Een open source technologieplatform om op Hydrogel gebaseerde 3D-cultuurmodellen op een geautomatiseerde en gestandaardiseerde manier te produceren

Samenvatting

Dit protocol dient als een uitgebreide tutorial voor gestandaardiseerde en reproduceerbare menging van viskeuze materialen met een nieuwe open source automatiseringstechnologie. Gedetailleerde instructies worden gegeven over de werking van een nieuw ontwikkeld open source werkstation, het gebruik van een open source protocol designer, en de validatie en verificatie om reproduceerbare mengsels te identificeren.

Samenvatting

De huidige mengstappen van viskeuze materialen zijn afhankelijk van repetitieve en tijdrovende taken die voornamelijk handmatig worden uitgevoerd in een modus met lage doorvoer. Deze problemen vertegenwoordigen nadelen in workflows die uiteindelijk kunnen resulteren in onherleidbaarheid van onderzoeksresultaten. Handmatige workflows beperken de vooruitgang en wijdverspreide acceptatie van viskeuze materialen, zoals hydrogels die worden gebruikt voor biomedische toepassingen, verder. Deze uitdagingen kunnen worden overwonnen door geautomatiseerde workflows met gestandaardiseerde mengprocessen te gebruiken om de reproduceerbaarheid te vergroten. In deze studie presenteren we stapsgewijze instructies voor het gebruik van een open source protocolontwerper, voor het bedienen van een open source werkstation en voor het identificeren van reproduceerbare mengsels. In het bijzonder begeleidt de open source protocolontwerper de gebruiker door de experimentele parameterselectie en genereert een kant-en-klare protocolcode om het werkstation te bedienen. Dit werkstation is geoptimaliseerd voor het pipetteren van viskeuze materialen om geautomatiseerde en zeer betrouwbare verwerking mogelijk te maken door de integratie van temperatuurdocks voor thermoresponsieve materialen, pipetten met positieve verplaatsing voor viskeuze materialen en een optioneel tip touch dock om overtollig materiaal uit de pipetpunt te verwijderen. De validatie en verificatie van mengsels worden uitgevoerd door een snelle en goedkope absorptiemeting van Orange G. Dit protocol presenteert resultaten voor het verkrijgen van 80% (v/v) glycerolmengsels, een verdunningsreeks voor gelatinemethacryloyl (GelMA) en dubbelnetwerkhydrogels van 5% (w/v) GelMA en 2% (w/v) alginaat. Er is een handleiding voor probleemoplossing opgenomen om gebruikers te ondersteunen bij het aannemen van protocollen. De beschreven workflow kan breed worden toegepast op een aantal viskeuze materialen om op een geautomatiseerde manier door de gebruiker gedefinieerde concentraties te genereren.

Inleiding

Reproduceerbaarheid en reproduceerbaarheid zijn van het grootste belang in wetenschappelijk werk1,2,3,4. Recent bewijs heeft echter aanzienlijke uitdagingen aangetoond bij het herhalen van biomedische studies met een hoge impact in de fundamentele wetenschap en translationeel onderzoek4,5,6,7. Factoren die bijdragen tot onherleidbare resultaten zijn complex en veelzijdig, zoals een slechte of bevooroordeelde ^{onderzoeksopzet6,8}, onvoldoende statistische ^kracht3,9, ontbrekende naleving van rapportagestandaarden7,10,11, druk om te ^publiceren6 of niet-beschikbare methoden of ^{softwarecode6,9} . Onder hen zijn subtiele veranderingen in het protocol en menselijke fouten bij de uitvoering van experimenten geïdentificeerd als verdere elementen die verantwoordelijk zijn voor onreproduceerbaarheid4. Handmatig pipetteren leidt bijvoorbeeld tot intra- en interindividuele onnauwkeurigheid12,13 en vergroot de kans op menselijke ^fouten14. Hoewel commerciële vloeistofbehandelingsrobots in staat zijn om deze nadelen te overwinnen en een verhoogde betrouwbaarheid voor vloeistoffen hebben aangetoond15,16,17, is geautomatiseerde verwerking van materialen met aanzienlijke viskeuze eigenschappen nog steeds een uitdaging.

