Methodenartikel

Voorbereiding van mesh-vormige ontworpen cardiale weefsels afgeleid van menselijke iPS cellen voor In Vivo Myocardial Repair

DOI:

10.3791/61246

⸱

9 juni 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Clinical Translational Research Program, RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research, 2Department of Cardiovascular Surgery, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 3Laboratory of Stem Cell and Neuro-Vascular Biology, Cell and Developmental Biology Center, National Institutes of Health, 4Kosair Charities Pediatric Heart Research Program, Cardiovascular Innovation Institute, University of Louisville, 5Department of Pediatrics, School of Medicine, University of Louisville, 6Department of Cardiovascular Surgery, Mitsubishi Kyoto Hospital, 7Cincinnati Children's Heart Institute

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het huidige protocol genereert mesh-vormige ontworpen cardiale weefsels met cardiovasculaire cellen afkomstig van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen om het onderzoek van celimplantatietherapie voor hartziekten mogelijk te maken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het huidige protocol beschrijft methoden voor het genereren van schaalbare, mesh-vormige ontworpen cardiale weefsels (ECT's) samengesteld uit cardiovasculaire cellen afkomstig van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's), die zijn ontwikkeld naar het doel van klinisch gebruik. HiPSC-afgeleide cardiomyocyten, endotheelcellen en vasculaire muurschilderingcellen worden gemengd met gelmatrix en vervolgens gegoten in een polydimethylsiloxane (PDMS) weefselmal met rechthoekige interne gespreide palen. Op cultuurdag 14 ECT's vervallen in een 1,5 cm x 1,5 cm mesh structuur met 0,5 mm diameter myofiber bundels. Cardiomyocyten stemmen op de lange as van elke bundel en slaan spontaan synchroon. Deze aanpak kan worden opgeschaald naar een grotere (3,0 cm x 3,0 cm) mesh ECT met behoud van de bouw rijping en functie. Zo kunnen mesh-vormige ECT's gegenereerd uit hiPSC-afgeleide hartcellen haalbaar zijn voor cardiale regeneratieparadigma's.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Talrijke preklinische studies en klinische studies hebben de efficiëntie van op cellen gebaseerde hartregeneratieve therapieën voor falende harten1,2,3bevestigd . Onder verschillende celtypen, menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) zijn veelbelovende celbronnen op grond van hun proliferative vermogen, potentieel om verschillende cardiovasculaire afstammingen4,,5, en allogene te genereren. Bovendien hebben weefseltechnische technologieën het mogelijk gemaakt om miljoenen cellen over te brengen op een beschadigd hart5,6,7,8.

Eerder rapporteerden we de generatie van driedimensionale (3D) lineair ontworpen hartweefsels (ECT's) uit hiPSC-afgeleide cardiovasculaire afstammingen met behulp van een commercieel beschikbaar kweeksysteem voor 3D biokunstweefsels5,7. We ontdekten dat de coëxistentie van vasculaire endotheelcellen en muurschilderingcellen met cardiomyocyten binnen de ECT structurele en elektrofysiologische weefselrijping vergemakkelijkte. Bovendien hebben we het therapeutisch potentieel van geïmplanteerde hiPSC-ECT's gevalideerd in een immuuntolerante rat hartinfarct model om de hartfunctie te verbeteren, myocardium te regenereren en angiogenese5te verbeteren. De lineaire ECT's die met deze methode werden geconstrueerd, waren echter 1 bij 10 mm cilinders en dus niet geschikt voor implantatie in preklinische studies met grotere dieren of klinisch gebruik.

