Beoordeling van cellulaire oxidatie met behulp van een subcellulair compartiment-specifieke Redox-gevoelige groene fluorescerende eiwitten

Summary

Dit protocol beschrijft de beoordeling van de subcellulaire compartimentspecifieke redox-status in de cel. Een redoxgevoelige fluorescerende sonde maakt een handige ratiometrische analyse in intacte cellen mogelijk.

Abstract

Het meten van de intracellulaire oxidatie/reductiebalans geeft een overzicht van de fysiologische en/of pathofysiologische redox-status van een organisme. Thiolen zijn vooral belangrijk voor het verlichten van de redox-status van cellen via hun verminderde dithiol en geoxideerde disulfide ratio's. Engineered cysteïne-bevattende fluorescerende eiwitten openen een nieuw tijdperk voor redox-gevoelige biosensoren. Een van hen, redox-gevoelige groene fluorescerende eiwitten (roGFP), kan gemakkelijk worden geïntroduceerd in cellen met adenovirale transductie, waardoor de redox-status van subcellulaire compartimenten kunnen worden geëvalueerd zonder cellulaire processen te verstoren. Verminderde cysteines en geoxideerde cystines van roGFP hebben excitatie maxima op respectievelijk 488 nm en 405 nm, met emissie op 525 nm. Door de verhoudingen van deze verlaagde en geoxideerde vormen te beoordelen, kan de balans van redox in de cel gemakkelijk worden berekend. In deze methode artikel, vereeuwigd menselijke drievoudige negatieve borstkankercellen (MDA-MB-231) werden gebruikt om redox status te beoordelen binnen de levende cel. De protocolstappen omvatten MDA-MB-231 cellijntransductie met adenovirus om cytosolische roGFP uit te drukken, behandeling met H₂O₂, en beoordeling van cysteïne en cystineverhouding met zowel stroomcytometrie als fluorescentiemicroscopie.

Introduction

Oxidatieve stress werd gedefinieerd in 1985 door Helmut Sies als "een verstoring in prooxidant-antioxidant evenwicht ten gunste van de eerste"¹, en een overvloed aan onderzoek is uitgevoerd om ziekte-, voeding-, en veroudering-specifieke redox status van organismen^1,2,3te verkrijgen . Sindsdien is het begrip van oxidatieve stress breder geworden. Het testen van de hypothesen van het gebruik van antioxidanten tegen ziekten en/of veroudering heeft aangetoond dat oxidatieve stress niet alleen schade veroorzaakt, maar ook andere rollen in cellen heeft. Bov....

Protocol

OPMERKING: Dit protocol is geoptimaliseerd voor 70%-80% confluent MDA-MB-231 cellen. Voor andere cellijnen moet het aantal cellen en de veelheid van infectie (MOI) opnieuw worden geoptimaliseerd.

1. Bereiding van cellen (dag 1)

1. Houd de MDA-MB-231 cellijn in 75 cm² kolven met 10 mL gemodificeerd Eagle medium (DMEM) van Dulbecco aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS) bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO_2.
   OPMERKING: DMEM aangevuld met 10% FBS, 37 °C en een 5% CO₂ bevochtigde atmosfeer worden gebruikt voor alle bevestigings- en behandelings incubaties in het gehele protocol.
....

Results

De redoxtoestand van CyS/CySS is gemakkelijk te testen met getransduceerde roGFP's. De fluorescerende sonde kwantificeert de verhouding tussen de verlaagde en geoxideerde vormen (excitatiegolflengten respectievelijk 488 nm en 405 nm). Fluorescentie gegevens kunnen worden verkregen door zowel flow cytometrie en microscopie.

Een groot aantal cellen kan consequent en gemakkelijk worden verkregen met behulp van stroom cytometrie. De analyse bestaat uit 3 hoofdstappen: 1) selecteer de celpopulatie .......

Discussion

De thiol/disulfide balans in een organisme weerspiegelt de redoxstatus van cellen. Levende organismen hebben glutathion, cysteïne, eiwittholen en thiolen met een laag moleculair gewicht, die allemaal worden beïnvloed door het oxidatieniveau en echo van de redoxstatus van cellen^4. Engineered roGFP's maken de niet-verstorende kwantificering van het thiol/disulfide-saldo mogelijk via hun CyS-residuen⁷. De ratiometrische eigenschap van roGFP biedt betrouwbare redoxmetingen voor.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco by Life Sciences	25200-056	Cell culture
4-well chamber slide	Thermo Scientific	154526	Cell seeding material for fluorescent imaging
5 ml tubes with cell strainer cap	Falcon	352235	Single cell suspension tube for flow cytometry analysis
6-well plate	Corning	353046	Cell seeding material for flow cytometry analysis
15 ml conical tubes	MidSci	C15B	Cell culture
75 cm2 ventilated cap tissue culture flasks	Corning	4306414	Cell culture
Adenoviral cytosol specific roGFP	ViraQuest	VQAd roGFP	roGFP construct kindly provided by Dr. Schumaker
Class II, Type A2 Safety Hood Cabinet	Thermo Scientific	1300 Series A2	Cell culture
Countess automated cell counter	Invitrogen	C10227	Cell counting
Countess cell counter chamber slides	Invitrogen	C10283	Cell counting
DMEM	Gibco by Life Sciences	11995-065	Cell culture
FBS	Atlanta Biologicals	S11150	Cell culture
Filtered pipette tips, sterile, 20 µl	Fisherbrand	02-717-161	Cell culture
Filtered pipette tips, sterile, 1000 µl	Fisherbrand	02-717-166	Cell culture
Flow Cytometer	BD Biosciences	LSRFortessa	Instrument equipped with FITC and BV510 bandpass filters for flow cytometry analyses
Fluorescent Microscope	Advanced Microscopy Group (AMG)	Evos FL	Fluorescent imaging
Hydrogen Peroxide 30%	Fisher Scientific	H325-100	Positive control
Light Cube, Custom	Life Sciences	CUB0037	Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 405 nm)
Light Cube, GFP	Thermo Scientific	AMEP4651	Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 488 nm)
MDA-MB-231	American Tissue Culture Collection	HTB-26	Human epithelial breast cancer cell line
Microcentrifuge tubes, 2 ml	Grenier Bio-One	623201	Cell culture
PBS	Gibco by Life Sciences	10010-023	Cell culture
Pipet controller	Drummond	Hood Mate Model 360	Cell culture
Serologycal pipet, 1 ml	Fisherbrand	13-678-11B	Cell culture
Serologycal pipet, 5 ml	Fisherbrand	13-678-11D	Cell culture
Serologycal pipet, 10 ml	Fisherbrand	13-678-11E	Cell culture
Tissue Culture Incubator	Thermo Scientific	HERACell 150i	CO2 incubator for cell culture
Trypan blue stain 0.4%	Invitrogen	T10282	Cell counting