimaliseerd.

1. Bereiding van cellen (dag 1)

1. Houd de MDA-MB-231 cellijn in 75 cm² kolven met 10 mL gemodificeerd Eagle medium (DMEM) van Dulbecco aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS) bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO_2.
   OPMERKING: DMEM aangevuld met 10% FBS, 37 °C en een 5% CO₂ bevochtigde atmosfeer worden gebruikt voor alle bevestigings- en behandelings incubaties in het gehele protocol.
2. Bereid de MDA-MB-231 cellen voor op experiment.
   1. Aspiraat het medium in de kolf, los de cellen met 2 mL van 0,25% trypsine-EDTA oplossing voor 2 min, en inactiveren de trypsine activiteit met 6 mL van het volledige medium (DMEM met 10% FBS). Centrifugeer de cellen op 150 x g gedurende 5 min. Aspirate de supernatant en schort de cellen op in 5 mL van volledig medium.
   2. Meng een gelijke volume cel suspensie en 0,4% trypan blauw. Neem 10 μL van dit mengsel en tel de cellen met de geautomatiseerde celteller.
      LET OP: Een Coulter teller of een hemocytometer kan ook worden gebruikt voor het tellen van cellen.
   3. Zaad de cellen in een 6 put plaat voor flow cytometrie analyses en zaad 150.000 cellen in 1 mL van medium per put. Wacht 16 uur op celbevestiging.
   4. Zaad de cellen in een 4 put kamer dia voor fluorescerende beeldvorming en zaad 25.000 cellen in 0,5 mL van medium per put. Wacht 16 uur op celbevestiging.
      LET OP: Zaadcontroleputten naast de behandelingsputten. Gebruik een van de controleputten om het celnummer te bepalen (optioneel: als de bevestigingsperiode voor de cellen korter is dan de verdubbelingstijd, kan worden aangenomen dat het celnummer hetzelfde is als de zaaidichtheid) en de andere voor een niet-geïnfecteerde controle (0 MOI).

2. Adenovirale roGFP-transductie (dag 2 en 3)

LET OP: Adenovirussen kunnen ziekten veroorzaken. Gebruik tijdens het transduceren van de cellen gefilterde tips en ontsmettingstips, Pasteurpipettes en microcentrifugebuizen met 10% bleekmiddel.

OPMERKING: Dit protocol werd gedemonstreerd met cytosol-specifieke roGFP, maar andere cellulaire compartimenten (bijvoorbeeld mitochondriën of mitochondriale intermembrane ruimte) kunnen worden gericht met dit zelfde protocol.

1. Een dosisresponscurve genereren voor het MOI om de hoogste transductie-efficiëntie te verkrijgen door het volume van het adenovirus (mL) te berekenen dat nodig is voor elke MOI-waarde voor MDA-MB-231-cellijn(tabel 1):
   