Op basis van het succesvolle gebruik van weefselmallen om poreuze weefselvorming te genereren met behulp van rat skeletmyoblasten en cardiomyocyten9, menselijke ESC-afgeleide cardiomyocyten10 en muis iPSCs11, ontwikkelden we een protocol voor het genereren van schaalbare hiPSC-afgeleide grotere implanteerbare weefsel met behulp van polydimethylsiloxane (PDMS) mallen. We evalueerden een reeks schimmelgeometrieën om de meest effectieve schimmelkenmerken te bepalen. Mesh-vormige ECT's met meerdere bundels en knooppunten vertoonden uitstekende kenmerken in celconsistenties, weefselfunctie en schaalbaarheid in vergelijking met gewone of lineaire formaten die poriën of knooppunten misten. We implanteerden de mesh-vormige ECT in een rat hartinfarct model en bevestigde de therapeutische effecten vergelijkbaar met geïmplanteerde cilindrische ECTs12. Hier beschrijven we het protocol om een hiPSC-afgeleide mesh-vormige ECT te genereren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Onderhoud van hiPSC's en cardiovasculaire differentiatie

  1. Uitbreiden en onderhouden van hiPSC's op dunne-coat kelder membraan matrix (groeifactor verminderd, 1:60 verdunning) in geconditioneerd medium gewonnen uit muis embryonale fibroblasten (MEF-CM) met menselijke basis fibroblast groeifactor (hbFGF)4.
    OPMERKING: We gebruikten een hiPSC's (4-factor (Oct3/4, Sox2, Klf4 en c-Myc) lijn: 201B6). Voeg hbFGF toe bij de juiste concentratie voor elke cellijn. Laminin-511 fragment kan ook worden gebruikt voor de coating van cultuur schotel in plaats van kelder membraan matrix. Commercieel verkrijgbaar medium ontworpen voor feeder-vrije cultuur van hiPSC's kan worden gebruikt als een substituut voor MEF-CM.
  2. Gebruik Versene (0,48 mM ethylenediaminetetraaceticum (EDTA) om cellen los te maken en te scheiden wanneer celvloeiing 90\u2012100% bereikt.
    LET OP: Andere commercieel verkrijgde producten voor celdissociatie kunnen ook worden gebruikt.
  3. Plaatcellen met een dichtheid van 10.000 cellen/mm2 op met matrix gecoate celkweekplaten in MEF-CM met hbFGF en cultuur gedurende twee tot drie dagen.
  4. Wanneer de cultuur volledig samenvloeiend wordt, bedek de cellen met matrix (1:60 verdunning met MEF-CM) voor één dag.
  5. Vervang de MEF-CM door RPMI 1640 + B27 medium. Voeg 100 ng/mL Activin A en 100 ng/mL Wnt3A voor één dag toe aan het medium.
    LET OP: Dit is dag 0 van differentiatie. Om canonieke Wnt-signalering te upreguleren, kunnen GSK3β-remmers ook worden gebruikt in plaats van Wnt3A.
  6. Verander op dag 1 van differentiatie het medium naar nieuwe RPMI 1640 + B27 met 10 ng/mL BMP4 en 10 ng/mL hbFGF. Kweekcellen voor twee (MC-protocol) of vier (CM+EG-protocol) dagen zonder medium verandering5.
    OPMERKING: HET CM+EC-protocol is geoptimaliseerd om tegelijkertijd cardiomyocyten (CMs) en vasculaire endotheelcellen (EC's) op te wekken. MC-protocol is geoptimaliseerd om bij voorkeur vasculaire muurschilderingcellen (MC's) te induceren.
  7. CM+EG-protocol voor de inductie van CMs en EU's (figuur 1A).
    1. Vervang het medium op dag 5 van differentiatie door RPMI 1640 + B27 aangevuld met 50 ng/mL vegf165.
    2. Verander het cultuurmedium om de 48 uur tot dag 13\u201215 van differentiatie.
  8. MC-protocol voor de inductie van vasculaire muurschilderingcellen(figuur 1B)
    1. Vervang het medium door RPMI1640 + 10% foetale runderserum (FBS) op dag 3 van differentiatie.
    2. Verander het cultuurmedium om de 48 uur tot dag 13\u201215 van differentiatie.

