Methodenartikel

Hepatische voorloperspecificatie van pluripotente stamcellen met behulp van een gedefinieerd differentiatiesysteem

DOI:

10.3791/61256

⸱

10 mei 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1MRC Centre for Regenerative Medicine, University of Edinburgh, 2Research & Development, STEMCELL Technologies Inc

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van dit artikel is om een gestandaardiseerde aanpak te bieden om menselijke hepatische voorloperdifferentiatie van pluripotente stamcellen te induceren. De ontwikkeling van deze procedure met kant-en-klare mediaformuleringen biedt de gebruiker een gemakkelijk systeem om menselijke levercellen te genereren voor biomedisch onderzoek en vertaling.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Leverziekte is een escalerend wereldwijd gezondheidsprobleem. Hoewel levertransplantatie een effectieve manier van therapie is, is de sterfte onder patiënten toegenomen als gevolg van tekorten in de beschikbaarheid van donororganen. Orgaanschaarste beïnvloedt ook de routinematige toevoer van menselijke hepatocyten voor fundamenteel onderzoek en de kliniek. Daarom is de ontwikkeling van hernieuwbare bronnen van menselijke levervoorlopercellen wenselijk en is het doel van deze studie. Om op grote schaal effectief menselijke levervoorlopers te kunnen genereren en inzetten, werd een reproduceerbaar hepatisch voorloperdifferentiatiesysteem ontwikkeld. Dit protocol helpt experimentele reproduceerbaarheid tussen gebruikers in een reeks celkweekformaten en maakt differentiatie mogelijk met behulp van zowel menselijke embryonale als geïnduceerde pluripotente stamcellijnen. Dit zijn belangrijke voordelen ten opzichte van de huidige differentiatiesystemen die het fundamenteel onderzoek zullen verbeteren en de weg kunnen effenen voor klinische productontwikkeling.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Leverziekte vormt een wereldwijde gezondheidsuitdaging, die wereldwijd ongeveer 2 miljoen sterfgevallen per jaar veroorzaakt1. Hoewel er een aantal modelsystemen bestaan om leverziekten te bestuderen en klinisch in te grijpen, wordt het routinematige gebruik van celgebaseerde systemen beperkt door belangrijke nadelen (voor een overzicht zie Szkolnicka et al.2). Geavanceerde humane pluripotente stamcel (hPSC) cultuur en somatische celdifferentiatiemethoden vertegenwoordigen veelbelovende technologieën om hulpmiddelen te ontwikkelen voor fundamenteel biomedisch onderzoek en hernieuwbare bronnen van gedifferentieerde cellen voor de kliniek3,4.

Tot op heden zijn meerdere protocollen voor hepatocyt-achtige cel (HLC) differentiatie ontwikkeld5,6,7,8. Deze protocollen proberen aspecten van de menselijke leverontwikkeling na te bootsen door een combinatie van kleine moleculen en groeifactoren9,10. De meeste protocollen bestaan uit een stapsgewijs differentiatieproces, waarbij hPSC's worden voorbereid op definitief endoderm, gevolgd door hepatische voorloperspecificatie11,12,13en eindigend met HLC-specificatie. HLCs geproduceerd door deze protocollen vertonen een mengsel van foetale en volwassen fenotypes. Dit omvat de expressie van alfa-fetoproteïne (AFP), zoals hepatocytmarkers zoals HNF4α en albumine (ALB), evenals de metabolisatiecapaciteit van geneesmiddelen14,15,16. Tussen laboratoria kan HLC-differentiatie variëren; daarom is de ontwikkeling van gestandaardiseerde protocollen noodzakelijk. Dit zal onderzoekers in staat stellen om op grote schaal effectief stamcel-afgeleide HLCs te genereren en toe te passen voor fundamenteel en klinisch onderzoek.

Er werd een hepatisch voorloperloperdifferentiatiesysteem ontwikkeld dat kan worden toegepast op zowel menselijke embryonale als geïnduceerde pluripotente stamcellijnen met behulp van gemakkelijk te volgen richtlijnen. Deze procedure levert homogene populaties van levervoorlopers op in verschillende cultureware-formaten, variërend van celkweekkolven tot 96 putplaten. Hieronder vindt u het protocol om stamcel-afgeleide levervoorlopers te produceren in 24 en 96 putformaten.

