Longitudinale In Vivo Beeldvorming en kwantificering van menselijke alvleesklier eilandjes en bijdragende gastheercellen in de oogkamer van het voorste oog

Samenvatting

Het doel van dit protocol is om continu de dynamiek van het menselijke alvleesklier eilandje engraftment proces en de bijdragende gastheer versus donorcellen te controleren. Dit wordt bereikt door het transplanteren van menselijke eilandjes in de voorste kamer van het oog (ACE) van een NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sor^tm4-Rag2^-/-muisontvanger gevolgd door herhaalde 2-foton beeldvorming.

Samenvatting

Imaging bètacellen is een belangrijke stap in de richting van inzicht in eilandjestransplantatie. Hoewel verschillende beeldvormingsplatforms voor de registratie van bètacelbiologie in vivozijn ontwikkeld en gebruikt, zijn ze beperkt in termen van het toestaan van eencellige resolutie en continue longitudinale opnames. Vanwege de transparantie van het hoornvlies is de voorkamer van het oog (ACE) bij muizen zeer geschikt om de biologie van menselijke en muizenalvleeskliercelen te bestuderen. Hier is een beschrijving van hoe deze aanpak kan worden gebruikt om continue longitudinale opnames van enten en revitalisering van individuele menselijke eilandjes enten uit te voeren. Menselijke eilandjestransplantaties worden in de ACE ingebracht met behulp van NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sor^tm4-Rag2^-/-muizen als ontvangers. Dit maakt het mogelijk om de uitbreiding van ontvanger versus donorcellen en de bijdrage van de ontvangende cellen bij het bevorderen van de inkapseling en vascularisatie van het transplantaat mogelijk te maken. Verder wordt een stapsgewijze benadering geschetst voor beeldanalyse en kwantificering van het eilandjevolume of gesegmenteerde vasculatuur en eilandjescapsule die ontvangende cellen vormt.

Inleiding

Diabetes mellitus beschrijft een groep van metabole ziekten gekenmerkt door verhoogde niveaus van bloedglucose als resultaten van onvoldoende insulineproductie van verlies of disfunctie van pancreas islet bètacellen, vaak vergezeld van insulineresistentie. Type 1 (T1D) en type 2 diabetes (T2D) zijn complexe ziekten waarbij de progressieve disfunctie van de bètacellen ziekteontwikkeling veroorzaakt. T1D wordt neergeslagen door een auto-immuunaanval op de bètacellen, terwijl T2D wordt beschouwd als aangedreven door metabole factoren, zij het met toenemend bewijs van low-grade systemische ontsteking¹. Transplantatie van donor menselijke eilandjes, met name voor T1D-patiënten, biedt het potentieel voor het verstrekken van fysiologische glycemische controle. Echter, een tekort aan weefseldonoren en slechte eilandjes engraftment heeft voorkomen dat eilandjetransplantatie uitgegroeid tot een mainstream therapeutische optie. Een aanzienlijk deel van het functionele eilandjetransplantatie gaat verloren in de onmiddellijke posttransplantatieperiode (24-48 uur) als gevolg van de hypoxische, inflammatoire, immunogene gastheeromgeving^2,3. Om de efficiëntie van interventiemethoden voor de verbetering van de overleving van eilandjes te evalueren, is continue monitoring van dergelijke transplantaties noodzakelijk.

In vivo technieken om beeld en het lot van getransplanteerde menselijke alvleesklier eilandjes na transplantatie blijft nog steeds een uitdaging voor diabetes onderzoek^4,5. Tot op heden tonen niet-invasieve beeldvormingstechnieken, waaronder positronemissietomografie (PET), magnetic resonance imaging (MRI) of echografie (VS) potentieel voor de kwantificering en functionele evaluatie van getransplanteerde eilandjes in experimentele omstandigheden⁵. Gezien de kleine eilandjesgroottes hebben kwantitatieve metingen op deze modaliteiten echter onvoldoende resolutie. De voorste oogkamer (ACE) als transplantatielocatie voor observatie is een veelbelovende niet-invasieve beeldvormingsoplossing die effectief een hogere ruimtelijke resolutie en frequente monitoring over lange perioden^{biedt 6}. Deze methode is met succes benut om muis eilandje biologie te bestuderen (beoordeeld in Yang et al.⁷), auto-immuunreacties 8 ,^evenalsmenselijk eilandje enten^9,10.

