Lusgemedieerde isothermale versterking voor het screenen van salmonella in dierlijk voedsel en het bevestigen van Salmonella uit cultuurisolatie

Samenvatting

Loopgemedieerde isothermale versterking (LAMP) is een isothermische nucleïnezuurversterkingstest (iNAAT) die brede belangstelling heeft getrokken voor het detectieveld van ziekteverwekkers. Hier presenteren we een multilaboratorium gevalideerd Salmonella LAMP-protocol als een snelle, betrouwbare en robuuste methode voor het screenen van Salmonella in dierlijk voedsel en het bevestigen van vermoedelijke Salmonella uit cultuurisolatie.

Samenvatting

Lusgemedieerde isothermale versterking (LAMP) is naar voren gekomen als een krachtige nucleïnezuurversterkingstest voor de snelle detectie van tal van bacteriële, schimmel-, parasitaire en virale middelen. Salmonella is een bacteriële ziekteverwekker van wereldwijd voedselveiligheidsprobleem, inclusief voedsel voor dieren. Hier wordt een multilaboratorium gevalideerd Salmonella LAMP-protocol gepresenteerd dat kan worden gebruikt om diervoeding snel te screenen op de aanwezigheid van Salmonella-besmetting en kan ook worden gebruikt om vermoedelijke Salmonella-isolaten te bevestigen die uit alle voedselcategorieën zijn teruggewonnen. De LAMP-test richt zich specifiek op het Salmonella-invasiegen (invA) en is snel, gevoelig en zeer specifiek. Template DNAs worden bereid uit verrijkingsbouillons van dierlijk voedsel of pure culturen van vermoedelijke Salmonella-isolaten. Het LAMP-reagensmengsel wordt bereid door een isothermische hoofdmix, primers, DNA-sjabloon en water te combineren. De LAMP-test wordt gedurende 30 minuten uitgevoerd bij een constante temperatuur van 65 °C. Positieve resultaten worden gecontroleerd via real-time fluorescentie en kunnen al vanaf 5 minuten worden gedetecteerd. De LAMP-test vertoont een hoge tolerantie voor remmers in dierlijk voedsel of kweekmedium en dient als een snelle, betrouwbare, robuuste, kosteneffectieve en gebruiksvriendelijke methode voor het screenen en bevestigen van Salmonella. De LAMP-methode is onlangs opgenomen in het Bacteriological Analytical Manual (BAM) Chapter 5 van de Amerikaanse Food and Drug Administration.

Inleiding

Loopgemedieerde isothermale versterking (LAMP) is een nieuwe isothermische nucleïnezuurversterkingstest (iNAAT) uitgevonden in 2000 door een groep Japanse wetenschappers¹. Door de vorming van een doelspecifieke stamlus-DNA-structuur tijdens de eerste stappen, gebruikt LAMP een strengverdringende DNA-polymerase om dit uitgangsmateriaal quasi-exponentieel efficiënt te versterken, wat resulteert in 10⁹ kopieën van het doel in minder dan 1 h¹. In vergelijking met polymerasekettingreactie (PCR), een veelgebruikte NAAT, heeft LAMP verschillende voordelen. Ten eerste worden LAMP-reacties uitgevoerd onder isothermale omstandigheden. Dit verdoezelen de noodzaak van een geavanceerd thermisch fietsinstrument. Ten tweede is LAMP zeer tolerant ten opzichte van kweekmedia en biologische stoffen² met robuustheid die is aangetoond voor zowel klinische als voedseltoepassingen^3,4. Dit vereenvoudigt de monstervoorbereiding en minimaliseert valse negatieve resultaten⁵. Ten derde is LAMP vatbaar voor meerdere detectieplatforms, zoals troebelheid, colorimetrie, bioluminescentie, fluorescentie en microfluïdica^6. Ten vierde is LAMP zeer specifiek omdat het vier tot zes speciaal ontworpen primers gebruikt om zich te richten op zes tot acht specifieke regio 's^1,7. Ten vijfde, LAMP is ultragevoelig en talrijke studies hebben gemeld zijn superieure gevoeligheid voor PCR of real-time PCR⁸. Ten slotte is LAMP sneller met veel tests die nu een standaardlooptijd van 30 minuten aannemen, terwijl PCR-achtige tests meestal 1−2 uur⁸nemen.

Deze aantrekkelijke kenmerken voedden de toepassing van LAMP in brede pathogene detectiegebieden, met inbegrip van in vitro ^{diagnostiek 9}, dierziektediagnostiek¹⁰, en voedsel - en milieutests¹¹. Met name een TB-LAMP (LAMP voor Mycobacterium tuberculosis) is door de WHO aanbevolen als een geldige vervangingstest voor sputum-smear microscopie voor longtuberculosediagnoses in perifere omgevingen¹². Lamp-toepassing breidt zich ook verder uit dan microbiële identificatie met de detectie van allergenen, diersoorten, medicijnresistentie, genetisch gemodificeerde organismen en pesticiden¹³.