De celdichtheid die in het onderstaande protocol wordt gebruikt, wordt gespecificeerd voor één put van respectievelijk een put van 24 en 96 put (zie tabel 1). Optimalisatie van het startcelnummer is vereist voor de verschillende celkweekplaatformaten en cellijnen. Voorgestelde startceldichtheid voor protocoloptimalisatie is 2 x 105 cellen / cm2. Voor dichtheidsoptimalisatie kunnen verschillende celdichtheden worden getest door ± 50.000 cellen / cm2 tegelijk toe te voegen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Onderhoud van de menselijke pluripotente stamcel (hPSC) op laminine-521

  1. Houd menselijke pluripotente cellen (hPSC's) op 37 °C en 5% CO2 in een 6 well plaat op laminine-521 (LN-521). Voed de cellen dagelijks met 2 ml stamcelonderhoudsmedium (d.w.z. mTeSR1-medium) per put van een 6-putplaat tot de gekozen zaaidag voor differentiatie (dag 0).
  2. Zorg ervoor dat de gewenste celconfluïtentie van 70-80% wordt bereikt voorafgaand aan het oogsten van de cel.

2. Laminine-521 multiwell-voorbereiding en hPSC-zaaiing voor differentiatie

OPMERKING: Voor hPSC's die niet op LN-521 worden onderhouden (bijv. matrigel of fibronectine), splitst u hPSC's op LN-521 en cultuur gedurende 1 week voorafgaand aan het passeren en uitlokken van differentiatie om de efficiëntie van het proces te verbeteren15,17,18.

  1. Laminine-gecoate plaatbereiding
    1. Ontdooi een injectieflacon met recombinant LN-521 (100 μg/ml) bij 4 °C gedurende 2 uur of 's nachts.
    2. Bereid een oplossing van 8 μg/ml door de ontdooide LN-521 te verdunn in ijskoude 1x DPBS met Ca2+/Mg2+.
    3. Voeg 0,25 ml van de 8 μg/ml LN-521-oplossing toe aan elke put van een 24-putplaat of 0,05 ml aan elke put van een 96-putplaat. Laat de plaat zachtjes van links naar rechts schommelen om de putten gelijkmatig te coaten met de LN-521-oplossing.
      OPMERKING: Voor het 96-putplaatformaat kunnen volumedosering, celzaaiing en mediumveranderingen worden uitgevoerd met behulp van een semi-geautomatiseerde pijplijn. Voor details zie Meseguer-Ripolles et al.19.
    4. Sluit de LN-521 gecoate platen af met een semi-transparante, flexibele film en bewaar deze 's nachts bij 4 °C voor gebruik.
      OPMERKING: LN-521 gecoate platen kunnen tot 2 weken worden gebruikt wanneer ze bij 4 °C worden bewaard. Vermijd het drogen van de met laminine beklede putjes.
  2. Op de dag van het celzaaien, warm de voorgecoate platen op in een celkweekincubator bij 37 °C gedurende 30-60 minuten.
  3. Aspirateer de LN-521 oplossing.
    OPMERKING: Vermijd direct contact van de aspirator met de bodem van de put om schade aan de LN-521-coating te voorkomen.
  4. Dispense 0,5 ml stamcelonderhoudsmedium met vers aangevulde 10 μM Rho-geassocieerde kinase (ROCK) -remmer Y27632 aan elke put van een 24-putplaat of 0,05 ml aan elke put van een 96-putplaat. Plaats de plaat in de couveuse totdat deze klaar is voor celzaaien.
  5. Markeer op de geplande zaaidag (dag 0) en met een hPSC-samenvloeiing tussen 70-80% alle regio's van spontane differentiatie op de bodem van de putten van de 6 putplaat.
    OPMERKING: Spontane differentiatie kan worden gevisualiseerd door een grove verandering in de celgrootte en/of de aanwezigheid van verschillende celmorfologieën met behulp van fasecontrastmicroscopie.
  6. Aspirateer en gooi de gemarkeerde gebieden van differentiatie en het gebruikte medium uit de putten. Was elke put met 1 ml DPBS zonder Ca2+/Mg2+ bij kamertemperatuur (RT).
  7. Voeg 1 ml enzymvrij dissociatiereagens (zie materiaaltabel)toe aan elke put en incubeer bij 37 °C gedurende 8-10 minuten totdat de cellen zichtbaar loskomen van de plaat.
  8. Gebruik een celschraper om de cellen voorzichtig los te maken van de putten. Pipetteer de inhoud van elk putje 2-4x op en neer met een P1000-pipet om een eencellige suspensie te krijgen. Voor elke cellijn, pool cellen uit alle onderhoudsputten in een steriele buis van 50 ml.
  9. Was elk goed geleegd met 1 ml van het stamcelonderhoudsmedium. Voeg de wasbeurten toe aan de overeenkomstige buis met de samengevoegde cellen van de juiste cellijn.
  10. Voer voor elke cellijn drie levensvatbare celtellingen uit op de samengevoegde monsters. Bereken het gemiddelde aantal levende cellen (levende cellen/ml) voor elke cellijn.
  11. Centrifugeer de gepoolde monsters bij 250 x g gedurende 5 minuten bij RT. Adem het supernatant op en resuspend de celkorrel vervolgens in 1-3 ml RT-stamcelonderhoudsmedium, vers aangevuld met 10 μM ROCK-remmer Y27632.
  12. Bereken voor elke cellijn het benodigde celnummer volgens het aantal putjes dat in stap 2.4 is voorbereid (zie tabel 1). Resuspend het vereiste celnummer met stamcelonderhoudsmedium vers aangevuld met 10 μM ROCK-remmer Y27632.
  13. Voeg de berekende volumes toe aan de putten van de voorbereide en voorgecoate platen uit stap 2.4 zonder het eerder toegevoegde volume te verwijderen. Het totale volume per put is 1 ml voor een 24 putplaat en 0,1 ml voor een 96 putplaat. Schommel de platen voorzichtig van links naar rechts en heen en weer om een gelijkmatige celverspreiding door de put te garanderen.
    OPMERKING: Een gelijkmatige celverdeling over de put is de sleutel tot homogene celzaaiing en succesvolle differentiatie.
  14. Plaats de gezaaide platen in de incubator en laat de gezaaide platen onmiddellijk zachtjes heen en weer en van links naar rechts schommelen om de cellen gelijkmatig te verdelen en de culturen op 37 °C en 5% CO2te houden.

