Forward Genetisch Scherm met behulp van transgene calcium Reporter Aequorin om nieuwe doelen te identificeren in calcium signalering

Samenvatting

Een voorwaarts genetisch scherm op basis van Ca^{2 +} hoogte als een read-out leidt tot de identificatie van genetische componenten die betrokken zijn bij calcium afhankelijke signalering trajecten in planten.

Samenvatting

Voorwaartse genetische schermen zijn belangrijke instrumenten geweest bij de onbevooroordeelde identificatie van genetische componenten die betrokken zijn bij verschillende biologische trajecten. De basis van het scherm is het genereren van een mutant populatie die kan worden gescreend met een fenotype van belang. EMS (ethylmethaansulfonaat) is een veelgebruikt alkylaatmiddel voor het induceren van willekeurige mutatie in een klassiek voorwaarts genetisch scherm om meerdere genen te identificeren die betrokken zijn bij een bepaald proces. Cytosolic calcium (Ca^{2 +}) hoogte is een belangrijke vroege signalering traject dat wordt geactiveerd op stress perceptie. Maar de identiteit van receptoren, kanalen, pompen en transporters van Ca^{2 +} is nog steeds ongrijpbaar in veel studiesystemen. Aequorin is een cellulair calcium reporter eiwit geïsoleerd van Aequorea victoria en stabiel uitgedrukt in Arabidopsis. Door dit te benutten, ontwierpen we een voorwaarts genetisch scherm waarin we ems-mutagenized de aequorine transgene. De zaden van de gemuteerde planten werden verzameld (M₁) en screening op het fenotype van belang werd uitgevoerd in de segregatie (M₂) populatie. Met behulp van een 96-well high-throughput Ca²⁺ meetprotocol kunnen verschillende nieuwe mutanten worden geïdentificeerd die een wisselende calciumrespons hebben en in realtime worden gemeten. De mutanten met het fenotype van belang worden gered en gepropageerd tot een homozygoot gemuteerde plantenpopulatie wordt verkregen. Dit protocol biedt een methode voor voorwaartse genetische schermen in Ca^{2 +} reporter achtergrond en identificeren van nieuwe Ca^{2 +} gereguleerde doelen.

Inleiding

Een verandering in cytosolic calcium (Ca²⁺) concentratie op de perceptie van biotische of abiotische stimulus is een goed bestudeerde vroege signalering gebeurtenis die veel signalering trajecten^{activeert 1,2,3,4}. Een cel in zijn basale rusttoestand behoudt een lagere Ca²⁺ concentratie in de cytosol en sekwestreert overtollige Ca²⁺ in verschillende intracellulaire organellen en extracellulaire apoplast die leidt tot een steile Ca^{2+ hellingsgraad 5,6}. Bij signaalperceptie stijgen ca²⁺ niveaus in de cytosol als gevolg van een toestroom van Ca²⁺ uit extracellulaire en/of intracellulaire bronnen en genereren ze een stimulispecifieke calciumsignatuur^7,8,9. Ca²⁺ verhogingen in de cytosol worden geactiveerd door vele stimuli, maar de specificiteit wordt gehandhaafd door verschillende winkels die Ca²⁺vrijgeven, een unieke Ca²⁺ handtekening en geschikte sensoreiwitten^10,11.

Het gebruik van alkylaatmiddel, ethyl-methaansulfonaat (EMS) voor mutagenesis is een krachtig hulpmiddel in klassieke voorwaartse genetische schermen om meerdere onafhankelijke genen te identificeren die betrokken zijn bij een proces. EMS is een chemische mutageen die voornamelijk C tot T en G naar A leidt, willekeurig door het genoom en produceert een verandering van 1 bp in elke 125 kb van het genoom. EMS mutagenesis zal leiden tot ≈1000 single base pair veranderingen, hetzij inbrengen / schrappingen (InDel) of single nucleotide polymorfisme (SNP) per genoom¹². EMS-geïnduceerde mutaties zijn meervoudige puntmutaties met een mutatiefrequentie variërend van 1/300 tot 1/30000 per locus. Dit vermindert het aantal M₁ planten die nodig zijn om een mutatie in een bepaald gen te vinden. Een M₁ zaadpopulatie bereik van 2000-3000 wordt meestal gebruikt om mutaties van belang in Arabidopsis thaliana^13,14te verkrijgen .