Niet-tyfus salmonella is een zoönotische ziekteverwekker van aanzienlijke voedselveiligheid en volksgezondheidszorg wereldwijd¹⁴. Het is ook geïdentificeerd als een belangrijk microbieel gevaar in levensmiddelen voor dieren (d.w.z. dierlijk voedsel)^15,16. Om salmonellaziekten/uitbraken door besmet menselijk voedsel en dierlijk voedsel te voorkomen, is het absoluut noodzakelijk om snelle, betrouwbare en robuuste methoden te hebben om Salmonella in verschillende matrices te testen. In het afgelopen decennium zijn internationaal aanzienlijke inspanningen geleverd voor de ontwikkeling en toepassing van Salmonella LAMP-tests in een breed scala aan voedselmatrices, zoals onlangs samengevat in een uitgebreide review⁸. Verschillende Salmonella LAMP-tests, waaronder de hier gepresenteerde, hebben met succes multilaboratoriumvalidatie voltooid volgens de gevestigde internationale richtlijnen^17,18,19,20.

Onze Salmonella LAMP-test richt zich specifiek op het Salmonella-invasiegen invA (GenBank-toetredingsnummer M90846)²¹ en is snel, betrouwbaar en robuust in meerdere voedselmatrices^{4,22,23,24,25,26}. De methode is gevalideerd in zes dierlijke voedselmatrices in een precollaboratieve studie²⁶ en in droog hondenvoer in een samenwerkingsstudie met meerdere^{laboratoria 19}. Als gevolg hiervan is de hier gepresenteerde Salmonella LAMP-methode onlangs opgenomen in het Bacteriological Analytical Manual (BAM) Chapter 5 Salmonella²⁷ van de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) om twee doelen te dienen, een als een snelle screeningmethode voor de aanwezigheid van Salmonella in dierlijk voedsel en twee als een betrouwbare bevestigingsmethode voor vermoedelijke Salmonella geïsoleerd van alle voedingsmiddelen.

Protocol

OPMERKING: Een LAMP-reactiemix bevat DNA-polymerase, buffer, MgSO_4,dNTPs, primers, DNA-sjabloon en water. De eerste vier reagentia zijn opgenomen in een isothermische hoofdmix(Materialentabel). Primers worden in eigen huis voorgemengd om een primermix (10x) te worden. DNA-sjablonen kunnen worden bereid uit verrijkingsbouillons van dierlijke voedselmonsters voor screeningsdoeleinden of uit culturen van vermoedelijke Salmonella-isolaten voor bevestigingsdoeleinden. Bovendien zijn bij elke LAMP-run een positieve controle (DNA geëxtraheerd uit salmonellareferentiestammen, bijvoorbeeld Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC 19585 [LT2]) en een no template control (NTC; steriel moleculair water) opgenomen.