3. Het differentiëren van hPSC's naar levervoorlopers op laminine-521

  1. Bereid media voor op definitieve endoderm-inductie (fase 1) met behulp van het Endoderm Basal Medium aangevuld met de juiste additieven.
    1. Ontdooi op dag 0 de fles van de Endoderm Basal Medium 's nachts bij 4 °C.
    2. Bereid fase 1 Medium 1 (voor gebruik op dag 1) indien nodig voor.
    3. Dooi Supplement MR en Supplement CJ op ijs.
    4. Verdun Supplement MR en Supplement CJ 1:100 in het Endoderm Basaal Medium.
    5. Bereid fase 1 Medium 2 voor op gebruik op dag 2-4 indien nodig.
    6. Verdun Supplement CJ 1:100 in het Endoderm Basal Medium.
  2. Bereid media voor op de daaropvolgende hepatische voorloitorcelspecificatie (fase 2) differentiatie met behulp van het hepatische voorlopermedium.
    1. Ontdooi op dag 4 de fles van de Hepatic Progenitor Medium 's nachts bij 4 °C.
      OPMERKING: 1% penicilline/streptomycine (eindconcentraties van respectievelijk 100 IE/ml en 100 μg/ml) werd voor dit experiment gebruikt. Antibiotica zijn niet nodig; antibioticagebruik is ter beoordeling van de gebruiker.
  3. Verwijder op dag 1 van de differentiatie het gebruikte stamcelonderhoudsmedium met 10 μM ROCKi Y-27632 medium uit de putten en vervang door 0,5 ml complete Stage 1 Medium 1 per put van een 24 putplaat en 0,1 ml per put van een 96 putplaat.
  4. Verwijder op dag 2, 3 en 4 het gebruikte medium en voer elke put met 0,5 ml Stage 1 Medium 2 per put voor een 24-putplaat of 0,1 ml per put van een 96-putplaat.
  5. Fixeer op dag 5 de putten voor definitieve endodermdifferentiatieanalyse via immunocytochemie. Verwijder voor de resterende putten het gebruikte medium en voer elke put met 0,5 ml Hepatic Progenitor Differentiation Medium per put voor een 24-putplaat of 0,1 ml per put van een 96-putplaat. Ververs het medium opnieuw op dag 6, 7 en 9.
  6. Oogst op dag 10 putten voor hepatische voorloperdifferentiatieanalyse of ga verder met verdere hepatocytachtige celdifferentiatie.
    OPMERKING: Op dit moment werden monsters gefixeerd met 4% paraformaldehyde (PFA) voor immunocytochemische analyse of supernatant werd verzameld voor ELISA en cellen werden verzameld voor eiwitkwantificering.