2. Celoogst- en afstammingsanalyse op differentiatiedag 13\u201215

  1. Was de cellen met Ca2+ en Mg2+ vrij fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
  2. Voeg celdissociatieoplossing (met proteasen, collagenases en DNAses) toe in de celkweekschotel om de plaat te bedekken. Broed de plaat 5 min bij 37 °C.
  3. Verzamel en dissociale de cellen met cultuurmedium met behulp van een pipet na incubatie.
  4. Wijs 1 x 106 cellen toe voor lijnanalyse met stroomcytometrie. Om dode cellen te elimineren, bevlek de cellen met fixable levensvatbaarheid kleurstof.
  5. Bevlek de cellen met membraanoppervlakmarkeringen in PBS met 5% FBS. Gebruik de volgende verdunningen van antilichamen bij fluorescentie geactiveerde celsorteren (FACS) kleuringsbuffer: anti-PDGFRβ (1:100), anti-VE cadherine (1:100), anti-TRA-1-60 (1:20).
  6. Voor intracellulaire eiwitten, resuspend en fix de cellen met 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS.
  7. Vlek de cellen met anti-cardiale isoform van Troponin T (cTnT) in PBS met 5% FBS en 0,75% Saponin en label het cTnT-antilichaam vervolgens met 488 muis IgG1 (verdunning 1:50).
  8. Resuspend de gekleurde cellen in PBS met 5% FBS en zet ze in FACS buizen met celzeef.
  9. Analyseer de celsamenstelling van de gekleurde cellen van elk differentiatieprotocol met stroomcytometrie om het genereren van celsuspensies met gedefinieerde afstammingsverdelingen te vergemakkelijken.
    OPMERKING: Tijdens het uitvoeren van deze procedure wordt de resterende celsuspensie voor EC's bewaard in een koelkast van 4 °C.

3. Fabricage van PDMS-weefselmal

  1. Giet een laag van 0,5 mm dik en meer dan 30 mm x 30 mm polydimethylsiloxaan (PDMS) door de voorpolymeer- en kruiskoppelingsoplossing te mengen met een verhouding van 10:1 en vervolgens te genezen bij 80 °C gedurende 3 uur.
  2. Snijd de PDMS-plaat en bind het met siliconenlijm om een rechthoekige lade van 21 mm x 20,5 mm te fabriceren met een lengte van 7 mm, 0,5 mm breed en 2,5 mm hoge rechthoekige palen in een gespreide positie. De horizontale afstand tussen twee lijnen van palen bedraagt 2,5 mm (figuur 2B).
  3. Autoclave de lade op 120 °C gedurende 20 minuten.
  4. Bekleed de lade met 1% poloxamer 407 in PBS voor 1 uur. Spoel de poloxamer 407 en spoel de mal voldoende voor gebruik af met PBS.