Hier wordt de ACE-transplantatiemethode gecombineerd met een 2-fotonbeeldvormingsbenadering om de dynamiek van het menselijke alvleesklierenteletproces te onderzoeken door continue en herhaalde opnames op individuele eilandjestransplantaten tot 10 maanden na transplantatie. De multifoton beeldvormingseigenschappen van grotere beelddiepten en verminderde algehele fotobleaching en fotoschade overwinnen de beeldvormingsbeperkingen van confocale microscopie¹¹. Kwantificering van fluorescerende beeldvorming omvat verschillende fasen, waaronder het voorbereiden van eilandjesvoorbeelden, eilandjestransplantatie, beeldverwerving, beeldfiltering om eilandjesruis of achtergrond, segmentatie, kwantificering en gegevensanalyse te verwijderen. De meest uitdagende stap is meestal het partitioneren of segmenteren van een afbeelding in meerdere delen of regio's. Dit kan het scheiden van signaal van achtergrondgeluid, of clustering regio's van voxels op basis van gelijkenissen in kleur of vorm te detecteren en labelvoxels van een 3D-volume dat eilandje vasculatuur vertegenwoordigt, bijvoorbeeld. Eenmaal gesegmenteerd, statistieken zoals object volume maten zijn meestal eenvoudig te extraheren. Voorzien is een methode voor de kwantificering en extractie van de beeldgegevens, zoals segmentatie en datavisualisatie. Bijzondere aandacht wordt besteed aan het verwijderen van autofluorescentie in menselijke eilandjes en onderscheid tussen eilandje vasculatuur en eilandje capsule vormen ontvanger cellen.

Protocol

De Regionale Ethische Commissie in Lund, Zweden, keurde de studie volgens de Wet betreffende de Ethische Overzicht van Onderzoek in het betreffen van Mensen goed. Dierproeven werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de Zweedse ethiek van dierproeven en goedgekeurd door de ethische commissies van Malmö en Lund. 6 tot 8 weken oude immunodeficiënte NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sor^tm4-Rag2^-/- (NOD. ROSA-tomaat. Rag2^-/-ontvangende muizen werden gebruikt als ontvangers voor transplantatie van menselijke eilandjes¹⁰.

1. Voorbereiding van eilandjes op transplantatie

1. Kweek menselijke eilandjes in CMRL 1066 aangevuld met 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamine, 50 μg/mL gentamycine, 0,25 μg/mL fungizone, 20 μg/mL ciproxfloxacin, 10 mM nicotinamide (NIC) en 10% warmte-geïnactiveerd menselijk serum bij 37 °C in 5% CO₂ en bevochtigde lucht tot transplantatie, zoals eerder beschreven¹².
   OPMERKING: Eilandjes moeten vrij zijn van exocriene weefsel en elkaar niet raken in de cultuur. Exocriene weefsels lijken doorschijnend.
2. Op de dag van transplantatie, overdracht cultuur media met de eilandjes naar een nieuwe petrischaal met behulp van een aspirator buis assemblage aangesloten op een getrokken glazen capillaire.
   OPMERKING: Gebruik ook een pipet van 200 μL. Het kleuren van de achterkant van de petrischaal helpt om de eilandjes gemakkelijker te onderscheiden onder de stereomicroscoop.
3. Kies met behulp van een stereomicroscoop ~20-40 eilandjes per transplantatie en breng over op een buis van 1,5 mL. Vul de buis naar de top met cultuurmedia uit de couveuse.
4. Verzegel de buizen met paraffinefolie en bewaar op ijs tot transplantatie. Bereid een passend bedrag voor voor het aantal uitgevoerde transplantaties.
5. U er ook voor zorgen dat er een CO_2-incubator beschikbaar is in de operatiekamer om eilandjes in de cultuur te houden en ze onmiddellijk voorafgaand aan elke transplantatie te plukken.