1. Voorbereiding van DNA-sjablonen

1. Volg deze stappen om DNA-sjablonen van voedselverrijkingen voor dieren te bereiden.
   1. Weeg 25 g dierlijk voedselmonster (bijv. droog kattenvoer, droog hondenvoer, veevoer, paardenvoer, pluimveevoer en varkensvoer) in een steriele filterzak(Materialentabel),of gelijkwaardig. Plaats de zak in een grote container of rek voor ondersteuning tijdens de incubatie.
   2. Voeg 225 ml steriel gebufferd peptonwater (BPW) toe. Meng goed door wervelende en korte handmassage. Laat 60 ± 5 minuten op kamertemperatuur staan.
   3. Meng goed door te wervelen en bepaal de pH met een testpapier. Stel de pH zo nodig in op 6,8 ± 0,2 met steriele 1 N NaOH of 1 N HCl. Incubeer bij 35 ± 2 °C gedurende 24 ± 2 uur.
   4. Meng goed door de zak met dierlijke voedselverrijkingsbouillons te wervelen. Breng 1 ml van de gefilterde kant van de zak over in een microcentrifugebuis. Vortex kort.
   5. Haal DNA uit met behulp van een monsterpreparaatreagens (Materialentabel) als volgt.
      1. Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 900 x g om grote deeltjes te verwijderen en supernatant over te brengen naar een nieuwe microcentrifugebuis.
      2. Centrifugeer gedurende 2 minuten op 16.000 x g en gooi supernatant weg.
      3. Hang de pellet in 100 μL van het monsterbereidingsreagens en verwarm op 100 ± 1 °C gedurende 10 minuten in een droog hitteblok.
      4. Koel af tot kamertemperatuur en bewaar dna-monsters bij -20 °C.
2. Volg deze stappen om DNA-sjablonen van vermoedelijke Salmonella-culturen voor te bereiden.
   1. Verkrijg vermoedelijke Salmonella-isolaten uit kweekisolatie in alle voedingsmiddelen na BAM Chapter 5 Salmonella section D: Isolation of Salmonella²⁷van de FDA .
   2. Inenten vermoedelijke Salmonella-isolaten op een niet-selectieve agarplaat (bijv. bloedagar, voedingsagar en trypticase soja-agar) en incuberen bij 35 ± 2 °C gedurende 24 ± 2 uur.
   3. Breng meerdere enkele kolonies over op 5 ml trypticase sojabouillon (TSB) of hersenhartinfusie (BHI) bouillon en incubeer bij 35 ± 2 °C gedurende 16 ± 2 uur.
      OPMERKING: Deze stap kan optioneel zijn als de vermoedelijke Salmonella-cultuur zuiver is. In dat geval kunnen DNA-sjablonen worden voorbereid door meerdere enkele kolonies in 5 ml TSB op te schorten en 500 μL van de suspensie gedurende 10 minuten op 100 ± 1 °C te verwarmen in een droog warmteblok. Ga verder met stap 5 hieronder.
   4. Breng 500 μL van de nachtcultuur over in een microcentrifugebuis en verwarm op 100 ± 1 °C gedurende 10 minuten in een droog hitteblok.
   5. Koel af tot kamertemperatuur en bewaar isolaat-DNA-extracten bij -20 °C.
3. Om positief controle-DNA voor te bereiden, volgt u vergelijkbare stappen als hierboven voor het voorbereiden van DNA-sjablonen uit vermoedelijke Salmonella-culturen met één extra verdunningsstap.
   1. Inenten S. Typhimurium ATCC 19585 (LT2) of salmonella referentiestammen op een niet-selectieve agarplaat (bijv. bloedagar, voedingsagar en trypticase soja-agar) en incuberen bij 35 ± 2 °C gedurende 24 ± 2 uur.
   2. Breng meerdere enkele kolonies over op 5 ml TSB- of BHI-bouillon en incubeer bij 35 ± 2 °C gedurende 16 ± 2 uur om ~ 10⁹ CFU / ml te bereiken.
   3. Verdun de nachtcultuur in 0,1% peptonwater om ~ 10⁷ CFU / ml te verkrijgen.
   4. Breng 500 μL van deze verdunning over in een microcentrifugebuis en verwarm op 100 ± 1 °C gedurende 10 minuten in een droog warmteblok.
   5. Koel af tot kamertemperatuur en bewaar positief controle-DNA bij -20 °C.

2. Bereiding van primermix (10x)

1. Verkrijg commercieel gesynthetiseerde LAMP primers (Sal4-F3, Sal4-B3, Sal4-FIP, Sal4-BIP, Sal4-LF en Sal4-LB) met standaard ontzoutingszuivering(tabel 1).

Primernaam	Beschrijving	Opeenvolging (5'-3')	Lengte (bp)
Sal4-F3	Voorwaartse buitenprimer	GAACGTGTCGCGGAAGTC	18
Sal4-B3	Achterwaartse buitenprimer	CGGCAATAGCGTCACCTT	18
Sal4-FIP	Voorwaartse binnenprimer	GCGCGGCATCCGCATCAATA-TCTGGATGGTATGCCCGG	38
Sal4-BIP	Achterwaartse binnenprimer	GCGAACGGCGAAGCGTACTG-TCGCACCGTCAAAGGAAC	38
Sal4-LF	Loop voorwaarts primer	TCAAATCGGCATCAATACTCA-TCTG	25
Sal4-LB	Lus achterwaartse primer	AAAGGGAAAGCCAGCTTTACG	21

Tabel 1: LAMP-primers voor het screenen van Salmonella in diervoeding en het bevestigen van Salmonella uit cultuurisolatie. De primers zijn ontworpen op basis van de Salmonella invA-reeks (GenBank-toetredingsnummer M90846).

2. Bereid voorraadoplossingen van elke primer (100 μM) door de primer te rehydrateren met de juiste hoeveelheid steriel moleculair water. Meng goed door vortexing voor 10 s en bewaar bij -20 °C (-80 °C voor langdurige opslag).
3. Bereid de primermix (10x) volgens een werkblad (tabel 2). Voeg de juiste volumes primervoorraadoplossingen en steriel water van moleculaire kwaliteit toe aan een microcentrifugebuis. Meng alle reagentia goed door vortexing gedurende 10 s.

Component	Voorraad conc. (μM)	Primermix conc. (μM)	Volume (μL)
Sal4-F3 primer	100	1	10
Sal4-B3 primer	100	1	10
Sal4-FIP primer	100	18	180
Sal4-BIP primer	100	18	180
Sal4-LF primer	100	10	100
Sal4-LB primer	100	10	100
Moleculair water	N/a	N/a	420
Totale	N/a	N/a	1000

Tabel 2: Werkblad voor het bereiden van de LAMP primer mix (10x). De primers staan vermeld in tabel 1.