Commerciële vloeistofbehandelingsrobots gebruiken vaak luchtkussenpipetjes, ook bekend als luchtzuiger- of luchtverplaatsingsp pipetten. Het reagens en de zuiger worden gescheiden door een luchtkussen dat krimpt tijdens doseerstappen en uitzet tijdens aanzuigende stappen. Met behulp van luchtkussenpipets 'stromen' viskeuze materialen slechts langzaam in en uit de punt, en vroege terugtrekking van de pipet uit het reservoir kan resulteren in het aspiratie van luchtbellen. Tijdens doseerwerkzaamheden laat het stroperige materiaal een film achter op de binnenste tipwand die slechts langzaam of helemaal niet 'stroomt' wanneer het door lucht wordt geforceerd. Om deze problemen op te lossen, werden verdringerpipetten commercieel geïntroduceerd om het viskeuze materiaal actief uit de punt te extruderen met behulp van een stevige zuiger. Hoewel deze verdringerpipeten een nauwkeurige en betrouwbare verwerking van viskeuze materialen mogelijk maken, zijn geautomatiseerde oplossingen met verdringerpipeten nog steeds te duur voor academische laboratoriumomgevingen, en daarom zijn de meeste workflows met viskeuze materialen uitsluitend afhankelijk van handmatige pipetteertaken18.

In het algemeen wordt viscositeit gedefinieerd als de weerstand van een vloeistof tegen stroming, en viskeuze materialen worden verder gedefinieerd als materialen met een grotere viscositeit van water (0,89 mPa·s s bij 25 °C). Op het gebied van biomedische toepassingen bevatten experimentele opstellingen vaak meerdere materialen met een grotere viscositeit dan water, zoals dimethylsulfoxide (DMSO; 1,99 mPa·s bij 25 °C), glycerol (208,1 mPa·s bij 25 °C voor 90% glycerol [v/v]), Triton X-100 (240 mPa·s bij 25 °C) en watergezwollen polymeren, hydrogels ^{genoemd19, 20}. Hydrogels zijn hydrofiele polymeernetwerken die zijn gerangschikt in een fysische en / en chemische modus die wordt gebruikt voor verschillende toepassingen, waaronder celinkapseling, medicijnafgifte en zachte actuatoren19,20,21,22. De viscositeit van hydrogels is afhankelijk van de polymeerconcentratie en het ^{molecuulgewicht19}. Routinematig gebruikte hydrogels voor biomedische toepassingen vertonen viscositeitswaarden tussen 1 en 1000 mPa·s, terwijl specifieke hydrogelsystemen zijn gerapporteerd met waarden tot 6 x ¹⁰⁷ mPa·s19,23,24. Viscositeitsmetingen van hydrogels zijn echter niet gestandaardiseerd in termen van meetprotocol en monstervoorbereiding, en daarom zijn viscositeitswaarden tussen verschillende onderzoeken moeilijk te vergelijken.

Aangezien commercieel beschikbare geautomatiseerde oplossingen die speciaal zijn ontworpen voor hydrogels ontbreken of te duur zijn, zijn de huidige workflows voor hydrogel afhankelijk van handmatige ^hantering18. Om de beperkingen van de huidige handmatige workflow voor het pipetteren van hydrogels te begrijpen, is het belangrijk om essentiële verwerkingstaken te ^begrijpen18. Zodra bijvoorbeeld een nieuw hydrogelmateriaal is gesynthetiseerd, wordt een gewenste concentratie of een verdunningsreeks met verschillende concentraties gegenereerd om betrouwbare syntheseprotocollen en verknoopkingskenmerken te identificeren met daaropvolgende analyse van de mechanische eigenschappen25,26,27,28 . Over het algemeen wordt een stamoplossing bereid of gekocht en vervolgens gemengd met een verdunningsmiddel en/of andere reagentia om een mengsel te verkrijgen. De mengtaken worden meestal niet direct in een putplaat (of een ander uitvoerformaat) uitgevoerd en worden eerder uitgevoerd in een afzonderlijke reactiebuis, die gewoonlijk mastermix wordt genoemd. Tijdens deze bereidingstaken zijn verschillende aanzuig- en doseerstappen nodig om het viskeuze materiaal (en) over te brengen, de reagentia te mengen en het mengsel over te brengen naar een uitvoerformaat (bijvoorbeeld een 96-putplaat). Deze taken vereisen een grote hoeveelheid menselijke ^arbeid18, lange experimentele uren en vergroten de kans op menselijke fouten die zich mogelijk kunnen manifesteren als onnauwkeurige resultaten. Bovendien voorkomt handmatige hantering een efficiënte voorbereiding van hoge monsteraantallen om verschillende parametercombinaties te screenen voor gedetailleerde karakterisering. De handmatige verwerking belemmert ook het gebruik van hydrogels voor screeningstoepassingen met een hoge doorvoer, zoals de identificatie van veelbelovende verbindingen tijdens de ontwikkeling van geneesmiddelen. De huidige handmatige voorbereidingsstappen zijn niet haalbaar om drugsbibliotheken bestaande uit duizenden drugs te screenen. Om deze redenen zijn geautomatiseerde oplossingen nodig om een efficiënt ontwikkelingsproces te bieden en de succesvolle vertaling van hydrogels voor screeningstoepassingen voor geneesmiddelen mogelijk te maken.