2. Voorbereiding van transplantatieapparatuur en operatietafel

OPMERKING: Alle chirurgische hulpmiddelen moeten automatisch worden gedeslaveerd en de operatietafel en instrumenten worden gedesinfecteerd met 70% alcohol.

1. Sluit een stereotaxic hoofdhouder aan op anesthesie via een neusmasker en zet het verwarmingskussen aan.
2. Sluit een gastight Hamilton spuit aan polyethyleen buizen en een stompe einde oog canule.
   LET OP: Het wordt aanbevolen om alle onderdelen te vullen met PBS voor de montage. Controleer op gevangen luchtbellen en verwijder indien aanwezig.
3. Bevestig de Hamilton spuit stevig aan de tafel(Figuur 1a) of een beweegbare basis (Figuur 1e) en bevestig de slang aan de stereomicroscoop, met canule opknoping naar beneden (dat wil zeggen, wachtpositie).
   OPMERKING: Gebruik chirurgische tape, omdat het gemakkelijk is te verwijderen en opnieuw vast te maken.
4. Bereid een 1 mL spuit aangesloten op een 30 G naald gevuld met 0,1 mg/kg buprenorfine oplossing.
5. Bereid een spuit met steriele PBS. U ook een pipet gebruiken.
6. Zet een schone wake-up kooi met verwarmingslamp opzij.

3. Anesthesie en positionering van de ontvangende muizen voor een operatie

OPMERKING: Alle dieren werden gefokt en onderhouden in een ziekteverwekkervrije omgeving in de dierenfaciliteiten van de Universiteit van Lund.

1. Verdoven de muis in een kamer gevuld met 40% O₂/60% N₂/3% isoflurane en breng de verdoofde muis over naar het hoofdhouderplatform op een warm verwarmingskussen(figuur 1a). Controleer op het gebrek aan pedaalreflexen.
   OPMERKING: Isoflurane anesthesie is de voorkeursmethode van anesthesie voor snel herstel na de operatie. De microscoopruimte moet goed worden geventileerd om isoflureus te gebruiken.
2. Plaats de snuit van de muis in het anesthesiemasker aangesloten op 40% O₂/60% N₂/0,9%-1,5% isoflurane anesthesie machine. Gebruik de duim en vinger om het hoofd iets omhoog te tillen en vast te maken met behulp van de metalen stukken aan de zijkanten. Zorg ervoor dat de oortjes het hoofd direct onder de oren bevestigen. Injecteer 0,1 mg/kg buprenorfineoplossing onderhuids op de achterkant van de muis.
   LET OP: Buprenorfine wordt gebruikt als pijnstiller.
3. Kantel het hoofd, zodat het te bedienen oog naar boven gericht is en dicht bij de onderzoeker staat.
4. Trek voorzichtig de oogleden van het oog te worden getransplanteerd met behulp van stompe tangen, pop het oog uit, en losjes vast te stellen met een pincet. Zorg ervoor dat de uiteinden van de pincet zijn bedekt met een polyethyleenbuis die aan het hoofdhouderplatform is bevestigd (figuur 1a, insert).
5. Houd beide ogen altijd nat door een druppel steriele PBS op het oog aan te brengen.
6. Breng de menselijke eilandjes van de verzegelde 1,5 mL buis (sectie 1) naar een petrischaaltje met steriele PBS en zorg ervoor dat de eilandjes dicht bij elkaar liggen om de hoeveelheid overgedragen celkweekmedia te minimaliseren(figuur 1c).
7. Pick-up ~ 20-30 eilandjes in het oog canule aangesloten via polytheen buizen aan de Hamilton spuit.
   LET OP: Neem zo min mogelijk vloeistof op met de eilandjes.
8. Hang de slang ondersteboven en bevestig aan de stereomicroscoop(Figuur 1d). Tape de slang zorgvuldig te laten de eilandjes zinken tot het einde van de buis in de richting van de canule.