4. Karakterisering van de hepatische voorloperdifferentiatieculturen gegenereerd uit hPSC's op laminine-521

  1. Detecteer op dag 5 de expressie van definitieve endoderm-specifieke markers met behulp van immunostaining.
  2. Detecteer op dag 10 de expressie van hepatische voorloperspecifieke markers met behulp van immunostaining.
  3. Meet op dag 10 de AFP- en ALB-secretie via ELISA met behulp van een kit volgens de instructies van de fabrikant en normaliseer per mg eiwit zoals bepaald door een bicinchoninezuur (BCA) eiwittest.
  4. Beoordeel de variabiliteit van de levervoorloper van de 96-putplaat door het percentage HNF4α-positieve cellen per put te kwantificeren.

5. Immunocytochemie en beeldverwerving

  1. Op dag 5 en 10 van de differentiatie, was cellen 3x met 1x DPBS, met 0,5 ml per put van een 24 putplaat en 0,1 ml per put van een 96 putplaat. Incubeer de plaat met zacht schudden gedurende 2-5 minuten bij RT.
    OPMERKING: Gebruik DPSB zonder Ca2+/Mg2+ voor immunocytochemie.
  2. Fixeer de cellen met 4% paraformaldehyde (PFA) bij RT gedurende 15-30 minuten door 0,3 ml PFA per put toe te voegen voor een 24-putplaat en 0,1 ml per put van een 96-putplaat.
  3. Was 3x met 1x DPBS zoals beschreven in stap 5.1.
  4. Permeabiliseer het membraan met PBST met behulp van 0,1% Tween, 1x DPBS en incubeer gedurende 20 minuten bij RT door 0,3 ml PBST toe te voegen per put van een 24 putplaat en 0,1 ml per put van een 96 putplaat.
  5. Voer het eiwitblok uit door de cellen gedurende 1 uur te incuberen met 10% BSA in PBST, waarbij 0,3 ml BSA per put van een 24-putplaat en 0,1 ml BSA per put van een 96-putplaat wordt toegevoegd, voorzichtig schuddend met behulp van een platenschudder.
  6. Vervang na eiwitblokkering de blokkerende oplossing door het primaire antilichaam verdund in 1% BSA in PBST en incubeer bij 4 °C met zacht schudden gedurende de nacht.
    OPMERKING: Niet wassen tussen eiwitblok en antilichaamtoevoeging.
  7. Was na 24 uur de putjes 3x met PBST.
  8. Voeg het secundaire antilichaam in 1% BSA toe in PBST. Incubeer 1 uur bij RT in het donker met zacht schudden.
  9. Na secundaire antilichaamincubatie, wasputten 3x met 1x DPBS en geef Hoechst-vlek af volgens de instructies van de fabrikant gedurende 10 minuten bij RT in het donker met zacht schudden.
  10. Wassen 3x met 1x DPBS. De platen zijn nu klaar voor beeldvorming.
    OPMERKING: Bewaar platen bij 4 °C in het donker totdat de afbeelding wordt ingebeeld.
  11. Stel de multiwell-plaat voor met behulp van een beeldvormingsmicroscoop met een hoog gehalte na immunohistochemie. Beeldverwerving van verschillende gezichtsvelden wordt aanbevolen om een getrouwe weergave van de put te verkrijgen. De expressie van de verschillende markers werd beoordeeld via celsegmentatieanalyse met behulp van commerciële software (zie Tabel van materialen) ( Figuur1).
    OPMERKING: Celsegmentatie kan ook worden uitgevoerd met behulp van een open-source software voor beeldanalyse, zoals CellProfiler of Fiji20,21.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hepatische voorloperdifferentiatie van zowel hESC (H9) als hiPSC (P106) lijnen werd uitgevoerd volgens het stapsgewijze protocol beschreven in figuur 2. Hier werden pluripotente stamcellen als afzonderlijke cellen in LN-521-gecoate platen gezaaid voorafgaand aan het begin van de differentiatie. Celconfluentie is de sleutel tot een robuuste en reproduceerbare differentiatie. Zodra de juiste samenloop was bereikt(figuur 2),werd differentiatie geïnitieerd. Op dag 5 werd de definitieve endodermspecificatie beoordeeld via Sox17-expressie. In beide cellijnen was Sox17 sterk tot expressie gebracht met 80% ± 0,5% en 87,8% ± 0,5% SEM van Sox17-positieve cellen voor respectievelijk H9 en P106 (figuur 3). Op dag 10 vertoonden levervoorlopers een geplaveide morfologie(figuur 2). Daarnaast werd de hepatische voorloperspecificatie beoordeeld voor HNF4α-, AFP-, ALB- en cytokeratine-19 (CK19)-expressie, evenals AFP- en ALB-eiwitsecretie10,15,22 (figuur 4). Zowel H9- als P106-levervoorloperculturen kwamen tot expressie van foetale levermarkers zoals HNF4α (91% ± 0,5% en 90% ± 0,2%), AFP (89,7% ± 1,8% en 86% ± 1,2%), en CK19 (78,5% ± 3,2% en 83,6 ± 1,8%)(figuur 4). AFP-secretie werd gedetecteerd op dag 10 in beide cellijnen (32,4 ± 1,6 en 47,8 ± 5,9 ng / ml / mg / 24 uur) (figuur 5). Albuminesynthese werd waargenomen op lagere niveaus (30,7% ± 1,8% en 27,2% ± 1,1%)(figuur 4)en werd niet gedetecteerd via ELISA(figuur 5).