Om over te stappen van handmatige workflows naar geautomatiseerde processen, hebben we een commerciële open source pipetteerrobot geoptimaliseerd voor de behandeling van viskeuze materialen door de integratie van temperatuurdocks voor thermoresponsieve materialen, het gebruik van kant-en-klare verdringerpipeten met capillaire zuigertips en een optioneel tip touch dock voor pipetpuntreiniging. Deze pipetteerrobot is verder geïntegreerd als pipetteermodule in een nieuw ontwikkeld open source werkstation, dat bestaat uit kant-en-klare en aanpasbare ^modules18,29. Gedetailleerde montage-instructies voor het ontwikkelde werkstation inclusief hardware- en softwarebestanden zijn vrij toegankelijk vanuit de GitHub (https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation) en de Zenodo-repository (https://doi.org/10.5281/zenodo.3612757). Naast de hardwareontwikkeling is een open source protocol ontwerp applicatie geprogrammeerd en vrijgegeven om de gebruiker door het parameterselectieproces te leiden en een kant-en-klare protocolcode (https://github.com/SebastianEggert/ProtocolDesignApp) te genereren. Deze code draait zowel op de commerciële open source pipetteerrobot als op het ontwikkelde open source werkstation.

Hierin wordt een uitgebreide tutorial gegeven over de werking van het open source werkstation om mengtaken voor viskeuze materialen te automatiseren (figuur 1). De tutorial-specifieke protocolstappen kunnen worden uitgevoerd met het ontwikkelde open source werkstation en de commerciële open source pipetteerrobot. Ondersteund door een in eigen huis ontwikkelde open source protocol ontwerp applicatie, wordt geautomatiseerd mengen en bereiden van vereiste concentraties voor glycerol, gelatine methacryloyl (GelMA) en alginaat gedemonstreerd. Glycerol is geselecteerd in deze tutorial, omdat het goed wordt ^{gekenmerkt30,31}, het is goedkoop en direct beschikbaar, en daarom wordt het vaak gebruikt als viskeus referentiemateriaal voor geautomatiseerde pipettertaken. Als voorbeelden voor hydrogels die in biomedische toepassingen worden gebruikt, zijn GelMA- en alginaathydrogelvoorloperoplossingen toegepast voor geautomatiseerde mengexperimenten. GelMA presenteert een van de meest gebruikte hydrogels voor celinkapselingsstudies32,33, en alginaat werd in deze studie geselecteerd om het vermogen aan te tonen om hydrogels met dubbele netwerken te ^{produceren34,35}. Met Orange G als kleurstof werd een snelle en goedkope procedure geïmplementeerd om de mengresultaten te valideren en te verifiëren met een ^{spectrofotometer16}.