4. Transplantatieprocedure

OPMERKING: Deze methode is eerder beschreven voor de transplantatie van muiseilandjes⁶. Een licht gewijzigde procedure wordt hier gepresenteerd.

1. Knijp de pads op de achterpoten om ervoor te zorgen dat de muis slaapt.
2. Draai de tangen die het oog beperken zonder de bloedstroom te verstoren en breng een druppel steriele PBS op het oog aan.
3. Met behulp van een 25 G naald als scalpel, schuine kant naar boven, zorgvuldig doordringen slechts de helft van de tip in het hoornvlies en maak een enkele laterale incisie. Maak het gat in een opwaartse hoek; het gat zal gemakkelijker verzegelen na de transplantatie(figuur 1f).
4. Til voorzichtig het hoornvlies op met de canule voorgeladen met eilandjes en breng langzaam eilandjes in het oog aan. Vermijd het inbrengen van de canule in de voorste kamer om schade aan de iris te voorkomen, maar duw voorzichtig tegen de hoornvliesopening(figuur 1g).  Trek de canule langzaam uit de ACE.
   LET OP: Streef naar een injectievolume van 3–8 μL. Als het volume te groot is, zal het het oog blootstellen aan onnodig hoge intraoculaire druk en kan leiden tot reflux van de geïnjecteerde eilandjes uit de voorkamer.
5. Bij problemen met het inbrengen van de eilandjes als gevolg van verhoogde druk in de oogkamer, vergroot u de incisieplaats door de laterale incisieplaats te versterken en de eilandjes opnieuw aan te brengen.
   OPMERKING: Af en toe kunnen geïntroduceerde luchtbellen worden gebruikt als ruimtehouders.
6. Breng ooggel aan op het oog, maak de oogbedwingende tangen los en laat de muis gedurende 8-10 minuten in dezelfde positie staan om de eilandjes te laten instellen.
7. Verwijder de tangen die het ooglid vasthouden en zet het ooglid terug naar zijn normale positie.
8. Haal de muis van de hoofdhouder en breng deze over naar een wake-up kooi.
9. Wanneer de muis wakker is en beweegt, breng deze terug naar de oorspronkelijke kooi en bewaar deze in de dierenstal tot het scannen (ten minste 5 dagen worden aanbevolen).

5. Beeldvorming van geïmplanteerde menselijke eilandjes door 2-fotonmicroscopie

OPMERKING: Het nemen van overzichtsbeelden van het oog met behulp van een fluorescentie stereoscopische microscoop (Figuur 2a–c) 4-5 dagen na transplantatie voorafgaand aan 2-foton beeldvorming wordt aanbevolen om de eilandjes van belang te lokaliseren. Vermijd het beperken van het oog te strak zo vroeg na transplantatie. Gebruik 2-foton beeldvorming 6-7 dagen natransplantatie.