4. Aliquot de 10x primer mix tot 500 μL per microcentrifuge tube en bewaren bij -20 °C.

3. Montage van een LAMP-reactie

OPMERKING: Om kruisbesmetting te voorkomen, wordt het ten zeerste aanbevolen om de gebieden die worden gebruikt voor het bereiden van de LAMP-mastermix fysiek te scheiden en DNA-sjablonen toe te voegen. Figuur 1 is een LAMP-diagram.

Figuur 1: Een schematisch schema van de Salmonella LAMP workflow. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Voorbereiding en uitvoering
   1. Schone bank met isopropanol en een DNA- en DNase-afbrekende oplossing(Materialentabel). Reinig pipetten en buisstriphoudersmetde DNA- en DNase-vernederende oplossing.
   2. Ontdooi de isothermische hoofdmix, primermix (10x), moleculair water, positief controle-DNA en DNA-sjablonen bij kamertemperatuur.
   3. Schakel het LAMP-instrument(Materialentabel) inen tik op het openingsscherm om toegang te krijgen tot het startscherm. Volg deze stappen om een uitvoering te maken.
      OPMERKING: Een model van het LAMP-instrument heeft 2 blokken (A en B) met 8 monsters in elk blok en een ander model heeft een enkel blok dat plaats biedt aan 8 monsters(Materialentabel).
      1. Tik op LAMP+Anneal en selecteer Bewerken om voorbeeldinformatie in te voeren.
         OPMERKING: Het standaard LAMP-uitvoeringsprofiel bestaat uit versterking bij 65 °C gedurende 30 minuten en een gloeifase van 98 °C tot 80 °C met 0,05 °C aftakking per seconde.
      2. Tik op elke voorbeeldrij om de cursor te activeren en relevante voorbeeldinformatie in te voeren, met behulp van het AB-blokpictogram om te schakelen tussen de twee LAMP-instrumentblokken.
      3. Tik op het pictogram Controleren wanneer alle voorbeeldgegevens zijn ingevoerd.
         OPMERKING: Optioneel kan de uitvoeringsinstelling (ook wel 'Profiel' genoemd, die voorbeeldinformatie bevat samen met het standaard LAMP-uitvoeringsprofiel) worden opgeslagen voor later gebruik. Tik op het pictogram Opslaan en geef het profiel een unieke naam. Wanneer u de volgende keer dezelfde set voorbeelden test, kan een nieuwe uitvoering worden gestart met behulp van het opgeslagen profiel. Tik op het pictogram Map linksonder in het startscherm en selecteer Profiel om opgeslagen profielen te laden.
2. LAMP-reactieassemblage
   OPMERKING: Wanneer u beide LAMP-instrumentblokken (A en B, in totaal 16 monsters) gebruikt, bereidt u de LAMP-hoofdmix voor op 18 monsters. Als u slechts één LAMP-instrumentenblok (in totaal 8 monsters) gebruikt, bereidt u de LAMP-hoofdmix voor op 10 monsters. Voor andere monsternummers past u het volume dienovereenkomstig aan om pipetverlies op te vangen. Neem altijd een positieve controle en een NTC op in elke LAMP-run. Duplicaattests van elk monster in onafhankelijke LAMP-uitvoeringen worden aanbevolen.
   1. Bereid de LAMP-hoofdmix volgens een werkblad(tabel 3). Voeg de juiste volumes van de isothermische mastermix, primermix en moleculair water toe aan een microcentrifugebuis en vortex zachtjes gedurende 3 s. Centrifuge kort.
   2. Plaats de buisstrip in de striphouder en verdeel 23 μL van de LAMP-hoofdmix over elke put.
   3. Vortex alle DNA sjablonen en centrifugeren kort. Voeg 2 μL DNA-sjabloon toe aan de juiste put en sluit goed aan.
   4. Verwijder de buisstrip van de houder en tik op de pols om er zeker van te zijn dat alle reagentia zich aan de onderkant van de buis hebben samengevoegd.
   5. Plaats de buisstrip in het LAMP-instrumentenblok(en), zodat de doppen goed vastzitten voordat u het deksel sluit.

Component	Werken conc.	Laatste reactie conc.	Volume per monster (μL)	Volume voor 18 monsters (μL)	Volume voor 10 monsters (μL)
ISO-001 isothermische mastermix	1.67x	1x	15	270	150
Primer mix	10x	1x	2.5	45	25
Moleculair water	N/a	N/a	5.5	99	55
Mastermix subtotaal	N/a	N/a	23	414	230
DNA-sjabloon	N/a	N/a	2	N/a	N/a

Tabel 3: Werkblad voor het bereiden van de LAMP-reactiemix. De primermix (10x) wordt bereid volgens tabel 2 met behulp van voorraadoplossingen van primers die in tabel 1zijn vermeld .

