Methodenartikel

Isolatie van vetweefselkern voor eencellige genomische toepassingen

DOI:

10.3791/61230

⸱

12 juni 2020

 , 
1Departments of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, 2Departments of Molecular Pharmacology, Albert Einstein College of Medicine, 3Fleischer Institute of Diabetes and Metabolism

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze publicatie beschrijft een protocol voor de isolatie van kernen van volwassen adipocyten, zuivering door fluorescentie-geactiveerde sortering en transcriptie op eencellig niveau.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bruin en beige vet zijn gespecialiseerde vetweefsels die energie voor thermogenese afvoeren door UCP1 (Uncoupling Protein-1)-afhankelijke en onafhankelijke trajecten. Tot voor kort werden thermogene adipocyten beschouwd als een homogene populatie. Recente studies hebben echter aangetoond dat er meerdere subtypen of subpopulaties zijn die verschillend zijn in ontwikkelingsoorsprong, substraatgebruik en transcriptoom. Ondanks de vooruitgang in eencellige genomics, onbevooroordeelde afbraak van vetweefsel in cellulaire subtypes is uitdagend vanwege de fragiele aard van lipide gevulde adipocyten. Het gepresenteerde protocol werd ontwikkeld om deze obstakels te omzeilen door effectieve isolatie van enkele kernen van vetweefsel voor downstreamtoepassingen, waaronder RNA-sequencing. Cellulaire heterogeniteit kan vervolgens worden geanalyseerd door RNA-sequencing en bio-informatica-analyses.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Studies hebben aangetoond dat bruin vetweefsel (BBT) een opmerkelijke capaciteit heeft om energie te verdrijven. Er bestaan twee soorten thermogene adipocyten met verschillende ontwikkelingskenmerken bij zowel knaagdieren als mensen: beige adipocyten en klassieke bruine adipocyten. Terwijl klassieke bruine adipocyten zich meestal in intercapulaire BAT-depots bevinden, komen beige adipocyten sporadisch naar voren in wit vetweefsel (WAT) in reactie op bepaalde fysiologische signalen, zoals chronische koude blootstelling, een proces dat wordt aangeduid als "bruinen" of "beiging". Door het gebruik van geavanceerde beeldvorming is het nu duidelijk dat volwassen mensen aanzienlijke depots van UCP1+ BAT hebben, vooral in supraclaviculaire regio1,2,3,4. De hoeveelheid volwassen menselijke BAT omgekeerd correleert met adipositeit en kan worden verhoogd door externe signalen, zoals chronische blootstelling aan koude5,,6 of β3-adrenerge receptor agonist7. Door baten gemedieerde energie-uitgaven kunnen een levensvatbare aanpak bieden om obesitas te bestrijden.

Tot voor kort werden thermogene adipocyten beschouwd als een homogene populatie. Studies hebben echter het bestaan van meerdere subtypen of subpopulaties aan het licht gebracht die verschillen in ontwikkelingsoorsprong, substraatgebruik en transcriptome8,9,10. Bijvoorbeeld, een soort beige adipocyte die bij voorkeur glucose gebruikt voor thermogenese, de g-beige adipocyte, werd onlangs beschreven10. Het onvolledige begrip van celtypen in bruin en beige vetweefsel en het ontbreken van specifieke markers vormen een kritieke barrière voor het bestuderen van hun biologische functies.