1. Start de software voor het verwerven van afbeeldingen (zie Tabel van Materialen). In het menu "Laser" activeer je de Mai Tai laser (Power "ON") en stel in het menu "Light Path" de golflengte in op 900 nm en breng je een minimale transmissielaserkracht toe vanaf 5%-10% laserkracht (gebruik schuifregelaars).
   OPMERKING: Tijdens het scannen, pas de laser kracht als dat nodig is.
2. Zet groene, oranje en rode kanalen in. Verzamel emissielicht tegelijkertijd op drie niet-gescande detectoren (NDD) met behulp van een dichronische spiegel (LBF 760) en informatie over emissiefilters: Red/Angiosense 680, 690–730 nm; Groen/Autofluorescentie, 500-550 nm; en Sinaasappel/Tomaat, 565-610nm (Figuur 2d).
3. Plaats het hoofdhouder stadium op de gemotoriseerde microscoop stadium en sluit het gasmasker aan de slang van de anesthesie machine en buizen aangesloten op ventilatiesysteem. Zet het verwarmingskussen aan.
4. Verdoven de ontvanger muis, overdracht naar het hoofdhouder platform, beperken het oog voor beeldvorming, en beheren buprenorfine oplossing zoals hierboven beschreven (stappen 3.1–3.5).
5. Pas isoflurane dampen indien nodig aan. Een ademsnelheid van ~55-65 ademhalingen per minuut (bpm) duidt op optimale anesthesie. Als anesthesie te diep is, zal het tarief <50 bpm met zware ademhaling of het hijgen zijn; als te licht, zal het tarief >70 bpm met oppervlakkige ademhaling zijn. Controleer muizen zorgvuldig tijdens anesthesie door visuele inspectie om de 15 minuten.
   OPMERKING: Verdoving varieert van muis tot muis, tussen muisstammen en naarmate de tijd onder narcose vordert¹³.
6. Toedien voldoende ooggel op het oog als een onderdompelingsvloeistof tussen het hoornvlies en de lens, waardoor deze zich langzaam ophoopt(figuur 2f, insert). Vermijd luchtbellen.
   OPMERKING: Zijverlichting met een flexibele metalen slanglamp wordt aanbevolen om de focus aan te passen en eilandjes grafts te lokaliseren.
7. Om bloedvaten te visualiseren, dient u 100 μL van het beeldvormingsmiddel (bijvoorbeeld Angiosense 680) intraveneus in de staartader met behulp van een wegwerpsusuline 30 G spuit.
8. In de" Acquisitiemodus" pas de framegrootte aan op 512 x 512 en de scansnelheid.
   OPMERKING: Tragere scans (d.w.z. het verhogen van de verblijfstijd) zullen de signaal-ruisverhouding verbeteren.
9. Pas in het menu" Kanalen" Master Gain voor elke PMT in Volt aan om het signaal te versterken totdat een afbeelding op het scherm in de live scanmodus wordt gezien. Hoe hoger deze waarde, hoe gevoeliger de detector wordt voor signaal en ruis.
   LET OP: Houd bij voorkeur waarden tussen 500-800 V.
10. Definieer in het menu "Z-stack" het begin en het einde van de z-stack door de focus handmatig naar de bovenkant van het eilandje graft te verplaatsen. Sla positie op door 'Set First'te selecteren. Ga naar het laatste onderste vlak dat kan worden gericht in het eilandje graft en sla positie door te selecteren"Laatste instellen". Gebruik een z-stap grootte van 2 μm.
11. Verzamel de uiteindelijke afbeeldingsstack door op het tabblad Experimentstartente klikken en op te slaan als 8-bits CZI -bestand (d.w.z. Carl Zeiss-indeling).

6. Beeldvorming van geïmplanteerde menselijke eilandjes door confocale microscopie

OPMERKING: Het totale volume, morfologie en plasticiteit van getransplanteerde eilandjes kunnen worden beoordeeld door het in vivo verstrooiingssignaal in een afzonderlijke scan (d.w.z. afzonderlijk spoor) te controleren door detectie van laserruglicht¹⁰.

1. Schakel de grootlichtsplinter (d.w.z. LBF-filter) uit en stel in het dialoogvenster" Lichtpad" een apart spoor in voor confocale beeldvorming. Kies de Argon laser met golflengte van 633 nm en detectie op dezelfde golflengte als het laserlicht. Z-stacks worden verworven met een stapgrootte van 2-3 μm voor backscatter lichtsignaal.
2. Pas de z-stack instellingen aan om ervoor te zorgen dat het hele eilandje wordt opgenomen (zie stap 5.10).
3. Verwerf de afbeeldingsstack en sla op als 8-bits CZI-bestand.

7. Beeldanalyse

OPMERKING: Voor deze stap werd commerciële software (zie Tabel van Materialen)gebruikt.