Een commerciële open source pipetteerrobot is als pipetteermodule geïntegreerd in het ontwikkelde open source werkstation (figuur 2a), en daarom wordt de naam 'pipetteermodule' verder gebruikt om de pipetteerrobot te beschrijven. Een gedetailleerde beschrijving van de geïnstalleerde hardware valt buiten het bereik van dit protocol en is beschikbaar via de meegeleverde repositories die ook stapsgewijze instructies bevatten voor de algemene assemblage van het open source-platform. De pipetteermodule kan worden uitgerust met twee pipetten (een- of 8-kanaals pipet) die worden geïnstalleerd op as A (rechts) en as B (links) (figuur 2b). De pipetteermodule biedt een capaciteit van 10 dekken volgens de normen van het American National Standards Institute / Society for Laboratory Automation and Screening (ANSI / SLAS) en de volgende locatieposities zijn gedefinieerd op het dek: A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2, E1, E2 (figuur 2c). Om foto-geïnduceerde polymerisatie van hydrogeloplossingen te initiëren, is een afzonderlijke crosslinkermodule vereist die aan het werkstation is toegevoegd. De crosslinkermodule is uitgerust met LED's met een golflengte van 400 nm en daarom kunnen stoffen die exciteren bij een zichtbare lichtgolflengte worden gebruikt met de huidige systemen, zoals lithiumfenyl-2,4,6 trimethylbenzoylfosfinaat (LAP)^36,37. De intensiteit (in mW/^cm2) van de LED's kan door de gebruiker worden aangepakt in de protocolontwerptoepassing om het crosslinkinggedrag te ^bestuderen38. Het werkstation bevat ook een opslagmodule om studies met verhoogde doorvoer mogelijk te maken; deze module wordt echter niet gebruikt binnen dit onderzoek en daarom niet verder beschreven. Over het algemeen wordt aanbevolen om de pipetteermodule in een biologische veiligheidskast te gebruiken om verontreiniging van het monster te voorkomen. Het hoofdstroomcircuit om de pipetteermodule te bedienen is een 12 V-circuit, dat in de meeste landen als een laagspanningstoepassing wordt beschouwd. Alle elektrische componenten zijn gebaseerd op een speciale besturingskast die voorkomt dat gebruikers in contact komen met de bron van een elektrisch gevaar.

Door deze gestandaardiseerde mengprotocollen te volgen, zijn onderzoekers in staat om op een geautomatiseerde manier betrouwbare mengsels voor zowel viskeuze als niet-viskeuze materialen te bereiken. De open source-aanpak stelt gebruikers in staat om mengsequenties te optimaliseren en nieuw ontwikkelde protocollen met de gemeenschap te delen. Uiteindelijk zal deze aanpak de screening van meerdere parametercombinaties vergemakkelijken om de onderlinge afhankelijkheden tussen verschillende factoren te onderzoeken en daardoor de betrouwbare toepassing en ontwikkeling van viskeuze materialen voor biomedische toepassingen te versnellen.

Protocol

OPMERKING: Het protocol begint met een inleiding tot (1) de software en (2) de hardware-instellingen om de gebruiker vertrouwd te maken met de vereiste installaties en het werkstation. Na een paragraaf over (3) materiaalvoorbereiding en (4) het gebruik van de protocolontwerperstoepassing, (5) de kalibratie van de pipetteermodule en (6) de uitvoering van het geautomatiseerde protocol wordt in detail belicht. Ten slotte worden (7) validatie- en verificatieprocedures beschreven, waaronder absorptiemeting en gegevensanalyse. Een algemene protocolworkflow met afzonderlijke taken wordt weergegeven in figuur 1.

1. Software instellen

OPMERKING: Deze sectie bevat een gedetailleerde instructie voor het installeren van de API (Application Programming Interface), de vereiste protocolontwerperstoepassing en de kalibratieterminal. De volgende instructies zijn geschreven voor een Raspberry Pi (RPi) single-board computer; echter ook Windows 8, 10 en macOS 10.13+ zijn met succes gebruikt met de API en de applicaties.