4. ECT-constructie

  1. Na de analyse van de cellijn, combineer de cellen van CM+EG- en MC-protocollen zodat de uiteindelijke concentratie van MC's 10 tot 20% is in een totaal celaantal van zes miljoen cellen per constructie5.
  2. Schort gemengde zes miljoen cellen op in ECT-kweekmedium (alfa minimaal essentieel medium aangevuld met 10% FBS, 50 μM 2-mercaptoethanol en 100 U/mL Penicilline-Streptomycin).
  3. Voorbereiding van matrixoplossing
    1. Meng 133 μL van zuur oplosbare rat staart collageen type I oplossing (2 mg/mL, pH 3) met 17 μL van 10x minimaal essentieel medium (MEM). Meng vervolgens de oplossing met 17 μL alkalibuffer (0,2 M NaHCO3,0,2 M HEPES en 0,1 M NaOH).
      LET OP: Collageen moet op ijs worden gehouden (4 °C). Controleer buffer kleur en als het medium niet rozeachtig wanneer alle oplossingen worden gemengd, voeg extra alkali buffer aan het medium. De mengstappen moeten collageen I + 10x MEM mengen en vervolgens alkalibuffer toevoegen. Wijzig deze volgorde NIET. Genereer GEEN bubbels in de mix.
    2. Voeg 67 μL keldermembraanmatrix toe aan de geneutraliseerde collageenoplossing.
      LET OP: De gemengde oplossing moet op ijs worden gehouden (4 °C).
  4. Centrifuge de voorbereide celsuspensie met zes miljoen cellen bij 1.100 tpm (240 x g)gedurende 5 min en resuspend de cellen met 167 μL high-glucose DMEM + 20% FBS + 1% penicilline-streptomycine (100x).
  5. Meng de celopening en de matrixoplossing. Het totale volume van cel/matrixmengsel voor één constructie is 400 μL.
    OPMERKING: Het cel/matrixmengsel moet bij deze stap niet-stroperig en rozeachtig zijn. Houd het op ijs als de gel zal stollen bij kamertemperatuur. De uiteindelijke concentratie van collageen type I is 0,67 mg/mL.
  6. Giet de cel / matrix mengsel gelijkmatig over de poloxamer 407 gecoate PDMS weefsel mal, die is geplaatst in een zes-put cultuur plaat12.
    OPMERKING: Giet het mengsel voorzichtig om te voorkomen dat het genereren van bellen om te voorkomen dat vulling gebreken in de gegoten gel.
  7. Het cel/matrixmengsel incuren in een standaard CO2-incubator (37C, 5 % CO2) gedurende 60 minuten.
  8. Nadat het weefsel is gevormd, weken de weefselmal met 4 mL van ECT cultuurmedium.
    OPMERKING: Hoewel de cel/matrix in 60 minuten is gekruist, is de constructie nog steeds erg kwetsbaar. Voeg medium voorzichtig toe om beschadiging te voorkomen.
  9. Kweek het weefsel gedurende 14 dagen met medium verandering elke dag.
  10. Verwijder de ECT voorzichtig van de laadpalen met gesteriliseerde fijne tangen voordat de ECT-implantatie wordt gesteriliseerd.
    OPMERKING: De uiteindelijke ECT-afmetingen na verwijdering uit de mal zijn minder dan de oorspronkelijke mal. Een mal van 2,1 cm x 2,05 cm genereert een vrijgekomen ECT van ongeveer 1,5 cm x 1,5 cm. Een grotere mal van 3,9 cm x 4,05 cm genereert een ECT van ongeveer 3 cm x 3 cm. Losted ECT toont intrinsieke spontane afstraffing in warme cultuurmedium. Hoewel het in eerste instantie een mesh-structuur behoudt, krimpt en condenseert een ongeladen ECT in de loop van de tijd. Het is mogelijk om het weefsel zachtjes te houden met fijne tangen en vervolgens 7-0 zijden hechting te gebruiken om de ECT aan het epicardium te bevestigen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 1A,B toont de schema's van het CM+EC- en MC-protocol. Na het induceren van CMs en ECs uit het CM+EC-protocol en MC-protocol, worden de cellen gemengd om de uiteindelijke MC-concentraties aan te passen om 10 tot 20% van de totale cellen te vertegenwoordigen. De 2 cm brede weefselmal is vervaardigd volgens de ontwerptekening van 0,5 mm dik PDMS-vel(figuur 2A,B). Zes miljoen CM+EC+MC cellen worden gecombineerd met collageen ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na de voltooiing van ons onderzoek naar een lineair formaat, hiPSC afgeleid ECT5, hebben we het protocol aangepast om hiPSC-afgeleide CMs, MC's en MC's te mengen om de in vitro expansie van vasculaire cellen binnen ECT's en de daaropvolgende in vivo vasculaire koppeling tussen ECT's en ontvanger myocardium te vergemakkelijken.