Aequorin transgenics zijn Arabidopsis Columbia-0 (Col-0) ecotype planten uitdrukken p35S-apoaequorin (pMAQ2) in de cytosol¹⁵. Aequorin is een Ca²⁺ bindend eiwit bestaande uit apoproteïne en een prothetische groep bestaande uit luciferine molecuul, coelenterazine. De binding van Ca²⁺ aan aequorin, dat drie Ca²⁺ bindende EF-hands sites heeft, resulteert in coelenterazine wordt geoxideerd en cyclized om de dioxetanon intermediair te geven, gevolgd door een conformatieverandering van het eiwit vergezeld van het vrijkomen van kooldioxide en singlet-opgewonden coelenteramide¹⁶. De aldus geproduceerde coelenteramide zendt een blauw licht (λ_max, 470 nm) uit dat kan worden gedetecteerd door de luminometer¹⁷. De extreem snelle Ca²⁺ verhogingen kunnen dus in real time worden gemeten en worden benut voor snelle voorwaartse genetische schermen. Dit protocol is bedoeld om de specificiteit van calciumrespons te gebruiken om nieuwe belangrijke spelers te identificeren die betrokken zijn bij de Ca²⁺ handtekening. Om deze taak te volbrengen, gebruiken we EMS mutagenesis in transgene aequorine en identificeren we de SNPs die zijn gekoppeld aan gewijzigde Ca²⁺ signalering. Het protocol identificeert mutanten die geen of verminderde Ca²⁺ verhogingen vertonen bij toevoeging van stimuli. Deze mutanten kunnen vervolgens in kaart worden gebracht om de genen te identificeren die verantwoordelijk zijn voor de Ca²⁺ respons. De methode is van toepassing op elke vorm van vloeibare stimuli in planten die resulteert in een Ca^{2 +} hoogte. Aangezien Ca^{2 +} hoogte is een van de eerste reacties in de plant verdediging signalering traject, de identificatie van upstream respons componenten kunnen kandidaten voor genetische manipulatie om veerkrachtige planten te ontwikkelen.

Protocol

1. EMS mutagenesis en zaadverzameling op basis van één stamboom (1-3 maanden)

1. Weeg 150 mg zaden (~ 7500) van aequorine voor EMS mutagenesis (M₀ zaden). Weeg nog eens 150 mg zaden om te worden gebruikt als een controle.
2. Breng de zaden over op een buis van 50 mL en voeg 25 mL ems (v/v) (v/v) (VOOR behandeling) of 25 mL autoclaved water (voor controle) toe.
   OPMERKING: Ethyl-methaansulfonaat is een chemisch middel voor het mutageniseren van plantaardig materiaal.
3. Verzegel de buis met parafilm en wikkel deze in aluminiumfolie. Draai de buis 18 uur overeind bij kamertemperatuur.
4. Laat de zaden te regelen. Verwijder de EMS-oplossing zorgvuldig en gooi deze weg in een afvalcontainer met 1 M NaOH in gelijke volumes (NaOH helpt ems te neutraliseren/inactiveren, waardoor het veilig is om te verwijderen). Gooi het gebruikte plasticgoed weg in een NaOH-oplossing van 1 M.
   OPMERKING: Na 24 uur moet u de teruggooi verwijderen volgens laboratoriumpraktijken voor gevaarlijke stoffen.
5. Was de gemutageniseerde zaden grondig met 40 mL autoclaved water ten minste 8 keer. Gooi EMS met water in een NaOH afvalcontainer zoals hierboven vermeld.
6. Voeg voor de laatste wasbeurt 40 mL natriumthiosulfaat van 100 mM toe en spoel 3 keer om sporen van EMS te verwijderen.
7. Week de zaden in 40 mL autoclaved water voor ~ 1 uur om EMS diffuus uit zaden en leg ze op filterpapier tot volledig droog.
8. Breng de zaden over op een microcentrifugebuis en stratificeer de zaden 2-4 dagen in 4 °C in 40 mL autoclaved water. Dit helpt bij het breken van zaad sluimeren en zorgt voor homogene groei.
9. Breng zowel de gemutageniseerde zaden (M₀) als de controlezaden over op de bodem (bodemsamenstelling: agropet: soilrite, 1:1) en breng ze over naar groeiruimten met een 16 uur licht/8 uur donkere fotoperiode, een lichtintensiteit van 150 μ·m⁻²⁻¹ en ~70% relatieve vochtigheid.
10. Om te bepalen of mutagenesis succesvol was, op zoek naar verminderde kiemsnelheid en zaailing groei, en chlorofyl sectoring¹⁸ (Figuur 1A). Vergelijk de gemutageniseerde planten met de controleplanten om deze fysiologische en ontwikkelingsverschillen te identificeren.
    LET OP: Verschillende methoden kunnen worden gebruikt voor het oogsten van zaden van M₁ planten. In dit protocol hebben we gebruik gemaakt van de single stamboomgebaseerde zaadverzamelingsmethode. Elke M₁ plant krijgt een uniek nummer, van A1 tot A3500.
11. Houd individueel genummerde planten in stand als afzonderlijke plantenlijnen (figuur 1B).
12. Bij rijping oogst u zaden van deze afzonderlijke gemuteerde planten en bewaar deze als afzonderlijke M_1-lijnen (figuur 2). Uit de single pedigree-based seed collectie, verkregen we ongeveer 5000 M₁ lijnen waarvan 3500 M₁ lijnen werden gescreend.