1. Stel de computeromgeving in.
   OPMERKING: Wees bekend met de basisprincipes van ^Python39, hoe u een Raspberry ^Pi40,41 instelt en gebruikt en hoe u verbinding maakt met ^internet42. De volgende zelfstudiestappen richten zich op protocolspecifieke stappen en aanvullende informatie over het gebruik van een Raspberry Pi is online ^{beschikbaar40}.
   1. Open een terminalvenster vanuit de taakbalk of het toepassingsmenu.
   2. Werk de pakketlijst van het systeem bij:
      sudo apt-get update
   3. Upgrade alle geïnstalleerde pakketten:
      sudo apt-get dist-upgrade
   4. Start de Raspberry Pi opnieuw op:
      sudo opnieuw opstarten
   5. Controleer de geïnstalleerde Python-versie:
      python3 --versie
      Zorg ervoor dat ten minste Python 3.5 is geïnstalleerd; zo niet, installeer dan de nieuwste ^versie43.
   6. Installeer python pip, dat Python-pakketten publiceert met het Python-pakket ^Index44:
      sudo apt-get installeren python3-pip
   7. Afhankelijkheden installeren:
      pip installeren numpy
      pip installeren python-resize-image
      OPMERKING: Als u Windows gebruikt, moet u het windows-curses-pakket installeren via: python -m pip install windows-curses
2. Installeer de API (Application Programming Interface).
   OPMERKING: De API biedt een eenvoudig Python-framework dat is ontworpen om experimentele protocollen te schrijven en het werkstation te bedienen. De volgende twee API's zijn vereist om de gegenereerde protocolcode met succes uit te voeren.
   1. Werkstation-API installeren:
      pip installeer opengewerkte
   2. Installeer Opentrons API om de pipetteermodule te bedienen:
      pip installeer opentrons==2.5.2
   3. Controleer of de API is geïnstalleerd:
      Python3
      >>> import openwerkstation
      >>> opentrons importeren
      OPMERKING: De grootte van de API en de protocolontwerptoepassing is respectievelijk 2,2 MB en 1,2 MB. Er zijn geen problemen opgetreden tijdens de installatie bij gebruik met beperkte schijfruimte (200 MB). De schijfruimtevereisten zijn echter afhankelijk van het besturingssysteem.
3. Selecteer een map om bestanden te downloaden (kalibratieterminal, protocolontwerptoepassing, enz.).
   OPMERKING: Bestanden kunnen achteraf elders worden gekopieerd en geplakt.
4. Kloonbestanden uit github repository:
   git kloon https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation
   OPMERKING: Het commando 'git clone' kloont en slaat vervolgens alle bestanden op in de map, die op dit moment in de terminal is geopend. Aangezien de repository ook de hardwarebestanden voor de assembly bevat, is niet de volledige repository vereist om de gepresenteerde protocollen uit te voeren. Alle vereiste bestanden om de experimenten te repliceren zijn beschikbaar als aanvullend bestand en in de GitHub-repository onder "/examples/publication-JoVE".
5. Open de gedownloade map. Als de volledige repository is gedownload, navigeert u naar de map 'publication-JoVE' via
   cd openworkstation/voorbeelden/publicatie-JoVE
   OPMERKING: Deze map bevat bestanden die nodig zijn voor de werking van het werkstation en het gebruik van de protocolontwerperstoepassing en de kalibratieterminal.

2. Hardware instellen

1. Plaats de werkplek in een biologische veiligheidskast om besmetting van het monster te voorkomen.
2. Installeer pipetten op het werkstation.
   1. Selecteer de pipetgrootte op basis van de experimentele opstelling. Neem over het algemeen een pipetgrootte waarvan het aan te leggen volume aan de bovenkant van het bereik ligt. Als mengtaken met volumes groter dan 1 ml vereist zijn voor een specifieke opstelling (bijv. aspirateren/doseren van 2 ml), kiest u de M1000E met een maximaal aanzuig-/doseervolume van 1.000 μL om pipetteerstappen te minimaliseren en tijd te besparen.
      OPMERKING: Een gedetailleerde instructie voor luchtverplaatsingsp pipetten is online ^{beschikbaar45}. De ontwikkelde pipetteermodule kan de volgende kant-en-klare verdringerpipeten integreren: M10E (1-10 μL), M25E (3-25 μL), M50E (20-50 μL), M100E (10-100 μL), M250E (50-250 μL), M1000E (100-1.000 μL).
   2. Gebruik een M4 inbussleutel om schroeven los te draaien en vast te draaien.
   3. Bevestig de twee pipetbevestigingsplaten (witte acrylplaten) aan de aluminium rail en draai de M5-schroeven losjes vast.
   4. Plaats de pipet in de twee pipetbevestigingsplaten en zorg ervoor dat de ergonomische staart van de pipet aan de andere kant van de acryl montageplaat rust.
   5. Draai de vier schroeven van de twee pipetbevestigingsplaten stevig vast.
   6. Schuif de twee vierkante bevestigingsmoeren, die aan de acryl montageplaat zijn bevestigd, in de extrusiesleuf van de z-as en draai de schroeven aan.
      OPMERKING: Bevestig de pipet stevig om beweging tijdens het gebruik te voorkomen.