4. LAMP-uitvoering

OPMERKING: Tijdens een LAMP-run worden fluorescentiemetingen verkregen via het FAM-kanaal. De tijd-piekwaarden (T_max; min) worden automatisch bepaald door het instrument voor het tijdspunt wanneer de fluorescentieverhouding de maximale waarde van de versterkingssnelheidscurve bereikt. De T_m (°C) is de smelt-/gloeitemperatuur van het uiteindelijke versterkte product.

1. Klik op het pictogram Uitvoeren rechtsboven in het scherm en selecteer de blokken met buisstrip(s) om de LAMP-uitvoering te starten.
2. Optioneel, terwijl de reactie wordt uitgevoerd, tikt u op de tabbladen Temperatuur, Versterkingen Gloeien om dynamische wijzigingen van verschillende parameters te zien tijdens de LAMP-uitvoering.
3. Zodra de uitvoering is voltooid, tikt u op de tabbladen Versterking en Gloeien om volledige versterkings- en gloeicurven te zien en tikt u op het tabblad Resultaten om de resultaten weer te geven.
4. Optioneel, voor het bijhouden van records, registreert u het uitvoeringsnummer linksboven in het scherm, met behulp van de indeling van "instrument serial number_run number", bijvoorbeeld "GEN2-2209_0030.".

5. Interpretatie van LAMP-resultaten

OPMERKING: LAMP-resultaten kunnen rechtstreeks en/of met behulp van een LAMP-software(Materialentabel)op het LAMP-instrumentenpaneel worden bekeken.

1. Volg deze stappen om lampresultaten op het instrumentenpaneel te interpreteren.
   1. Tik op het pictogram Map linksonder in het startscherm en selecteer Logboek om naar de bestandslocatie te navigeren om de LAMP-run van belang te laden.
      OPMERKING: De LAMP-runs zijn georganiseerd op datum, te beginnen met het jaar.
   2. Observeer de vijf tabbladen die aan elke uitvoering zijn gekoppeld: Profiel, Temperatuur, Versterking, Gloeienen Resultaten.
      OPMERKING: De tabbladen Profiel en Temperatuur tonen respectievelijk geprogrammeerde en werkelijke temperaturen in de monsterputten terwijl de LAMP-reactie plaatsvindt. De tabbladen Amplificatie en Gloeien tonen fluorescentiemetingen en veranderingen in fluorescentie tijdens respectievelijk de amplificatie- en gloeifasen. Op het tabblad Resultaten ziet u een tabelweergave van de LAMP-resultaten.
   3. Tik op het tabblad Resultaten om lampresultaten voor elke put te bekijken.
      OPMERKING: Er zijn drie kolommen (Well, Amplification en Anneal). De kolom "Versterking" toont de tijd-tot-piekwaarden (T_max; min:sec) voor elk monster ("Goed") en de kolom "Gloeien" toont de smelt-/gloeitemperaturen (T_m; °C) voor elk versterkt product in die put.
   4. Interpreteer de LAMP-resultaten en rapporteer de definitieve LAMP-resultaten als volgt.
      1. Onderzoek eerst de controleputten. De NTC-put moet blanco T_max hebben, terwijl T_m ofwel leeg kan zijn (beide LAMP-instrumentmodellen) of < 83 °C (alleen voor het LAMP-instrumentmodel met twee blokken). De positieve controleput moet T_max tussen 5 en 10 min en T_m rond 90 °C hebben.
      2. Onderzoek de monsterputten. Alle monsters met de juiste T_m (ongeveer 90 °C) en T_max (tussen 5−30 min) worden als positief beschouwd voor Salmonella.
      3. Rapporteer definitieve LAMP-resultaten op basis van resultaten van dubbele uitvoeringen. Als de dubbele uitvoeringen consistente resultaten hebben, kunnen de uiteindelijke LAMP-resultaten worden gerapporteerd. Als dubbele uitvoeringen inconsistent zijn, herhaalt u beide uitvoeringen onafhankelijk. Als de resultaten nog steeds inconsistent zijn, moet het monster als vermoedelijk positief voor Salmonella worden beschouwd en moet het een kweekbevestiging ondergaan.
2. Volg deze stappen om LAMP-resultaten te interpreteren met behulp van de software.
   1. Klik op het computerpictogram in het linkerpaneel en navigeer naar de bestandslocatie om de LAMP-run van belang te laden.
      OPMERKING: De computer waarop de software is geïnstalleerd, hoeft niet op het LAMP-instrument te worden aangesloten om lampresultaten te analyseren, d.w.z. externe toegang is beschikbaar. De LAMP-runs zijn georganiseerd op datum.
   2. Let op de zeven tabbladen die aan elke run zijn gekoppeld: Profiel, Temperatuur, Amplificatie, Amplificatiesnelheid, Gloei -, Gloeiderivaaten Resultaat.
      OPMERKING: Net als bij de weergave van het instrumentenpaneel tonen de tabbladen Profiel en Temperatuur respectievelijk geprogrammeerde en werkelijke temperaturen in de monsterputten naarmate de LAMP-reactie vordert. De tabbladen Amplification/Amplification Rate en Anneal/Anneal Derivative tonen fluorescentiemetingen of veranderingen in fluorescentie tijdens respectievelijk de amplificatie- en gloeifasen. Het tabblad Resultaten toont een tabelweergave van de LAMP-resultaten die enigszins afwijken van de weergave van het instrumentenpaneel.
   3. Tik op het tabblad Versterkingssnelheid om een grafische weergave van de fluorescentieverhoudingen op tijd weer te geven. Klik op het pictogram Instelling rechtsboven in het scherm en pas de "Peak Detection Threshold Ratio" aan van 0,020 tot 0,010.
      OPMERKING: De aanpassing is nodig om ervoor te zorgen dat alle geldige pieken worden geïdentificeerd en de resultaten die met behulp van de software worden verkregen, overeenkomen met de resultaten die op het instrumentenpaneel worden weergegeven.
   4. Tik op het tabblad Resultaat om de LAMP-resultaten voor elke put te bekijken.
      OPMERKING: Er zijn vier kolommen (grafieknaam, bronnummer, bronnaam en piekwaarde). Het bovenste gedeelte van de kolom "Piekwaarde" toont "Amp Time" (T_max; min:sec) voor elk monster ("Well Name") terwijl het onderste gedeelte "Anneal Derivative" (T_m; °C) toont voor elk versterkt product in die put.
   5. Interpreteer de LAMP-resultaten en rapporteer de definitieve LAMP-resultaten volgens vergelijkbare stappen als bij het gebruik van het instrumentenpaneel, met één uitzondering dat de NTC-put en andere negatieve monsters lege T_m moeten hebben, omdat de LAMP-software-instellingen die T_m < 83 °C-resultaten elimineren. Evenzo worden alle monsters met de juiste T_m (ongeveer 90 °C) en T_max (tussen 5−30 min) als positief beschouwd voor Salmonella.