1. Verwijderen van islet autofluorescentie(figuur 3b)
   1. Kies in het tabblad "Beeldverwerking" "Kanaalreken"en typ "ch1-ch2". Hierdoor ontstaat een nieuw kanaal 4 (ch 4); naamswijziging als "Vasculature".
      OPMERKING: Het kanaal Groen/Autofluorescentie wordt afgetrokken van het Kanaal Rood/Angiosense.
   2. Herhaal de vorige stap en typ "ch3-ch2" om een nieuw kanaal te creëren (ch 5); naam hernoemen als"Tomaat (alle)".
      LET OP: Het kanaal Groen/Autofluorescentie wordt afgetrokken van het kanaal Oranje/Tomaat.
2. Eilandjesmasker definiëren door handmatig tekenen(figuur 3c)
   1. Maak een nieuw oppervlak (blauw symbool) en kies in de wizardhandmatig bewerken. Houd de aanwijzer in de modus' Selecteer' en klik in de 3D-weergave niet opVolume(onder Scène)om secties te visualiseren.
   2. Activeer alle kanalen, inclusief ch 1–ch 3, voor een eenvoudigere isletgrensdiscriminatie.
      LET OP: Het kanaal Oranje/Tomaat is handig om eilandjesgrenzen te definiëren aan de kant van het tomaatcapsulesignaal. U ook de kanaalintensiteiten verhogen om meerkanaals eilandje autofluorescentie en detectorachtergrondsignaal als begeleiding te gebruiken.
   3. Kies op het tabblad' Tekenen'Contour' en klik opTekenenom contouren rond de eilandjesrand te tekenen vanaf slicepositie 1.
   4. Naar een nieuwe segmentpositie gaan en tekencontouren herhalen. Werk af met het laatste segment boven aan het eilandje en klik door op het tabblad' Oppervlak maken'te klikken. Meestal is het genoeg om contouren^th te tekenen om de 10e slice.
3. Segmentatie van "Islet vasculature" en "Islet tomaat" fluorescentie met behulp van eilandjesmasker (Figuur 3d).
   1. Kies het eerder gedefinieerde object"Eilandjesmasker",ga naar het tabblad bewerken(potloodsymbool) en klik op het tabblad'Allesmaskeren', waarmee een nieuw venster wordt geopend.
   2. Kies het eerder genoemde kanaal "Vasculature" (ch 4) in het vervolgkeuzemenu kanaalselectie en activeer opties "Duplicate channel before applying mask", " Constantinside/outside", en stel voxels buiten oppervlak in op "0,000", waardoor een nieuw kanaal wordt gemaakt; naam te noemen als "Islet vasculature" (ch 6).
   3. Herhaal stap 7.3.1 en 7.3.2 en kies het eerder gemaakte kanaal"Tomato (all)"(ch 5) in het vervolgkeuzemenu kanaalselectie om het nieuwe kanaal te maken; de naam "Islet tomaat" (ch 7) te noemen.
4. Oppervlakteweergave van eilandje vasculatuur (Figuur 3e)
   1. Maak een nieuw oppervlak in het menu "Scène" en kies in de wizard "Automatische creatie".