Traditionele methoden voor het isoleren van subpopulaties van cellen zijn gebaseerd op expressie van slechts een paar bekende markergenen. Recente vooruitgang in eencellige genomics maakt het gebruik van wereldwijde genexpressiegegevens van enkele cellen mogelijk om een onbevooroordeelde schatting te geven van het aantal subpopulaties in een weefsel. Het uiteindelijke doel van dit protocol is om alle vetweefsel subtypes te bepalen onder verschillende thermogene stimuli op een eencellige resolutie. In tegenstelling tot andere weefsels en celtypen is het bepalen van cellulaire subtypes van vetweefsel een uitdaging vanwege de kwetsbaarheid van met lipide gevulde adipocyten. Dit papier introduceert een robuust protocol om enkele kernen te isoleren van vetweefsel voor downstream-toepassing op snRNA-sequencing. Belangrijk is dat recente literatuur die goed overeenkomende single-nuclei RNA sequencing (snRNA-seq) en single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) datasets te vergelijken bleek dat snRNA-seq is vergelijkbaar met scRNA-seq in celtype detectie, en superieur in cellulaire dekking voor een complex weefsel als de hersenen11. Dit protocol combineert een dichtheidsgradiëntcentrifugatiemethode geoptimaliseerd voor vetweefsel door Rosen et al.12 met een kern "cleanup" stap met een MoFlo XDP High Speed Sorter. Zoals te zien in de representatieve resultaten, een analyse van 7.500 enkele kernen van de muis interscapulaire bruin vetweefsel geïdentificeerd meerdere celtypes binnen schijnbaar homogene bruine adipocyten. Over het algemeen kan dit eenvoudige en robuuste protocol worden toegepast om weefsel-niveau organisatie van adipocyten en vet-ingezeten cellen, identificatie van subtype-specifieke marker genen, en ontwikkeling fenotypering van vet-selectieve knock-out / transgene muizen te bestuderen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dierverzorging en experimenten werden uitgevoerd volgens procedures die zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van het Albert Einstein College of Medicine.

1. Voorbereiding van weefselvertering en lysebuffers

  1. Bereid weefselvertering buffer.
    1. Bereid ~ 1 mL digestiebuffer voor elke gram vetweefsel voor.
    2. Weeg 1,5 U/mL collagenase D en 2,4 U/mL dispase II af en voeg fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe.
  2. Bereid de preparaatbuffer voor (NPB).
    1. Bereid 10 mM HEPES, 1,5 m magnesiumchloride, 10 mM kaliumchloride, 250 mM sacharose en 0,1% NP-40 in nuclease-vrij water. Meng goed. Sucrose kan meer tijd in beslag nemen om op te lossen dan de andere componenten.
  3. Bereid 0,5% runderserum albumine (BSA) oplossing voor.
    1. Bereid 0,5% BSA voor in PBS met EDTA. Het wordt aanbevolen om steriel gefilterde celkweekkwaliteit PBS te gebruiken (zie tabel met materialen).

2. Enzymatische vertering van vetweefsel

  1. Dissecten muizen om vetweefsel te extraheren volgens Aune et al.13. Verzamel geïsoleerd weefsel in een schaal met PBS. Breng het weefsel naar een papieren handdoek om droog te deppen. Plaats het weefsel vervolgens in een schone schaal.
  2. Voeg calciumchloride toe aan de spijsverteringsbuffer tot een uiteindelijke concentratie van 10 mM. Voeg een klein volume van de spijsvertering buffer aan de schotel en grondig gehakt het vetweefsel. Het vereiste volume van de spijsverteringsbuffer zal gebaseerd zijn op de hoeveelheid geïsoleerd weefsel. Meestal ~ 1 mL of minder wordt gebruikt.
  3. Voeg ongeveer de helft van de hoeveelheid voorbereide spijsverteringsbuffer (bijvoorbeeld ~ 10 mL voor vijf muizen) toe aan het gehakte weefsel. Breng het monster met behulp van een serologische pipet over op een kegelvormige centrifugebuis van 50 mL. Voeg de resterende hoeveelheid buffer toe om de schotel te wassen en breng over op de buis van 50 mL met het monster. Pipet meerdere keren op en neer. Dan incubeer met schudden bij 200-210 rpm bij 37 °C gedurende 12-15 min.

3. Adipocyte isolatie

  1. Voeg na incubatie 0,5% BSA toe met een verhouding van 1:1 aan het monster. Meng goed door pipetting op en neer meerdere malen. Centrifugeren het monster op 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT) om de stromale vasculaire fractie (SVF) te laten draaien. De adipocytenfractie blijft in de bovenste laag van het monster.
  2. Plaats een 40 μm celfilter bovenop een kegelvormige centrifugebuis van 50 mL en filter het monster, verzamel de bovenste laag en laat de SVF achter aan de onderkant van de buis. Breng de bovenste laag (adipocytefractie) naar een nieuwe buis door het filter ondersteboven over de buis te draaien en 0,5% BSA te gebruiken om het filter om te keren en het monster in de buis te verzamelen.
  3. Breng het totale volume van 0,5% BSA op 10-15 mL op basis van de steekproefgrootte en pipet op en neer met een serologische pipet of schud kort op en neer om het monster te mengen. Centrifuge het monster opnieuw op 300 x g gedurende 5 minuten op RT.