Resultaten

Figuur 2 en figuur 3 tonen representatieve LAMP-grafieken/-tabellen die op beide platforms worden weergegeven. In deze LAMP-run zijn de monsters S1 tot en met S6 10-voudige seriële verdunningen van S. enterica serovar Infantis ATCC 51741, variërend van 1,1 x 10⁶ CFU tot 11 CFU per reactie. Positieve controle is S. enterica serovar Typhimurium ATCC 19585 (LT2) bij 1,7 x 10⁴ KVE per reactie en NTC is water van moleculaire kwaliteit.

Zoals weergegeven in figuur 2E en figuur 3G,zijn zowel NTC- als pc-putten geldige bedieningselementen. De NTC-put heeft blanco T_max terwijl T_m < 83 °C op het LAMP-instrumentenpaneel staat en leeg in de LAMP-software, wat een negatief resultaat suggereert. De pc goed heeft T_max van 7 min 45 sec en T_m van ~ 90 °C op beide platforms, wat een positief resultaat suggereert. De monsters S1 tot en met S6 hebben een maximum van 6 min 30 sec en 12 min 15 sec, allemaal salmonella-positief.

Na dubbele uitvoeringen van dezelfde reeks monsters worden de definitieve LAMP-resultaten voor deze monsters gerapporteerd. Deze representatieve LAMP-run toont aan dat LAMP salmonella met succes detecteert met een breed scala aan concentraties in de monsters.

Figuur 2: Representatieve LAMP-resultaten weergegeven op het LAMP-instrumentenpaneel. (A) Het tabblad Profiel toont het geprogrammeerde temperatuurprofiel. (B) Het tabblad Temperatuur toont de werkelijke temperaturen in de monsterputten naarmate de LAMP-reactie vordert. (C) Het tabblad Versterking toont fluorescentiemetingen tijdens lampversterking. (D) Het tabblad Gloeien toont veranderingen in fluorescentie (derivaat) tijdens de gloeifase. (E) Het tabblad Resultaten toont een tabelweergave van de LAMP-resultaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Representatieve LAMP-resultaten bekeken in de LAMP-software. (A) Het tabblad Profiel toont het geprogrammeerde temperatuurprofiel. (B) Het tabblad Temperatuur toont de werkelijke temperaturen in de monsterputten naarmate de LAMP-reactie vordert. (C) Het tabblad Versterking toont fluorescentiemetingen tijdens lampversterking. (D) Het tabblad Versterkingssnelheid toont veranderingen in fluorescentie (fluorescentieverhouding) tijdens lampversterking. (E) Het tabblad Gloeien toont fluorescentiemetingen tijdens de gloeifase. (F) Het tabblad Gloeiderivaat toont veranderingen in fluorescentie (derivaat) tijdens de gloeifase. (G) Het tabblad Resultaat toont een tabelweergave van de LAMP-resultaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