   2. Stel het bronkanaal in op eerder gemaakte "Islet vasculature" (ch 6) en kies achtergrondaftrekken. Indien nodig kan de automatische drempelschatting worden aangepast. Vergelijk met het reagerende fluorescentiekanaal (bijvoorbeeld door het nieuw gemaakte tabblad oppervlakte in/uit te mengen). Ga verder in de tovenaar.
   3. Gebruik optioneel filters. Kies bijvoorbeeld 'Volume'en pas het filter (geel) in het venster aan, waarmee geselecteerde oppervlakteobjecten kunnen worden verwijderd. Maak de wizard af en noem het nieuwe oppervlakobject "Islet vasculature".
5. Segmentatie van "Islet tomaat vasculature" fluorescentie signaal (Figuur 3f)
   1. Ga in het eerder gemaakte oppervlakobjectIslet vasculature naar het tabblad Bewerken en klik op het tabblad'Allesmaskeren', waarmee een nieuw venster wordt geopend.
   2. Kies het eerder genoemde kanaal "Islet tomaat" (ch 7) in het vervolgkeuzemenu van de kanaalselectie en stel voxels buitenoppervlak in op "10.000", waardoor het nieuwe kanaal wordt gemaakt; naam te noemen als "Islet tomaat vasculatuur" (ch 8).
6. Segmentatie van "Tomaatcapsule" fluorescentiesignaal (Figuur 3g)
   1. Kies "Channel Arithmetic's" in het tabblad "Image processing" en typ "ch7-ch8", waardoor het nieuwe kanaal wordt gemaakt; omgedoopt tot "Tomato capsule" (ch 9).
      OPMERKING: Hetfluorescentiesignaal " Islet tomaat" wordt afgetrokken van het totale "Islet tomaat" fluorescentiesignaal.
7. Oppervlakteweergave van "Islet tomato vasculature" en "Tomato capsule" (Figuur 3h)
   1. Volg stap 7.4 en kies in de wizard bronkanalen "Islet tomato vasculature" (ch 8) of "Tomato capsule" (ch 9) om nieuwe oppervlakteobjecten dienovereenkomstig te creëren.
8. Oppervlakteweergave van het totale eilandjesoppervlak (figuur 3i)
   1. Open het backscatterbestand van de eilandjes en maak een nieuw oppervlak.
   2. Kies in de wizard 'Automatische creatie'en definieer 'Regio van belang'.
      OPMERKING: "Regio van belang" wordt gebruikt om de signalen van meerdere eilandjes te scheiden en om de diepte van het te analyseren eilandje te definiëren (bijvoorbeeld top 75 μm).
   3. In "Absolute intensiteit" pas de drempel indien nodig aan. Het oppervlakobject kan aan of uit worden geklikt om te controleren met de bijbehorende kanaalintensiteit. Sluit de tovenaar.
9. Kwantificering (Figuur 3j)
   1. Selecteer een gemaakt oppervlakteobject in het menu 'Scène' en ga naar het tabbladStatistieken.
   2. Als u gedetailleerde volumegegevens wilt ophalen in het geselecteerde oppervlakteobject, kiest u het tabblad "Gedetailleerd" en selecteert u "Specifieke waarden" en "Volume" in het vervolgkeuzemenu. Als u een totale volumewaarde van het geselecteerde oppervlakteobject wilt ophalen, gaat u naar het tabbladGedetailleerden kiest uGemiddelde waarden.