Het protocol maakte de gestandaardiseerde productie van levervoorlopers mogelijk van 24 put- tot 96 putplaten. Een semi-geautomatiseerde pijpleiding werd gebruikt om 96 putplaten van levervoorlopers van H9- en P106-cellijnen te produceren, zoals eerder beschreven17. Celgetalvariabiliteit en hepatische voorloperdifferentiatie-efficiëntie werd beoordeeld door kwantificering van HNF4α-expressie. Celsegmentatie werd uitgevoerd voor eiwitkwantificering via immunofluorescentie met behulp van een beeldvormingsinstrument met een hoog gehalte(figuur 1). Op dag 10 vertoonden levervoorlopers geen significante variabiliteit tussen rijen met >94% HNF4α-positieve cellen per put voor H9 en 97% HNF4α-positieve cellen voor P106 (figuur 6).

figure-results-1
Figuur 1: Overzicht van de celsegmentatiepijplijn. (A) Met behulp van de oorspronkelijke afbeelding werd (B) nucleaire kleuring gebruikt voor kernsegmentatie. (C) Een nucleaire segmentatiekwaliteitscontrole op basis van vorm en grootte werd uitgevoerd om alleen duidelijk gesegmenteerde kernen te kwantificeren. (D) Hierna werden positieve HNF4α-gekleurde kernen gekwantificeerd. (E) Ten slotte werd een op intensiteit gebaseerde drempel gebruikt om HNF4α-tot expressie brengende cellen te identificeren. In C en Evertegenwoordigen groene kernen geselecteerde cellen en magentakernen duiden op afgedankte cellen. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Hepatische voorloperdifferentiatie van hPSC's. (A) Schematische weergave van het hepatische voorloperdifferentiatieprotocol. (B) Representatieve afbeeldingen die de morfologische veranderingen tijdens de differentiatie benadrukken. Op dag 0 (D0) presenteerden hPSC's een verpakte monolaag van cellen. Hierna werden hPSC's op dag 5 (D5) geprimed tot definitief endoderm. Dit werd gevolgd door hepatische voorloperdifferentiatie op dag 10 (D10). Levervoorlopers vertoonden een geplaveide celmorfologie. Schaalbalk = 75 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Karakterisering van definitieve endodermspecificatie. Op dag 5 werden cellen gekleurd voor Sox17, een definitieve endodermmarker. Het percentage Sox17-positieve cellen was 80 ± 0,5% voor H9 en 87,8 ± 0,5% voor P106. De procentuele kwantificering was gebaseerd op 10 afzonderlijke putten met 6 gezichtsvelden per put. De gegevens worden weergegeven als de gemiddelde ± SEM. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Karakterisering van de voorloper van de lever. Op dag 10 werden levervoorlopers gekleurd voor levermarkers (A) HNF4α, (B) AFP en (C) ALB. Voor H9 was het percentage positieve cellen 91% ± 0,4%, 89,7% ± 1,8% en 30,7% ± 1,8% voor respectievelijk HNF4α, AFP en ALB. Voor P106 was het percentage positieve cellen 90% ± 0,2%, 86% +/- 1,2% en 27,2% ± 1,1% voor respectievelijk HNF4α, AFP en ALB. D)Hetpotentieel van de afstamming van cholangiocyten werd beoordeeld via CK19-expressie; H9-afgeleide levervoorlopercellen kwamen tot expressie van 78,5% ± 3,2% CK19-positieve cellen, terwijl 83,6% ± 1,8% van de CK19-positieve cellen werden waargenomen voor P106-levervoorlopers. Immunoglobuline G (IgG) kleuring werd gebruikt als een kleuringscontrole. De procentuele kwantificering was gebaseerd op 10 afzonderlijke putten met 6 gezichtsvelden per put. De gegevens worden weergegeven als de gemiddelde ± SEM. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Analyse van de secretie van de eiwitref van de voorloper. De secretie van alfa-fetoproteïne (AFP) en albumine (ALB) werd geanalyseerd in levervoorloperculturen op dag 10 in H9 en P109. De gegevens vertegenwoordigen drie biologische replicaties en de foutstaven vertegenwoordigen de SD. Uitgescheiden eiwitten werden gekwantificeerd uit 24-uurs kweekmedium als nanogram uitgescheiden eiwit per ml per mg eiwit, n = 3; ND = niet gedetecteerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Beoordeling van well-to-well variabiliteit in 96 well plate. (A) Visualisatie van een 96 putplaatweergave van van H9 afgeleide levervoorlopers gekleurd met HNF4α. B)Kwantificering van de HNF4α-positieve cellen. Gemiddeld aantal cellen per put in rijen, van zes gezichtsvelden per goed gekwantificeerd. Het gemiddelde celgetal over de plaat was 94,81% ± 0,22 SEM HNF4α-positieve cellen per put. Er werden geen statistisch significante verschillen waargenomen tussen putten. (C) Visualisatie van een 96 putplaatweergave van P106-afgeleide levervoorlopers gekleurd met HNF4α. (D) Kwantificering van HNF4α-positieve cellen. Het gemiddelde celgetal per put in rijen, uit zes gezichtsvelden per put en gekwantificeerd. Het gemiddelde celgetal over de plaat was 97,7% ± 0,57 SEM HNF4α-positieve cellen per put. Er werden geen statistisch significante verschillen waargenomen tussen rijen. Welnu, H12 werd gebruikt als een Immunoglobuline G (IgG) kleuringscontrole. Schaalbalk = 1 mm. Eenrichtings-ANOVA met Tukey's post-hoc statistische tests werden gebruikt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

PlaatformaatOppervlakte (cm2)Cellen per cm2Totaal aantal cellen per putDoseervolume (ml)Celconcentratie (cellen/ml)
24-wells plaat1.92105264000000.5800000
96-well plaat0.32187500600000.051200000

Tabel 1: Aanbevolen celdichtheid voor de verschillende plaatformaten voor de hPSC-cellijnen die in dit protocol worden gebruikt.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het op grote schaal genereren van menselijke levervoorlopercellen uit pluripotente stamcellen zou een veelbelovend alternatief kunnen zijn voor kadaver-afgeleid materiaal. Protocolstandaardisatie en reproduceerbaarheid zijn essentieel om technologische vertaling en impact voor biomedisch onderzoek te garanderen. Om dit aan te pakken, heeft eerder werk zich gericht op het ontwikkelen van een stapsgewijs differentiatieprotocol van hESC en iPSC's met behulp van gedefinieerde additieven en matrices15,23,24,25,26,27,28. Door dit te doen, zijn het fenotype en de reproduceerbaarheid van hepatocyten verbeterd, waardoor de semi-automatisering van het differentiatieproces19mogelijk is . Het gepresenteerde systeem wordt versterkt door de combinatie met kant-en-klare celkweekmedia en een gemakkelijk hepatocytendifferentiatiesysteem.