   OPMERKING: Functionele titer van elke partij adenovirale voorraad, die wordt uitgedrukt als plaquevormende eenheid (PFU) per mL, wordt geleverd door het bedrijf. De optimale MOI voor transductie verschilt tussen celtypen. Voor de meeste zoogdiercellen ligt het optimale MOI-bereik tussen de 10 en 300. Volgens de cellulaire respons moeten de MOI-waarden opnieuw worden berekend (bijvoorbeeld het MOI-bereik moet worden verminderd als cellen cytotoxische respons hebben of het bereik moeten worden verhoogd als cellen een lage transductie-efficiëntie hebben).
2. Maak 1:100 verdunning van 6 x 10¹⁰ PFU/mL adenovirale roGFP oplossing met celkweekmedium (DMEM met 10% FBS) voor betrouwbaar pipetten.
3. Pipette en voeg 0,0125 mL (12,5 μL), 0,025 mL (25 μL), 0,05 mL (50 μL) van adenovirale roGFP verdunning toe in elke put van de 6 putplaat om de 150.000 cellen met 50 te herleiden, respectievelijk 100 en 200 MOI voor analyse van stroomcytometrie(tabel 1).
4. Pipet en voeg 0,0042 mL (4.2 μL) adenovirale roGFP verdunning toe in de 4-kamer schuifputten om 25.000 cellen met 100 MOI voor fluorescentie beeldvorming(Tabel 1) te transduceren.
   OPMERKING: Een minimale hoeveelheid medium moet worden gebruikt in de putten om de hoogste interactie tussen de adenovirale roGFP-constructie en cellen te garanderen. Het serumgehalte van het kweekmedium moet mogelijk worden verlaagd voor verschillende cellijnen, omdat hoge serumniveaus de transductie-efficiëntie in sommige celtypen negatief kunnen beïnvloeden.
5. Incubeercellen gedurende 16-24 uur onder de celonderhoudsomstandigheden. De volgende dag (dag 3), verander het medium naar cell cultuur medium (DMEM met 10% FBS) om celherstel toe te staan voor nog eens 24 uur. Visualiseer cellen onder een microscoop om hun morfologie te beoordelen; cellen kunnen roGFP uitdrukken, zelfs als ze morfologische veranderingen hebben.
   OPMERKING: Op dag 3 moeten cellen roGFP gaan uitdrukken; daarom kan de transductie-efficiëntie worden gecontroleerd met behulp van fluorescentiemicroscopie (filters met ex. 488/em. 525). Om consistente testresultaten te verkrijgen, moet u zich bewust zijn van en de morfologische veranderingen onder de fasecontrastmicroscoop documenteren en morfologie observeren terwijl de transductie-efficiëntie wordt geëvalueerd.
6. Maak een dosisresponscurve aan de hand van de 50,100 en 200 MOI-monsters die in stap 2.3 zijn bereid en hun transductie-efficiëntieresultaten verkregen uit de analyse van stroomcytometrie (stappen 3.1 en 4.1). Beoordeel de optimale transductie-efficiëntie met documentatie van morfologische veranderingen (stap 2.5) en de dosisresponscurve van MOI.
   OPMERKING: Hoewel meer dan 98% van de celpopulatie bij 100 MOI en 200 MOI express roGFP (zie representatieve resultaten), vertoonde 200 MOI-groep aanzienlijke veranderingen in de celmorfologie van MDA-MB-231 cellen. Bijgevolg werd vastgesteld dat de meest effectieve MOI voor MDA-MB-231 cellen 100 MOI was.
7. Na optimale MOI (hier, 100 MOI) werd gekozen voor MDA-MB-231 cellijn, uitvoeren experiment met testmaterialen (10 μM H₂O₂ en het voertuig 0,1% gedeïmiseerd water).
   1. Bereid en zaad de cellen volgens sectie 1. Met behulp van het adenovirale transductievolume voor 100 MOI berekend in stap 2.1, herhaal stappen 2.2−2.4 voor 100 MOI adenovirale transductie van cellen. Vervolgens incuberen de plaat en kamer dia's volgens stap 2.5.

3. Verwerving van CyS/CySS-saldo

1. Stroomcytometrie (dag 4)
   1. Op dag 4 broeden cellen uit stap 2.7.1 met 10 μM H₂O₂ voor 1 uur.
      OPMERKING: 10 μM H₂O₂ werd gebruikt als teststof en 0,1% gedeïïmiseerd water werd gebruikt als voertuigbehandeling in dit protocol. Andere oxiderende middelen kunnen hier als positieve controles worden gebruikt.
   2. Aspirate media van de 6 putplaat, vervangen door 750 μL van 0,25% trypsin-EDTA oplossing en wacht 2 min voor cellen los te maken. Activeer trypsine met 2 mL compleet medium (DMEM met 10% FBS) en verzamel het volume in 15 mL conische buizen.
   3. Centrifugeren de buizen op 150 x g gedurende 5 minuten bij 4ºC. Gooi supernatant weg en schorst de cellen in 500 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
   4. Stap 3.1.3 herhalen
   5. Filter de celsuspensies in stroom cytometrie-compatibele buizen met behulp van 40 μm mesh. Houd de buizen op ijs en uit de buurt van het licht en volg stap 4.1 voor data-analyse.
2. Microscopische beeldvorming (dag 4)
   1. Behandel cellen op dag 4 met 10 μM H₂O₂, verwerf beelden onmiddellijk (tijdpunt 0) en 1 uur na de behandeling en volg stap 4.2 voor data-analyse.