2. Screening met hoge doorvoer op geselecteerde mutanten (8 maanden)

1. Identificeer nieuwe mutanten op basis van de Ca²⁺ reactie op een geselecteerde stimulus. Hier gebruikten we H₂O₂ als voorbeeld.
2. Voor het identificeren van mutanten, het scherm van de M₂ generatie. Aangezien recessieve mutanten bij 1/8-frequentie in M_2-generatie scheiden op EMS mutagenesis^14,beslaat screening van 8-12 M₂-segregaterende planten één M_1-lijn en identificeert een homozygoot recessieve mutant (met behulp van 12 zaailingen verhoogt de kans op het vinden van een mutant). Test van elke onafhankelijke M_1-lijn 12 M_{2 zaailingen} voor Ca²⁺ respons op H₂O₂ (12 M_{2 zaailingen} per M_1-lijn).
3. Gebruik een hoge doorvoer zaad sterilisatie en hydrocultuur plantengroei protocol¹⁹. Plaats bijna 12-15 M₂ zaden per M₁ lijn in individuele putten van een 24-well weefsel kweekplaat en steriliseren met behulp van chloorgas (40 mL van 12% natriumhypochloriet en zoutzuur, 3:1, v/ v) in een desiccator voor 4 uur in een rookkap. Open na de procedure de desiccator en laat 's nachts chloorgas verdampen.
4. Breng na sterilisatie platen naar buiten en voeg vloeibare 1/2 MS-media (halfsterkte MS zonder agar) toe aan individuele putten. Verzegel de platen met parafilm en stratificeer de zaden gedurende 2-4 dagen bij 4 °C en verplaats zaden naar een groeikamer met 10 uur licht/ 14 uur donkere fotoperiode bij 20-22 °C met 70% relatieve vochtigheid.
5. Zodra de zaailingen zijn 8-12 dagen oud, plaats 12 M_{2 zaailing} van elke lijn individueel in een 96-well luminometer plaat. Voor het meten van Ca²⁺ respons op H₂O₂, gebruik een luminometer plaatlezer.
6. Voeg na zaailingoverdracht 150 μL 5-10 μM coelentrazineoplossing (verdund in autoclaved water uit een voorraad van 5 mM in methanol) (LET OP) toe in afzonderlijke putten in een donkere/weinig lichtruimte en bewaar deze in het donker bij 21 °C gedurende 8 uur.
   OPMERKING: Coelentrazine is een prothesegroep die zich bindt aan apo-aequorin en deze reconstrueert tot functioneel aequorin. Coelentrazine is lichtgevoelig en wordt dus opgeslagen in donkergekleurde flessen, beschermd tegen licht.
7. De volgende dag voert u mutantenscherm uit met 10 mM H₂O₂ als stimulus en meet u de daaropvolgende Ca²⁺ respons.
8. Voor gelijktijdige meting van 24 putten, maak een geautomatiseerd kinetisch programma dat de achtergrond meet voor 1 min, gevolgd door stimuli toevoeging (40 μL) en meting gedurende 10 min, gevolgd door totale aequorine ontlading (2 M CaCl₂ in 150 μL 20% ethanol) voor 1-2 min.
   OPMERKING: Een eindontlading voor het totale aequorin is nodig om de gemeten Ca²⁺ te kwantificeren en als extra controle voor functioneel aequorin. Het einde kwijting is een korte termijn van 1-2 min en veroorzaakt geen significante plantendood. Als alternatief, als de planten sterven na de ontlading stap, dan opnieuw scherm van de specifieke M₁ lijn en redding zonder ontlading. Dergelijke mutanten kunnen worden bevestigd in M₃ en M₄ generaties met behulp van de ontlading stap.
9. Gebruik een 24-well formaat scanmethode die elke rij meet in 7 s interval met 300 ms integratietijd per put per meetpunt. Gebruik een wild-type zaailing als controle in elke rij voor vergelijking en evaluatie van de mutant.
   OPMERKING: Een enkele 96 putplaat met M_{2 zaailingen} zal betrekking hebben op 8 individuele M₁ lijn (8 M₁* 12 = 96 M₂) en kan worden vertoond in 2,5 uur en elke dag 32 M₁ lijnen zou worden gescreend, 640 M₁ planten per maand. De hele screening procedure nadat de planten klaar zijn zou ongeveer 8 maanden duren.
10. Identificeer mutanten op basis van verlies van of verminderde Ca²⁺ respons met H₂O₂. Red de geselecteerde mutanten door middel van een op antibiotica gebaseerd wasproces. Was de zaailing twee keer met 25 mg/L cefotaxime-oplossing en breng vervolgens over naar het reddingsmedium dat 25 mg/L cefotaxime bevat in 1/2 MS agar.
11. Laat de platen groeien met een 10 uur licht/ 14 uur donkere fotoperiode om een gemuteerde plant te verkrijgen. De cefotaxime wash helpt om schadelijke micro-organismen op de zaailing te verwijderen. Aangezien de zaailingen na de reconstructie niet-verzegeld worden gehouden, minimaliseert u verontreiniging bij het overbrengen naar steriele toestand.
12. Breng de gemuteerde plant naar de bodem voor het verkrijgen van de homozygoot M₃ populatie.