We hebben hier een eenvoudige, snelle, specifieke en gevoelige LAMP-methode gepresenteerd voor het screenen en bevestigen van Salmonella in respectievelijk dierlijk voedsel en pure cultuur. Met het gemak van een isothermische hoofdmix die vier belangrijke reagentia bevat, en een kant-en-klare, in-house bereide primermix, vereist het monteren van een LAMP-reactie slechts een paar pipettingstappen (figuur 1). De totale looptijd inclusief versterkings- en gloeifasen is minder dan 38 min (figuur 2A,B en figuur 3A,B). Positieve resultaten worden gecontroleerd via real-time fluorescentie(figuur 2C en figuur 3C,D) en kunnen al worden gedetecteerd vanaf 5 min²⁶. De gloeifase dient als een extra bevestiging van de specificiteit van de LAMP, aangezien alleen monsters met de juiste T_m (ongeveer 90 °C) als positief worden gerapporteerd (figuur 2D,E en figuur 3E−G). Gevoeligheden van 1 Salmonellacel in zuivere cultuur en < 1 KVE/25 g in dierlijk voedsel zijn eerder gemeld²⁶.

Omdat LAMP vrij effectief is en een grote hoeveelheid DNA¹genereert, is het van cruciaal belang dat de beste laboratoriumpraktijken worden gebruikt om kruisbesmetting te voorkomen, waaronder het fysiek scheiden van de gebieden voor het bereiden van de LAMP-hoofdmix en het toevoegen van DNA-sjablonen, het vermijden van het genereren van aerosolen, het gebruik van filterpipetpunten, het vaak wisselen van handschoenen en het onthouden van het openen van LAMP-reactiebuizen na versterking.

De specificiteit van deze Salmonella LAMP-methode werd eerder getest met behulp van 300 bacteriestammen (247 Salmonella van 185 serovars en 53niet-Salmonella) en bleek 100% specifiek te zijn²⁶. Met name werden significante verschillen in T_max waargenomen tussen de twee Salmonella-soorten, S. enterica en Salmonella bongori, en tussen S. enterica-ondersoorten, met name subsp. arizonae (IIIa)²⁶. Niettemin waren dit nog steeds geldige positieve resultaten volgens de regels voor de interpretatie van LAMP-resultaten. In onze multilaboratorium samenwerkingsstudie in droog hondenvoer waarbij 14 analisten¹⁹betrokken waren, werden af en toe monsters waargenomen met inconsistente resultaten in dubbele LAMP-runs. Het ging meestal om monsters met vertraagde positieve resultaten(T_max > 15 min). Als u beide uitvoeringen onafhankelijk herhaalt, is het probleem meestal opgelost. Meer zelden observeerden we monsters met de juiste T_m maar geen of onregelmatige T_max waarden (< 5 min). Dit werd meestal veroorzaakt door luchtbellen in de reactiebuis.

Gedurende de levenscyclus van lamp methode ontwikkeling, evaluatie, precollaboratieve studie, en multi-laboratorium validatie, hebben we waargenomen hoge tolerantie van LAMP voor remmers in verschillende dierlijke voedsel of voedsel matrices en cultuur media^{4,19,22,23,24,}het benadrukken van de robuustheid van de methode en het samenwerken van tal van andere studies op een wereldwijde schaal⁸. Dit is superieur in vergelijking met PCR of real-time PCR, die meestal een interne versterkingscontrole vereist om ervoor te zorgen dat negatieve resultaten niet te wijten zijn aan matrixremming²⁸. Voorts vertoonde LAMP in de overgrote meerderheid van de studies een vergelijkbare (of superieure) specificiteit en gevoeligheid in vergelijking met PCR of real-time PCR⁸. De kosten van LAMP-reagentia bedragen ongeveer $ 1 per reactie. De LAMP-instrumenten die in dit protocol worden gebruikt, zijn klein, onderhoudsarm en draagbaar. Ze kunnen omgaan met elke isothermale versterkingsmethode die doeldetectie gebruikt door fluorescentiemeting, inclusief LAMP. Met behulp van de LAMP-software kunnen uitgebreide rapporten in meerdere formaten worden gegenereerd (pdf, tekst en afbeelding).