4. Gegevensanalyse

1. Flow cytometrie kwantificering
   1. Stel de flow cytometriemethode in voor 3 verschillende analyses via monsteracquisitiesoftware (zie Tabel van Materialen):forward scatter (FCS) op x-as en zijverstrooiing (SSC) op y-ass om de celgrootte en complexiteit van cellen te beoordelen (SSC kan worden gebruikt voor ruwe identificatie van dode en levende cellen); ex. 488 nm/em. 525 nm (fluoresceïne isothiocyanaat [FITC]) bandpassfilter op x-as en SSC op y-as om CyS-roGFP te beoordelen; ex. 405 nm/em. 525 nm (Brilliant Violet 510 [BV510]) bandpass filter op x-as en SSC op y-as om CySS-roGFP te beoordelen.
   2. Verwerf 0 MOI-controle en visualiseer cellen met voorbeeldacquisitiesoftware. Herhaal deze stap voor de resterende monsters (50, 100, 200 MOI-groepen en later op 10 μM H₂O₂ behandelde cellen en voertuig behandelde cellen). Sla de bestanden op voor gegevensanalyse.
   3. Open data-analysesoftware (zie Tabel van materialen)en open 0 MOI-voorbeeldbestand. Beoordeel de celpopulatie van belang (Poort 1). Stel de volgende gatings in om de achtergrondfluorescentie voor ex. 488 nm/em te minimaliseren. 525 nm (Poort 2) en ex. 405 nm/em. 525 nm (Gate 3) bandpass filters met de niet-geïnfecteerde (0 MOI) controlecellen.
   4. Open 50, 100 en 200 MOI-voorbeeldbestanden in data-analysesoftware om de dosisresponscurve te beoordelen. Analyseer gemiddelde fluorescentieintensiteiten met Gates 2 en 3 voor elk monster. Herhaal deze stap voor testmonsters (10 μM H₂O₂ behandelde cellen en met voertuigen behandelde cellen).
   5. Bereken de gemiddelde fluorescerende intensiteitsverhouding tussen geoxideerde versus gereduceerde vormen van roGFP met de volgende vergelijking.

2. Beeldbeoordeling
   1. Gebruik een microscoop die fluorescentiefilters bevat voor CyS-roGFP en CySS-roGFP (ex. 488 nm/em. 525 nm en ex. 405 nm/em. respectievelijk 525 nm filters).
   2. Kies in elke put van de kamerdia 4 willekeurige gebieden om afbeeldingen te verkrijgen, met behulp van de 4x doelstelling om grotere gebieden te visualiseren.
      OPMERKING: 20x doelstelling kan ook worden gebruikt voor beelddisplays.
   3. Open de afbeelding met ImageJ-software¹¹. Analyse toepassen | Meet opdrachten voor elke afbeelding en gebruik de vergelijking in stap 4.1.5 om de gegevens te kwantificeren.
      OPMERKING: Kwantificering van de afbeeldingen is ratiometrisch; Daarom omvat het protocol geen aftrekking van de achtergrond. Echter, om te kunnen beelden te vergelijken, helderheid, contrast, en verzadiging moet hetzelfde zijn voor elke afbeelding. Statistische significantie werd beoordeeld met eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA) en de post hoc-test van Tukey.