3. Materiaalvoorbereiding

OPMERKING: De viskeuze materialen (glycerol, GelMA, alginaat) worden gebruikt voor de experimenten die in deze studie worden gepresenteerd, en daarom zijn voorbereide volumes en verwerkingstaken (bijv. Voeg 5 ml stockoplossing toe in 5 ml reactiebuizen) specifiek voor deze experimentele opstelling.

1. Gelatine methacryloyl (GelMA)
   OPMERKING: GelMA-functionalisatie, dialyse en lyofilisatie zijn niet het toepassingsgebied van dit artikel en een stapsgewijs protocol is beschikbaar in Loessner et ^al.33. Het protocol begint met het gebruik van gelmagelyofiliseerd, dat intern kan worden bereid of commercieel kan worden gekocht.
   1. Bereken de vereiste massa GelMA (_mGelMA) op basis van de gewenste eindvoorraadconcentratie (_cGelMA) en volume (_VGelMA) met behulp van de vergelijking:
      _mGelMA = _cGelMA x _VGelMA
      OPMERKING: VGelMA is afhankelijk van de experimentele opstelling en het wordt aanbevolen om 20−30% overtollig materiaal te bereiden. De gepresenteerde protocollen beginnen met 5 ml van 20% (w / v) GelMA als een standaardoplossing.
   2. Weeg de vereiste hoeveelheid gelma met gelyofiliseerd af, voeg deze toe aan een reactiebuis van 50 ml en voeg de vereiste hoeveelheid fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) toe.
   3. Meng GelMA door het 's nachts in het oplosmiddel bij 4 °C te weken of door gedurende 6 uur in een waterbad tot 60 °C te verwarmen.
      OPMERKING: Steriele GelMA-oplossingen kunnen gedurende ten minste zes maanden beschermd tegen licht bij 4 °C worden bewaard.
   4. Vul 5 ml GelMA in reactiebuizen van 5 ml.
2. Foto-initiator: Lithiumfenyl-2,4,6-trimethylbenzoylfosfinaat (LAP)
   OPMERKING: Vermijd extra blootstelling aan ruimtelicht, omdat LAP lichtgevoelig is.
   1. Bereken de vereiste massa van LAP (_mLAP) op basis van de gewenste eindvoorraadconcentratie (_cLAP) en het vereiste volume (_VLAP) met behulp van de vergelijking:
      _{mLAP = klap x VLAP}
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een 3% (w / v) stockoplossing te bereiden.
   2. Weeg de vereiste hoeveelheid LAP, voeg deze toe in een reactiebuis van 15 ml en voeg PBS toe.
   3. Wikkel de buis in aluminiumfolie om foto-geïnduceerde ontbinding te voorkomen.
   4. Los LAP op door de reactiebuis gedurende 2 uur in een waterbad bij 37 °C te plaatsen of totdat deze volledig is opgelost.
   5. Vul 1 ml LAP-stamoplossing in buizen van 5 ml.
3. Alginaat
   1. Bereken de benodigde hoeveelheid alginaat (_malginaat) op basis van de gewenste eindvoorraadconcentratie (_calginaat) en volume (_Valginaat) met behulp van de vergelijking:
      _malginaat = _calginaat x _Valginaat
      OPMERKING: Valginaat is afhankelijk van de experimentele opstelling en het wordt aanbevolen om 20−30% overtollig materiaal te bereiden. De gepresenteerde protocollen beginnen met 5 ml van 4% (w / v) alginaat als een standaardoplossing.
   2. Weeg de vereiste massa alginaat, voeg het toe aan een reactiebuis van 50 ml en voeg PBS toe.
   3. Plaats het alginaatmengsel gedurende 4 uur in een waterbad bij 37 °C.
      OPMERKING: Het gebruik van een vortexmenger zal het oplossingsproces versnellen, maar ook luchtbellen genereren. Opgelost alginaat kan gedurende ten minste zes maanden bij 4 °C worden bewaard.
   4. Vul 5 ml alginaat in reactiebuizen van 5 ml.
4. Vul 5 ml glycerol in reactiebuizen van 5 ml.
5. Orange G oplossing
   1. Bereid een 10 mg / ml bouillonoplossing van Orange G in een reactiebuis van 50 ml.
      OPMERKING: Het volume is afhankelijk van het aantal experimenten. Afhankelijk van het type verdunningsmiddel, bereidt u de stamoplossing in ultrapuur water, PBS of een geschikt verdunningsmiddel. In de gepresenteerde experimenten werd ultrapuur water gebruikt voor het verdunnen van glycerol en PBS voor het verdunnen van GelMA en alginaat. PBS werd gebruikt als verdunningsmiddel voor GelMA en alginaat en kan worden bereid met tabletten of kant-en-klaar worden gekocht.
   2. Meng gedurende 10 s door vortexing.
   3. Wikkel de buis in aluminiumfolie om foto-geïnduceerde ontbinding te voorkomen.
      OPMERKING: Stockoplossing kan na 24 uur worden gebruikt om een goede oplossing van Orange G te garanderen.
   4. Verdun de stamoplossing tot een werkoplossing van 1 mg/ml in een reactiebuis van 50 ml.
   5. Breng de werkoplossing over op geschikte kolven/buizen voor de experimentele opstelling.
      OPMERKING: Voor de gepresenteerde experimenten werd de werkoplossing gevuld in buizen van 5 ml. Orange G-voorraad en werkoplossing kunnen bij 4 °C worden bewaard en binnen drie maanden na bereiding worden gebruikt.
   6. Vul 5 ml van de 1 mg/ml Orange G-werkoplossing in reactiebuizen van 5 ml.