4. Kernisolatie

  1. Gebruik een brede pipettip en breng de toplaag van het monster voorzichtig over naar een 100 μm celfilter dat bovenop een nieuwe voorgebogen buis op ijs is geplaatst, waardoor eventuele resterende SVF achterblijft.
  2. Spoel/was het filter met voldoende NPB en gooi het filter weg. Vanaf deze stap naar voren hebben het monster op ijs zo vaak mogelijk en werk snel om lekkende en / of ongezonde kernen te voorkomen. Het is nuttig om prechill microcentrifuge buizen worden gebruikt in toekomstige stappen op ijs.
  3. Plaats het monster niet meer dan 2 min op ijs met intermitterende zachte omkering van de buis om te mengen. De incubatietijd op ijs moet worden geoptimaliseerd voor de grootte van de monsters en het type adipocyten. Centrifuge bij 1.000 x g bij 4 °C gedurende 10 minuten.
  4. Verwijder de supernatant en resuspend de pellet in 1 mL npb. Breng het monster over naar een schone microcentrifugebuis. Tijdens het overbrengen, vermijd het aanraken van de muren van de buis, die puin en lipide bevatten. Voeg 0,6 U/μL RNase-remmer toe aan het monster en meng. Centrifuge opnieuw bij 1.000 x g bij 4 °C gedurende 10 minuten.
    OPMERKING: De snelheid en tijd van centrifugatie moeten bij deze stap worden verlaagd voor kleinere monsters.
  5. Verwijder de supernatant en resuspend in 1 mL nuclei Wash Buffer (2% BSA/PBS + 0.6 U/μL RNase inhibitor).
  6. Dubbel filter in een schone buis met stapelbare 30 μm filters. Wasfilter met een klein volume (~300 μL) van Nuclei Wash Buffer. U ook voor kleinere monsters een filter van 30 μm gebruiken dat in een microcentrifugebuis past en er rechtstreeks in filteren.
  7. Bevestig een succesvolle isolatie van gezonde kernen.
    1. Vlek een kleine aliquot van het monster met trypan en gebruik een geautomatiseerde cel teller om de gemiddelde dode grootte en procent dode cellen te beoordelen. De gemiddelde dode grootte voor een monster dat meestal kernen bevat, moet variëren tussen 7-10 μm. De grootte van de kernen is meestal ongeveer 8 μm.
    2. Vlek een kleine aliquot van het monster met DAPI en onderzoeken onder een microscoop met een 20x doelstelling of hoger. Het nucleaire membraan moet intact zijn en de kernen moeten rond zijn.

5. FACS cleanup en kernen concentratie stap

  1. Ga onmiddellijk naar de FACS-stap om kernen op te ruimen en overtollig vuil te verwijderen. De opvangbuffer moet Nuclei Wash Buffer bevatten. Tijdens FACS wordt de buffer verdund. Het voorbereiden van een hogere concentratie BSA en RNase remmer om rekening te houden met verdunning tijdens het sorteren is nuttig. Het FACS-opvangblok moet in de koelmodus staan.
  2. Na het sorteren van de kernen, centrifuge op 500 x g gedurende 5 min bij 4 °C om het monster te concentreren. Reconstitueereren in een passend volume van Nuclei Wash Buffer om een concentratie van 500-1.500 kernen/μL te bereiken. Probeer niet om alle supernatant te verwijderen. Hierdoor zullen kernen verloren gaan.
  3. Gebruik een hemocytometer en een DAPI bevlekte aliquot voor een laatste telling en visualiseer de kernen. Ga dan onmiddellijk verder met snRNA-seq volgens het protocol van de fabrikant.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ongesorteerde adipocytekernen bevatten puin en doubletten die ruis en een hoge achtergrond creëren in downstream eencellige RNA-sequencing. De representatieve FACS-poortstrategie is te zien in figuur 1. De kernen werden eerst geselecteerd op basis van forward scatter (FSC) en side scatter (SSC)(A),waarna alleen singlets werden geselecteerd op basis van de combinatie van breedte en hoogten van SSC(B). Ten slotte werden alleen ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een eenvoudige en robuuste methode om enkele kernen te isoleren en vetweefsel heterogeniteit te bestuderen wordt gepresenteerd. Vergeleken met whole tissue RNA sequencing biedt deze workflow een onbevooroordeeld beeld van cellulaire heterogeniteit en populatiespecifieke markers. Dit is significant en innovatief voor de vooruitgang van adipocyte biologie, moleculair metabolisme, en zwaarlijvigheidsonderzoek.