Om het genereren van grotere, implanteerbare mesh ECT-geometrieën te vergemakkelijken, hebben we dunne PDMS-platen gebruikt om de 3D-mallen te on...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen financiële of wetenschappelijke conflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd financieel ondersteund door het Kosair Charities Pediatric Heart Research Program van de Universiteit van Louisville en het Organoid Project van het RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research. HiPSC's die in onze gepubliceerde protocollen werden gebruikt, werden geleverd door het Center for iPS Cell Research and Application, Kyoto University, Kyoto, Japan.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Materials
Cell Culture Dishes 100x20 mm styleFalcon/ Thomas scientific9380C51
Multiwell Plates For Cell Culture 6well 50/CSFalcon / Thomas scientific6902A01
Sylgard 184 Silicone Elastomer KitDow Corning761036
Reagents
AccumaxInnovative Cell TechnologiesAM-105
BMP4, recombinant (10µg)R&DRSD-314-BP-010
Collagen, Type I solution from rat tailSigmaC3867
Growth factor-reduced MatrigelCorning356231
Human VEGF (165) IS, premium gradeMiltenyi130-109-385
Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water)Molecular ProbesP-6866
Recombinant human bFGFWAKO060-04543
Recombinant Human/Mouse/Rat ActivinA (50µg)R&D338-AC-050
rh Wnt-3a (10µg)R&D5036-WN
Versene solutionGibco15040066
Culture medium and supplements
10x MEMInvitrogen11430
2 Mercaptro EthanolSIGMAM6250
B27 supplement minus insulinGibcoA1895601
DMEM, high glucoseGibco11965084
Fetal Bovine Serum (500ml)Any
Fetal Bovine Serum (500ml)Any
L-GlutamineGibco25030081
NaHCO3Any
PBS 1xGibco10010-031
Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL)Gibco15070-063
RPMI1640 mediumGibco21870092
αMEMInvitrogen11900024
Flowcytometry
anti-TRA-1-60, FITC, Clone: TRA-1-60, BD BiosciencesBD / Fisher560380
anti-Troponin T, Cardiac Isoform Ab-1, Clone: 13-11, Thermo Scientific Lab VisionFisherMS-295-P0
BD FACS Clean SolutionBD340345
BD FACSFlow Sheath FluidBD342003
BD FACSRinse SolutionBD340346
EDTAAny
Falcon Tube with Cell Strainer Cap (Case of 500)Corning352235
Fetal Bovine Serum (500ml)Any
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitationMolecular ProbesL34957
PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, Clone: 28D4, BD BiosciencesBD / Fisher558821
SaponinSigma-Aldrich47306-50G-F
VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, Clone: 55-7H1, BD BiosciencesBD / Fisher560411
Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 Labeling KitMolecular ProbesZ25002

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sanganalmath, S. K., Bolli, R. Cell therapy for heart failure: A comprehensive overview of experimental and clinical studies, current challenges, and future directions. Circulation Research. 113, 810-834 (2013).
  2. Fisher, S. A., Doree, C., Mathur, A., Martin-Rendon, E. Meta-Analysis of Cell Therapy Trials for Patients With Heart Failure. Circulation Research. 116, 1361-1377 (2015).
  3. Menasché, P., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors for severe heart failure treatment: first clinical case report: Figure 1. European Heart Journal. 36, 2011-2017 (2015).
  4. Masumoto, H., et al. Human iPS cell-engineered cardiac tissue sheets with cardiomyocytes and vascular cells for cardiac regeneration. Scientific Reports. 4, 6716(2014).
  5. Masumoto, H., et al. The myocardial regenerative potential of three-dimensional engineered cardiac tissues composed of multiple human iPS cell-derived cardiovascular cell lineages. Scientific Reports. 6, 29933(2016).
  6. Zimmermann, W. H., et al. Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts. Nature Medicine. 12, 452-458 (2006).
  7. Fujimoto, K. L., et al. Engineered fetal cardiac graft preserves its cardiomyocyte proliferation within postinfarcted myocardium and sustains cardiac function. Tissue engineering. Part A. 17, 585-596 (2011).
  8. Lancaster, J. J., et al. Surgical treatment for heart failure: cell-based therapy with engineered tissue. Vessel Plus. 2019, (2019).
  9. Bian, W., Liau, B., Badie, N., Bursac, N. Mesoscopic hydrogel molding to control the 3D geometry of bioartificial muscle tissues. Nature protocols. 4, 1522-1534 (2009).
  10. Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34, 5813-5820 (2013).
  11. Christoforou, N., et al. Induced pluripotent stem cell-derived cardiac progenitors differentiate to cardiomyocytes and form biosynthetic tissues. PloS one. 8, 65963(2013).
  12. Nakane, T., et al. Impact of Cell Composition and Geometry on Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Engineered Cardiac Tissue. Scientific Reports. 7, 45641(2017).
  13. Kowalski, W. J., et al. Quantification of Cardiomyocyte Alignment from Three-Dimensional (3D) Confocal Microscopy of Engineered Tissue. Microscopy and Microanalysis. 1, (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Netvormige constructenPDMS weefselmaluitlijning van cardiomyocytenstromale vasculaire fractiecollageenmatrixPoloxamer 407 coatingmyofiberbundelscardiale regeneratie

Gerelateerde artikelen