4. Genereer protocolcode met de protocolontwerperstoepassing

OPMERKING: De gespecificeerde parameters in stap 4.2−4.7 zijn voor alle uitgevoerde experimenten hetzelfde, behalve voor de voorraadconcentratie van het materiaal en de uiteindelijke outputconcentratie. Deze parameters zijn samengevat in tabel 1 en in het volgende worden parameters gebruikt om hydrogels met dubbele netwerk te bereiden met 5% (w / v) GelMA, 2% (w / v) alginaat, 0,15% (w / v) LAP en PBS als verdunningsmiddel.

1. Open de protocol designer applicatie door 'ProtocolDesignApp.html' uit te voeren.
   OPMERKING: De app "ProtocolDesignApp.html" begeleidt de gebruiker door het parameterselectieproces en genereert automatisch het kant-en-klare protocol om het werkstation te bedienen. De gebruikersinterface draait op elke veelgebruikte internetbrowser (d.w.z. Chrome, Firefox, Safari, edge, Internet Explorer).
2. Voer de protocolnaam in (bijvoorbeeld dubbele netwerk-hydrogels) op de opstartpagina.
3. Klik op 'Doorgaan' om de naam van het protocol te bevestigen en ga verder met de volgende stap.
4. Definieer de invoerlade door '3x4 Heating Block' te selecteren in het vervolgkeuzemenu en de volgende invoerparameters:
   1. Selecteer 'Gel 1' in het vervolgkeuzemenu, voer de naam 'GelMA' in, voer voorraadconcentratie '20%' in, stel 'Aantal monsters' in op '3' om één kolom te vullen. Klik op '+toevoegen' om vermeldingen op te slaan.
   2. Selecteer 'Gel 2' in het vervolgkeuzemenu, voer de naam in: 'Alginaat', voer voorraadconcentratie '4%' in, stel 'Aantal monsters' in op '3' om één kolom te vullen. Klik op '+toevoegen' om vermeldingen op te slaan.
   3. Selecteer 'Photoinitiator' in het vervolgkeuzemenu, voer de naam in: 'LAP', voer voorraadconcentratie '3%' in, stel 'Aantal monsters' in op '3' om één kolom te vullen. Klik op '+toevoegen' om vermeldingen op te slaan.
   4. Selecteer 'Verdunningsmiddel 1' in het vervolgkeuzemenu, voer de naam in: 'PBS', stel 'Aantal monsters' in op '3' om één kolom te vullen. Klik op '+toevoegen' om vermeldingen op te slaan.
      OPMERKING: De visualisatie van de invoerlade wordt automatisch bijgewerkt zodra op '+toevoegen' wordt geklikt. Als er meer ingangen worden toegevoegd dan de capaciteit van de lade, wordt de waarschuwing 'Te veel monsters voor deze lade' aan de gebruiker getoond.
5. Definieer crosslinking-parameters door 'Photo crosslinking' aan te vinken en de tijd in seconden, '30' en de intensiteit W/^m2 met '2' te typen.
6. Voltooi de invoerconfiguratie door op 'DOORGAAN' te klikken.