Methodevalidatie is een kritieke stap voordat een nieuwe methode kan worden gebruikt voor routinematig gebruik. Het is opmerkelijk dat het hier gerapporteerde LAMP-protocol de validatie met meerdere laboratoria met succes heeft voltooid¹⁹. Met de recente opname van dit LAMP-protocol in bam hoofdstuk 5 Salmonella²⁷van de Amerikaanse FDA , wordt verwacht dat de methode veel breder zal worden gebruikt, zowel als een snelle screeningmethode in diervoeding als als een betrouwbare bevestigingsmethode voor vermoedelijke Salmonella-isolaten uit alle voedselcategorieën.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Brain heart infusion (BHI) broth	BD Diagnostic Systems, Sparks, MD	299070	Vloeibaar groeimedium gebruikt bij de cultivatie van Salmonella.
Buffered peptone water (BPW)	BD Diagnostic Systems, Sparks, MD	218105	Pre-verrijkingsmedium voor het herstel van Salmonella uit voedselmonsters van dieren.
DNA AWAY	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	7010	Verwijdert ongewenst DNA en DNase van laboratoriumbanken, glaswerk en plasticwerk zonder de volgende DNA-monsters te beïnvloeden.
Genie Explorer software	OptiGene Ltd., West Sussex, Verenigd Koninkrijk	Versie 2.0.6.3	Ondersteunt externe bediening van Genie-instrumenten, inclusief LAMP-runs en gegevensanalyse.
Genie II of Genie III (LAMP-instrument)	OptiGene Ltd., West Sussex, Verenigd Koninkrijk	GEN2-02 of GEN3-02	Een klein instrument dat in staat is om temperatuur te regelen tot 100 °C met ± 0,1 °C nauwkeurigheid en gelijktijdige fluorescentiedetectie via het FAM-kanaal. Genie II heeft 2 blokken (A en B) met 8 monsters in elk blok. Genie III heeft een enkel blok dat 8 monsters kan huisvesten.
Genie strip	OptiGene Ltd., West Sussex, Verenigd Koninkrijk	OP-0008	Microbuisjes met 8 putjes met geïntegreerde vergrendelingskappen en een werkvolume van 10 tot 150 µl.
Genie strip holder	OptiGene Ltd., West Sussex, Verenigd Koninkrijk	GBLOCK	Wordt gebruikt om Genie-strips vast te houden bij het opzetten van een LAMP-reactie, de aluminium houder kan ook worden gebruikt als koelblok.
Hydrochloorzuur (HCl) oplossing, 1 N	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	SA48-500	Past de pH van monsters van dierenvoeding aan na het toevoegen van BPW en voorafgaand aan overnachtelijke verrijking.
Heat block	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	88-860-022	Verwarmt monsters op 100 ± 1 oC voor DNA-extractie.
Incubator	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	3960	Standaard laboratoriumincubator.
ISO-001 isotherme mastermix	OptiGene Ltd., West Sussex, Verenigd Koninkrijk	ISO-001	Een geoptimaliseerde mastermix om de assemblage van een LAMP-reactie te vereenvoudigen, met een streng-verdringende GspSSD DNA-polymerase groot fragment van Geobacillus spp., thermostabiele anorganische pyrofosfatase, reactiebuffer, MgSO4, dNTPs en een dubbelstrengs DNA-bindend kleurstof (FAM-detectiekanaal).
Isopropanol	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	A416	Ontsmet werkoppervlakken.
LAMP primers	Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IA	Aangepast	LAMP primers met gedetailleerde informatie in Tabel 1.
Microcentrifuge	Eppendorf North America, Hauppauge, NY	22620207	MiniSpin plus personal microcentrifuge.
Microcentrifuge tubes	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	05-408-129	Standaard microcentrifugebuisjes.
Moleculaire kwaliteit water	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	AM9938	Gebaat bij het maken van primer stocks, primer mix en LAMP reactiemix.
Natriumhydroxide (NaOH) oplossing, 1 N	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	SS266-1	Past de pH van monsters van dierenvoeding aan na het toevoegen van BPW en voorafgaand aan overnachtelijke verrijking.
Nonselectieve agar (bijv. bloedagar, voedingsagar en trypticase soja agar)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	R01202	Vaste groeimedium gebruikt bij de cultivatie van Salmonella.
Peptonwater	BD Diagnostic Systems, Sparks, MD	218071	Verdunt overnachtelijke Salmonella culturen om positief controle-DNA te maken.
Pipetten en tips	Mettler-Toledo Rainin LLC, Oakland CA	Pipet Lite LTS-serie	Standaard laboratoriumpipetten en tips.
PrepMan Ultra monstervoorbereidingsreagens	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	4318930	Een eenvoudige kit die wordt gebruikt voor de snelle voorbereiding van DNA-sjablonen voor gebruik in een LAMP-reactie.
Salmonella-referentiestam LT2	ATCC, Manassas, VA	700720	Salmonella-referentiestam gebruikt als positieve controle.
Trypticase soja broth (TSB)	BD Diagnostic Systems, Sparks, MD	211768	Vloeibaar groeimedium gebruikt bij de cultivatie van Salmonella.
Vortexmixer	Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY	SI-0236	Standaard laboratorium vortexmixer.
Whirl-pak filterzak	Nasco Sampling Brand, Fort Atkinson, WI	B01318	Filterzakken om monsters van dierenvoedsel vast te houden voor pre-verrijking.