Eerder werd pluripotente celdichtheid voorafgaand aan de start van het differentiatieprotocol benadrukt als een belangrijke variabele om een homogene populatie van levervoorlopercellen te bereiken26. Met behulp van deze meer verfijnde procedure is het mogelijk om stapsgewijs grote aantallen van stamcellen afgeleide levervoorlopers te genereren met behulp van een reeks startceldichtheden(tabel 1). Op dag 5 werd de definitieve endoderm-inductie gevalideerd door Sox17-kleuring(figuur 3). Efficiënte en robuuste differentiatie in definitief endoderm werd bereikt met zowel geteste ESC- als iPSC-lijnen, waarbij meer dan 80% Sox17 uitdrukte(figuur 3). Op dag 10 vertoonden levervoorlopers een uniforme geplaveide morfologie en waren leverstamcelmarkers sterk verrijkt voor zowel AFP als HNF4α (>86%, figuur 4). Met behulp van een combinatie van handmatige en semi-geautomatiseerde technologieën was het mogelijk om differentiatie in meerdere plaatformaten uit te voeren19.

In zijn huidige vorm is celdifferentiatie geschikt voor in vitro gebaseerde experimenten. Celverrijking zou echter waarschijnlijk nodig zijn vóór klinische toepassing om ervoor te zorgen dat een homogene populatie van levervoorlopers wordt voorbereid op levering.

Kortom, het hier beschreven protocol biedt het veld een gestandaardiseerde aanpak om levervoorlopers op grote schaal te produceren. Toekomstige werkzaamheden zullen zich richten op de productie van een nieuw medium voor latere HLC-differentiatie, rijping en onderhoud.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

David C. Hay is mede-oprichter en aandeelhouder van Stemnovate Ltd. De rest van de auteurs verklaart dat ze geen belangenconflicten hebben in het onderwerp of materiaal dat in dit artikel wordt besproken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund met prijzen van het MRC Doctoral Training Partnership (MR/K501293/1), het UK Regenerative Medicine Platform (MRC MR/L022974/1 en MR/K026666/1), het Chief Scientist Office (TCS/16/37).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
DPBS met Calcium en MagnesiumThermoFisher14040133
Gentle cel dissociatie reagensSTEMCELL Technologies7174
Hoechst 33342 Ready Flow ReagensthermofisherR37165
Human Recombinant Laminine 521BioLaminaLN521-02
Human Serum Albumine ELISAAlpha Diagnostics1190
Human Serum Alpha Fetoproteïne ELISAAlpha Diagnostics500
mTeSR1 mediumSTEMCELL Technologies5850
Operetta High-Content Imaging SystemPerkinElmerHH12000000
PBS, geen calcium, geen magnesiumThermoFisher14190250
Penicilline-Streptomycine (10.000 U/mL)Life Technologies15140122
Rho-geassocieerde kinase (ROCK) remmer Y27632Sigma-AldrichY0503-1MG
STEMdiff Definitive Endoderm Supplement CJSTEMCELL Technologies
STEMdiff Definitive Endoderm Supplement MRSTEMCELL Technologies
STEMdiff Endoderm Basaal MediumSTEMCELL Technologies
STEMdiff Hepatisch Progenitor MediumSTEMCELL Technologies
TWEEN 20Sigma-AldrichP9416
Antilichamen
AlbumineSigma-AldrichA66841:200 (muis)
Alpha-fetoproteïneSigma-AldrichA84521:400 (muis)
HNF-4αSanta Cruzsc-89871:400 (konijn)
IgGDAKO1:400
Sox17R&D Systems, Inc.AF19241:200 (geit)
Software
Columbus Image Data Storage en Analyse systeemPerkinElmer

