Transcellulaire interacties meten via eiwitaggregatie in een heterologe celsysteem

Summary

Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol om snel en semiquantitatief ligand-receptor interacties in trans te meten in een heterologe celsysteem met behulp van fluorescentiemicroscopie.

Abstract

Eiwitinteracties op cellulaire interfaces dicteren een veelheid aan biologische uitkomsten, variërend van weefselontwikkeling en kankerprogressie tot synapsvorming en -onderhoud. Veel van deze fundamentele interacties komen voor in trans en worden meestal veroorzaakt door heterofiele of homofiele interacties tussen cellen die membraanverankerde bindingsparen uitdrukken. Het ophelderen hoe ziekterelevante mutaties deze fundamentele eiwitinteracties verstoren, kan inzicht geven in een groot aantal celbiologievelden. Veel eiwit-eiwit interactietests zijn meestal niet disambiguate tussen cis en trans interacties, wat mogelijk leidt tot een overschatting van de mate van binding die optreedt in vivo en omvat arbeidsintensieve zuivering van eiwitten en / of gespecialiseerde bewakingsapparatuur. Hier presenteren we een geoptimaliseerd eenvoudig protocol dat het mogelijk maakt om alleen transinteracties te observeren en te kwantificeren zonder dat langdurige eiwitzuiveringen of gespecialiseerde apparatuur nodig zijn. De HEK-celaggregatietest omvat het mengen van twee onafhankelijke populaties HEK-cellen, die elk membraangebonden cognate liganden uitdrukken. Na een korte incubatieperiode worden monsters in beeld genomen en worden de resulterende aggregaten gekwantificeerd.

Introduction

Synaptische interacties gefaciliteerd door synaptische adhesiemoleculen zijn fundamenteel voor de ontwikkeling, organisatie, specificatie, onderhoud en functie van synapsen en de generatie van neurale netwerken. De identificatie van deze transsynaptische celhechtingsmoleculen neemt snel toe; het is dus van fundamenteel belang om bindende partners te identificeren en te begrijpen hoe deze nieuwe hechtingsmoleculen met elkaar interageren. Bovendien heeft genoomsequentie mutaties geïdentificeerd in veel van deze hechtingsmoleculen die vaak verband houden met een veelheid aan neuroontwikkelings-, neuropsychiatrische en verslavingsstoornissen¹. Muta....

Protocol

1. Celcultuur en transfectie

1. Maak HEK celmedia met DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) aangevuld met 4,5 g/L glucose, L-glutamine & natriumpyruvaat en 10% FBS. Steriel filter.
2. Bepaal vooraf geschikte liganden en receptoren voor aggregatietest.
   OPMERKING: Neurexin3α SS4+/- en een van de bekende liganden, LRRTM2, werden gebruikt in deze studie. Liganden en receptoren van belang werden uitgedrukt uit cDNA's in pcDNA3.1. Een Gibson-assemblage werd gebruikt om Neurexin3α in pcDNA3.1¹²te plaatsen. Neurexin3α F/R: TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGAGCTTTACCCTCCACTC/
   GAGCGGCCGCCACTGTGCTGGATATCTGCAGAATT....

Results

De A687T-mutatie verhoogt de Neurexin3α SS4-binding aan LRRTM2⁷
Om te onderzoeken hoe intercellulaire interacties van twee bekende synaptische eiwitten worden beïnvloed door de introductie van een puntmutatie gevonden bij een patiënt met een verstandelijke beperking en epilepsie, gebruikten we de bovenstaande HEK-celaggregatietest (figuur 1). Cellen werden getransfecteerd volgens sectie 1 en voorbereid op beeldvorming volgens secties 1 en 2 van het protocol. Ce.......

Discussion

Het ontleden van de eiwit-eiwitinteracties die optreden in trans tijdens celhechting kan leiden tot een beter begrip van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan basis cellulaire processen, waaronder de vorming, functie en onderhoud van synapsen tijdens rijping en remodellering. De implicaties van cel-celinteracties breiden zich verder uit dan neurobiologie en hebben een bredere rol in signaaltransductie, celmigratie en weefselontwikkeling¹⁴. Aberraties in celhechting kunnen cellula.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL disposable microtubes with snap caps	VWR	89000-028	Incubation of mixed population of HEK cells
1000 mL Rapid—Flow Filter Unit, 0.2 um aPES membrane	Thermo Fisher	567-0020	Sterilization of HEK media
15 mL SpectraTube centrifuge tubes	Ward’s Science	470224-998	Harvesting HEK cells
6 well sterile tissue culture plates	VWR	100062-892	culturing HEK cells
Calcium Chloride	Sigma	223506-500G	Calcium phosphate transfection, HEK cell resuspension
Centrifuge- Sorvall Legend RT	Kendro Laboratory Products	75004377	Harvesting HEK cells
CO2 cell incubator	Thermo Scientific	HERACELL 150i	Incubation of HEK cells during growth
DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate	Corning	10-013-CV	HEK cell maintenance
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline PBS (1X)	Gibco	14190-144	Passaging/harvesting HEK cell
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma	ED-500G	Harvesting HEK cells
Falcon Vented culture flasks, 75cm2 growth area	Corning	9381M26	Culturing HEK cells
Fetal Bovine Serum	Sigma	17L184	HEK cell maintenance
HEK293T cells	ATCC		Model system
ImageJ	NIH	V: 2.0.0-rc-69/1.52p	Image analysis
Magnesium Chloride hexahydrate	Sigma	M9272-500G	HEK cell resuspension
Sodium phosphate dibasic anhydrous	Fisher BioReagents	BP332-500	Calcium phosphate transfection
Trypsin 0.25% (1X) Solution	GE Healthcare Life Sciences	SH30042.01	Passaging HEK cells
Tube rotator			Incubation of mixed population of HEK cells
UltraClear Microscope slides. White Frosted, Positive Charged	Denville Scientific Inc.	M1021	Image acquisition
Wide-field microscope	Zeiss	Axio Vert 200M	Image acquisition