3. Gegevensanalyse en identificatie van mutanten (1-3 maanden)

OPMERKING: De metingen van de bovenstaande methode zijn in relatieve lichteenheden (RLU).

1. Gebruik voor de berekening van de_{cytconcentratie} [Ca²⁺] de volgende concentratievergelijking²⁰.
   pCa = 0,332588(−log (L/L_max))+ 5,5593
   Luminescentie telt () en het totale resterende aantal_(max).
2. Converteer de verkregen pCa-waarden naar [Ca²⁺]_cytwaarden in μM door te vermenigvuldigen met 10⁶. Vervolgens grafisch plot tegen een aequorin (transgene Col-0 aequorin) controle voor het identificeren van vermeende H₂O₂ mutanten ca^{2 +} reactie.
3. Redding zaailingen met een verlies van of verminderde reactie op H₂O₂ applicatie gered.
4. Bij rijping, oogst zaden van de geredde mutant en opnieuw screenen op reactie op H₂O₂ in M_{3 zaailingen.} Als alle 12 M_{3 zaailingen} een Ca²⁺ respons vertonen vergelijkbaar met de moederplant, beschouw de populatie dan als een homozygoot M₃ mutant populatie. Als alle 12 zaailingen een dergelijke reactie niet vertonen, neem ze dan mee naar M_4-generatie en opnieuw te screenen om homozygoot populatie te verkrijgen.
5. Zodra een homozygoot plantenlijn is verkregen, identificeert u het gen dat leidt tot gewijzigd fenotype met behulp van de volgende generatie sequencing.

Resultaten

De EMS-populatie werd gescreend op H₂O₂ geïnduceerde Ca²⁺ hoogte. Zoals eerder besproken, 12 individuele M_{2 zaailingen} werden gescreend van elke M₁ lijn. In figuur 3wordt een dergelijke M_1-lijn uitgezet met elk paneel met 12 individuele M_{2 zaailingen.} Een wild-type aequorin wordt gebruikt als controle voor het vergelijken en evalueren van de mutant respons. Een recessieve mutant scheidt in de verhouding van 1:7 (mut...

Discussie

EMS mutagenesis is een krachtig hulpmiddel om mutaties in de bevolking te genereren. De klassieke voorwaartse genetische schermen met EMS zijn een effectief instrument geweest om nieuwe genen te identificeren om twee belangrijke redenen: ten eerste vereisen ze geen eerdere veronderstellingen over de genidentiteit en ten tweede introduceren ze geen vooringenomenheid. Er zijn verschillende methoden om een screening populaties zoals EMS, T-DNA inserties, straling etc. genereren. Van alle methoden heeft ems-gebaseerde mutage...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
24 well tissue culture plate	Jetbiofil	11024	voor het kweken van zaailingen
96 well white cliniplate	Thermo Scientific	9502887	voor luminometer metingen
Aequorin
Agropet	Lab Chem India		voor plantengroei
Calcium chloride	Fisher Scientific	12135	voor ontlaaddoplossing
Coelenterazine	PJK	55779-48-1	prothetische groep voor aequorin
Ehtylmethane sulfonate	Sigma Aldrich	M0880-5G	voor zaadmutagenese
Ethanol	Analytisch reagens	1170	voor ontlaaddoplossing
Zoutzuur	Merck Life Sciences	1.93001.0521	steriliseringsoplossing
Waterstofperoxide	Fisher Scientific	15465	als stimulus voor calciumverhoging
Luminoskan ascent	Thermo Scientific	5300172	aequorin luminescentiemeting
MES buffer	Himedia	RM1128-100G	plantengroei
Murashige en Skoog media	Himedia	PT021-25L	plantengroei
Natriumhydroxide	Fisher Scientific	27805	voor het neutraliseren van EMS
Natriumhypochloriet	Merck Life Sciences	1.93607.5021	steriliseringsoplossing
Natriumthiosulfaat	Fisher Scientific	28005	voor zaadwassing in stap 1.6
soilrite	Lab Chem India		voor plantengroei
Vierkante potten	Lab Chem India		voor plantengroei
Sucrose	Sigma Aldrich	S0389	plantengroei
Taxim	Alkem	7180720	voor zaailingredding