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S. Burden of liver diseases in the world. Journal of Hepatology. 70 (1), 151-171 (2019).
  2. Szkolnicka, D., Hay, D. C. Concise Review: Advances in Generating Hepatocytes from Pluripotent Stem Cells for Translational Medicine. Stem Cells Dayton Ohio. 34 (6), 1421-1426 (2016).
  3. Heslop, J. A., Duncan, S. A. The Use of Human Pluripotent Stem Cells for Modeling Liver Development and Disease. Hepatology. 69 (3), 1306-1316 (2019).
  4. Alwahsh, S. M., Rashidi, H., Hay, D. C. Liver cell therapy: is this the end of the beginning. Cell and Molecular Life Sciences. 75 (8), 1307-1324 (2018).
  5. Hay, D. C., et al. Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo. Stem Cells Dayton Ohio. 26 (4), 894-902 (2008).
  6. Si-Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).
  7. Hannan, N. R. F., Segeritz, C. -P., Touboul, T., Vallier, L. Production of hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 8 (2), 430-437 (2013).
  8. Basma, H., et al. Differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived hepatocytes. Gastroenterology. 136 (3), 990-999 (2009).
  9. Meseguer-Ripolles, J., Khetani, S. R., Blanco, J. G., Iredale, M., Hay, D. C. Pluripotent Stem Cell-Derived Human Tissue: Platforms to Evaluate Drug Metabolism and Safety. The AAPS Journal. 20 (1), 20(2017).
  10. Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A. Organogenesis and development of the liver. Developmental Cell. 18 (2), 175-189 (2010).
  11. D'Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).
  12. Shin, D., et al. Bmp and Fgf signaling are essential for liver specification in zebrafish. Development Cambridge England. 134 (11), 2041-2050 (2007).
  13. DeLaForest, A., et al. HNF4A is essential for specification of hepatic progenitors from human pluripotent stem cells. Development Cambridge England. 138 (19), 4143-4153 (2011).
  14. Baxter, M., et al. Phenotypic and functional analyses show stem cell-derived hepatocyte-like cells better mimic fetal rather than adult hepatocytes. Journal of Hepatology. 62 (3), 581-589 (2015).
  15. Cameron, K., et al. Recombinant Laminins Drive the Differentiation and Self-Organization of hESC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 5 (6), 1250-1262 (2015).
  16. Szkolnicka, D., et al. Reducing Hepatocyte Injury and Necrosis in Response to Paracetamol Using Noncoding RNAs. Stem Cells Translational Medicine. 5 (6), 764-772 (2016).
  17. Domogatskaya, A., Rodin, S., Boutaud, A., Tryggvason, K. Laminin-511 but Not -332, -111, or -411 Enables Mouse Embryonic Stem Cell Self-Renewal In Vitro. Stem Cells. 26 (11), 2800-2809 (2008).
  18. Kanninen, L. K., et al. Laminin-511 and laminin-521-based matrices for efficient hepatic specification of human pluripotent stem cells. Biomaterials. 103, 86-100 (2016).
  19. Meseguer-Ripolles, J., Lucendo-Villarin, B., Wang, Y., Hay, D. C. Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (137), e57995(2018).
  20. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7, 100(2006).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Raven, A., et al. Cholangiocytes act as Facultative Liver Stem Cells during Impaired Hepatocyte Regeneration. Nature. 547 (7663), 350-354 (2017).
  23. Hay, D. C., et al. Unbiased screening of polymer libraries to define novel substrates for functional hepatocytes with inducible drug metabolism. Stem Cell Research. 6 (2), 92-102 (2011).
  24. Medine, C. N., et al. Developing High-Fidelity Hepatotoxicity Models from Pluripotent Stem Cells. Stem Cells Translational Medicine. 2 (7), 505-509 (2013).
  25. Szkolnicka, D., et al. Accurate prediction of drug-induced liver injury using stem cell-derived populations. Stem Cells Translational Medicine. 3 (2), 141-148 (2014).
  26. Wang, Y., et al. Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (121), e55355(2017).
  27. Villarin, B. L., et al. Polymer Supported Directed Differentiation Reveals a Unique Gene Signature Predicting Stable Hepatocyte Performance. Advanced Healthcare Materials. 4 (12), 1820-1825 (2015).
  28. Wang, Y., et al. Multiomics Analyses of HNF4α Protein Domain Function during Human Pluripotent Stem Cell Differentiation. iScience. 16, 206-217 (2019).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Hepatic Progenitor CellsPluripotent Stem CellsDefined Differentiation SystemLaminin 521 CoatingROCK Inhibitor Y27632Definitive Endoderm InductionHepatic Progenitor SpecificationHNF4 Alpha ExpressionAlpha Fetoprotein SecretionImmunostaining Analysis

Gerelateerde artikelen