Resultaten

Niet-gelabelde menselijke eilandjes werden getransplanteerd in de ACE van 8 weken oude vrouwelijke NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sor^tm4-Rag2^-/-(NOD. ROSA-tomaat. Rag2^−/−) ontvanger muizen. Om afstoting van menselijk weefsel te voorkomen, werden immunodeficiënte Rag2 knock-out muizen gekozen als ontvangers. In deze transgene muizen, alle cellen en weefsels uitgedrukt een membraan-gerichte tomaat fluorescentie eiwit (mT) dat een duidelijke identificatie va...

Discussie

Een methode wordt gepresenteerd om het menselijke alvleesklier eilandjeceltransplantatieproces te bestuderen door de betrokkenheid van ontvanger en donorweefsel te observeren. Na een minimale invasieve operatie die menselijke eilandjes implanteert in de voorkamer van een immunodeficiënt muizenoog, herstelt de muis snel binnen enkele minuten na de operatie. De procedure wordt uitgevoerd op één oog. Over het algemeen is het hoornvlies vanaf 5-7 dagen na de implantatie voldoende genezen om intravital beeldvorming uit te voe...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400	Agnthos	8323001	gebruikt voor isofluran anesthesie tijdens chirurgie en beeldvorming
-inductiekamer 1,4 L	Agnthos	8329002	aansluiten via slang op U-400
-gas routeringsschakelaar	Agnthos	8433005	aansluiten via slang op U-400
AngioSense 680 EX	Perkin Elmer	NEV10054EX	beeldvormingsmiddel voor injectie, gebruikt om bloedvaten in humane eilandjestransplantaten af te beelden
Aspiratiebuisassemblages	Sigma	A5177-5EA	verbinden met getrokken capillaire pipetten voor handmatig eilandje oogsten
Buprenorfine (Temgesic) 0,3mg/ml	Schering-Plough Europe	64022	vloeistof, voor pijnverlichting
Capillaire pipetten	VWR	321242C	gebruikt samen met aspiratiebuisassemblages
Dextran-Texas Red (TR), 70kDa	Invitrogen	D1830	beeldvormingsmiddel voor injectie
Oogcanule, stompe punt, 25 G	BVI Visitec/BD	BD585107	op maat gemaakt van Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], afmetingen: 0,5 x 22 mm (25G x 7/8in) (45?), punt taps toelopend naar 30 G (0,3 mm)
Ooggel	Novartis		Viscotears, bevat Carbomer 2 mg/g
Hamilton-spuit 0,5 ml, Model 1750 TPLT	Hamilton	81242	Plunger type gas-tight spuit voor eilandjesinjectie
Kophouders
-Kophoudende adapter	Narishige	SG-4N-S	geassembleerd op metalen plaat
-gasmasker	Narishige	GM-4-S
-UST-2 Solid Universal Joint	Narishige	UST-2	geassembleerd op metalen plaat
-op maat gemaakte metalen plaat voor kophouderassemblage
-Dumont #5, recht	Agnthos	0207-5TI-PS of 0208-5-PS	bevestigd aan UST-2 (op maat gemaakt)
Verwarmingspad, op maat gemaakt			op het stereotaxische platform getaped
Humaan eilandje kweekmedia
-CMRL 1066	ICN Biomedicals		celkweekmedia voor humane eilandjes
-HEPES	GIBCO BRL
-L-glutamine	GIBCO BRL
-Gentamycine	GIBCO BRL
-Fungizone	GIBCO BRL
-Ciprofloxacine	Bayer healthcare AG
-Nicotinamide	Sigma
Beeldanalysesoftware	Bitplane		Imaris 9
Beeldverwervingssoftware	Zeiss		ZEN 2010
Infraroodlamp	VWR	1010364937	gebruikt om dieren warm te houden in de opwekkooien
Isofluraan Isoflo	Abott Scandinavia/Apotek		vloeistof, voor anesthesie
Naald 25 G (0,5 x 16 mm), oranje	BD	10442204	gebruikt als scalpel
Petrischalen, 90 mm	VWR	391-0440
2-Foton/confocale microscoop
-LSM7 MP rechtopstaande microscoop	Zeiss
-Ti:Saffier laser Tsunami	Spectra-Physics, Mai Tai
-langafstandswaterdompellens 20x/NA1.0	Zeiss
-ET710/40m (Angiosense 680)	Chroma	288003
-ET645/65m-2p (TR)	Chroma	NC528423
-ET525/50 (GFP)	Chroma
-ET610/75 (tomaat)	Chroma
-hoofdstraalsplitter T680lpxxr	Chroma	T680lpxxr	Dichroic spiegel om 690 nm en hoger door te laten en 440 tot 650 nm te reflecteren, maat 25,5 x 36 x 1 mm
Polyethyleenslang (0,38 mm ID, 1,09 mm OD)	Smiths Medical Danmark	800/100/120	om aan te sluiten op Hamilton-spuit en oogcanule
Stereomicroscoop	Nikon		Model SMZ645, voor eilandje oogsten
Stereomicroscoop (fluorescentie)			voor eilandje transplantaat beeldvorming
-AZ100 Multizoom	Nikon		breed veld en lange afstand
-AZ Plan Apo 1x	Nikon
-AZ Plan Apo 4x	Nikon
-AZ-FL Epifluorescentie met C-LHGFI HG-lamp	Nikon
-HG Manuele New Intensilight	Nikon
-Epi-FL Filterblok TEXAS RED	Nikon		bevat EX540-580, DM595 en BA600-660
-Epi-FL Filterblok G-2A	Nikon		(EX510-560, DM575 en BA590)
-Epi-FL Filterblok B-2A	Nikon		(EX450-490, DM505 en BA520)
-DS-Fi1 kleurendigicamera (5 MP)	Nikon
Spuit 1 ml, Omnitix	Braun	9161406V	voor Buprenorfine-injectie, gebruikt met 27 G naald
Chirurgisch tape	3M