Results

De redoxtoestand van CyS/CySS is gemakkelijk te testen met getransduceerde roGFP's. De fluorescerende sonde kwantificeert de verhouding tussen de verlaagde en geoxideerde vormen (excitatiegolflengten respectievelijk 488 nm en 405 nm). Fluorescentie gegevens kunnen worden verkregen door zowel flow cytometrie en microscopie.

Een groot aantal cellen kan consequent en gemakkelijk worden verkregen met behulp van stroom cytometrie. De analyse bestaat uit 3 hoofdstappen: 1) selecteer de celpopulatie ...

Discussion

De thiol/disulfide balans in een organisme weerspiegelt de redoxstatus van cellen. Levende organismen hebben glutathion, cysteïne, eiwittholen en thiolen met een laag moleculair gewicht, die allemaal worden beïnvloed door het oxidatieniveau en echo van de redoxstatus van cellen^4. Engineered roGFP's maken de niet-verstorende kwantificering van het thiol/disulfide-saldo mogelijk via hun CyS-residuen⁷. De ratiometrische eigenschap van roGFP biedt betrouwbare redoxmetingen voor...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco by Life Sciences	25200-056	Celcultuur
4-well chamber slide	Thermo Scientific	154526	Celaanplantingsmateriaal voor fluorescente beeldvorming
5 ml buizen met celstrainerkap	Falcon	352235	Buis voor enkele celsuspensie voor flowcytometrieanalyse
6-well plate	Corning	353046	Celaanplantingsmateriaal voor flowcytometrieanalyse
15 ml conische buizen	MidSci	C15B	Celcultuur
75 cm2 geventileerde kapweefselkweekflessen	Corning	4306414	Celcultuur
Adenoviral cytosol specifiek roGFP	ViraQuest	VQAd roGFP	roGFP construct vriendelijk verstrekt door Dr. Schumaker
Klasse II, Type A2 Veiligheidskapkast	Thermo Scientific	1300 Series A2	Celcultuur
Countess geautomatiseerde celteller	Invitrogen	C10227	Celtelling
Countess celteller kamerslides	Invitrogen	C10283	Celtelling
DMEM	Gibco by Life Sciences	11995-065	Celcultuur
FBS	Atlanta Biologicals	S11150	Celcultuur
Gefilterde pipettentips, steriele, 20 µl	Fisherbrand	02-717-161	Celcultuur
Gefilterde pipettentips, steriele, 1000 µl	Fisherbrand	02-717-166	Celcultuur
Flow Cytometer	BD Biosciences	LSRFortessa	Instrument uitgerust met FITC en BV510 bandpass filters voor flowcytometrieanalyses
Fluorescente Microscoop	Advanced Microscopy Group (AMG)	Evos FL	Fluorescente beeldvorming
Waterstofperoxide 30%	Fisher Scientific	H325-100	Positieve controle
Light Cube, Aangepast	Life Sciences	CUB0037	Fluorescente beeldvorming van roGFP expresserende cellen (ex 405 nm)
Light Cube, GFP	Thermo Scientific	AMEP4651	Fluorescente beeldvorming van roGFP expresserende cellen (ex 488 nm)
MDA-MB-231	American Tissue Culture Collection	HTB-26	Menselijke epitheliale borstkankercellijn
Microcentrifugebuizen, 2 ml	Grenier Bio-One	623201	Celcultuur
PBS	Gibco by Life Sciences	10010-023	Celcultuur
Pipetregelaar	Drummond	Hood Mate Model 360	Celcultuur
Serologische pipet, 1 ml	Fisherbrand	13-678-11B	Celcultuur
Serologische pipet, 5 ml	Fisherbrand	13-678-11D	Celcultuur
Serologische pipet, 10 ml	Fisherbrand	13-678-11E	Celcultuur
Weefselkweekincubator	Thermo Scientific	HERACell 150i	CO2 incubator voor celcultuur
Trypan blauw kleurmiddel 0.4%	Invitrogen	T10282	Celtelling