Dit protocol is speciaal geoptimaliseerd voor downstream toepassing van snRNA-seq. De "...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen David Reynolds van de Albert Einstein Genomics kern en Jinghang Zhang van de Flow Cytometry Core bedanken voor technische ondersteuning. We erkennen de steun van de National Institutes of Health (NIH) (DK110426) en Pilot and Feasibility Grants van het Einstein-Mount Sinai Diabetes Research Center (DK020541) en New York Obesity Research Center (DK026687) (allemaal naar K.S.). We willen ook Albert Einstein Cancer Center (CA013330) bedanken voor de kernondersteuning.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
autoMACS Rinsing SolutionMiltenyi Biotec130-091-222PBS met EDTA; sterieel gefilterd
BSASigmaA1595
CaCl2Sigma21115
Cellfilter 100 μmCorning431752
Cellfilter 40μmCorning431750
CellTrics (30 μm)Sysmex04-004-2326
Collagenase DRoche11088866001
Countess II FL Geautomatiseerde CeltellerInvitrogenAMQAF1000
DAPISigmaD9542
Dispase IIRoche4942078001
HEPESSigmaH4034
KClFisherP217-3
MACS SmartStrainers (30 µm)Miltenyi Biotec130-098-458Stapelbare filters
MgCl2SigmaM1028
MoFloXDP CelsorteerderBeckman CoulterML99030
NP-40Sigma74385
Protector RNase InhibitorRoche3335402001
SucroseFisherS5-3

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1509-1517 (2009).
  2. van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1500-1508 (2009).
  3. Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1518-1525 (2009).
  4. Nedergaard, J., Bengtsson, T., Cannon, B. Unexpected evidence for active brown adipose tissue in adult humans. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 293 (2), E444-E452 (2007).
  5. Saito, M., et al. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58 (7), 1526-1531 (2009).
  6. Yoneshiro, T., et al. Recruited brown adipose tissue as an antiobesity agent in humans. The Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3404-3408 (2013).
  7. Cypess, A. M., et al. Activation of human brown adipose tissue by a β3-adrenergic receptor agonist. Cell Metabolism. 21 (1), 33-38 (2015).
  8. Song, A., et al. Low- and high-thermogenic brown adipocyte subpopulations coexist in murine adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 247-257 (2020).
  9. Cinti, S., et al. CL316,243 and cold stress induce heterogeneous expression of UCP1 mRNA and protein in rodent brown adipocytes. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 50 (1), 21-31 (2002).
  10. Chen, Y., et al. Thermal stress induces glycolytic beige fat formation via a myogenic state. Nature. 565 (7738), 180-185 (2019).
  11. Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PloS One. 13 (12), e0209648(2018).
  12. Roh, H. C., et al. Simultaneous Transcriptional and Epigenomic Profiling from Specific Cell Types within Heterogeneous Tissues In Vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
  13. Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191(2013).
  14. Zheng, G. X. Y., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8, 14049(2017).
  15. Pollen, A. A., et al. Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex. Nature Biotechnology. 32 (10), 1053-1058 (2014).
  16. Hayashi, T., et al. Single-cell full-length total RNA sequencing uncovers dynamics of recursive splicing and enhancer RNAs. Nature Communications. 9 (1), 619(2018).
  17. Satpathy, A. T., et al. Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion. Nature Biotechnology. 37 (8), 925-936 (2019).
  18. Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods. 14 (9), 865-868 (2017).
  19. Peterson, V. M., et al. Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells. Nature Biotechnology. 35 (10), 936-939 (2017).
  20. Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10 (1), 2907(2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Isolatie van enkelvoudige kernenbuffer voor kernenpreparatiestromale vasculaire fractiewasbuffer voor kernenTrypanblauw kleuringDAPI kernkleuringFACS kernensorteringsingle cell RNA sequencingt SNE dimensionaliteitsreductie

Gerelateerde artikelen