7. Definieer de instelling van de uitvoerlade door '96 well plate' te selecteren in het vervolgkeuzemenu voor het type putplaat.
8. Klik op 'Groep1' om uitvoer te definiëren door een groep voorbeelden te maken.
   1. Specificeer de uitgangssamenstelling door de gewenste concentraties en het monstervolume in te voeren in de velden voor elke ingang: GelMA = '5', Alginaat = '2', LAP = '0,15', Totaal volume = '60'.
   2. Schakel het selectievakje in om een geavanceerd mengprotocol toe te passen.
9. Specificeer het aantal monsters door het aantal monsters in te voeren in het veld "Aantal monsters": "96".
   OPMERKING: De visualisatie van de voorbeeldlade wordt automatisch bijgewerkt zodra op '+groep toevoegen' wordt geklikt. Als er meer monsters worden toegevoegd dan de capaciteit van de lade, wordt de waarschuwing 'Te veel monsters voor deze lade' aan de gebruiker getoond.
10. Voltooi de uitvoerconfiguratie door op 'DOORGAAN' te klikken.
    1. Selecteer de ladepositie op de dekindeling en bereid het platform dienovereenkomstig voor:
    2. Vink het vinkje aan in het veld 'SLOT A1' en selecteer 'Empty_Cell' in het vervolgkeuzemenu.
    3. Vink het vinkje aan in het veld 'SLOT A2' en selecteer 'Trash_Cell' in het vervolgkeuzemenu.
    4. Vink het vinkje aan in het veld 'SLOT B1' en selecteer 'Tips_Cell_100 μL' in het vervolgkeuzemenu.
    5. Vink het vinkje aan in het veld 'SLOT B2' en selecteer 'Tips_Cell_1000 μL' in het vervolgkeuzemenu.
    6. Vink het vinkje aan in het veld 'SLOT C1' en selecteer 'Input_Cell' in het vervolgkeuzemenu.
    7. Vink het vinkje aan in het veld 'SLOT C2' en selecteer 'Empty_Cell' in het vervolgkeuzemenu.
    8. Vink het vinkje aan in het veld 'SLOT D1' en selecteer 'Mixing_Cell' in het vervolgkeuzemenu.
    9. Vink het vinkje aan in het veld 'SLOT D2' en selecteer 'Output_Cell' in het vervolgkeuzemenu.
    10. Definieer het type en de kenmerken van de eerste pipet (M100E) door 'Pipet Left' aan te vinken, '10-100μL positieve verplaatsing' te selecteren in het vervolgkeuzemenu en de aanzuigsnelheid in te stellen = '600', doseersnelheid = '800'.
    11. Definieer het type en de kenmerken van de tweede pipet (M1000E) door 'Pipet right' aan te vinken, '100-1000μL positieve verplaatsing' te selecteren in het vervolgkeuzemenu en de aanzuigsnelheid in te stellen = '800', doseersnelheid = '1200'.
11. Klik op 'GENERATE PROTOCOL' om de installatie te bevestigen en het protocolscript te genereren.
    OPMERKING: De ontwikkelde protocolontwerper-app genereert automatisch een nieuwe map wanneer een nieuw protocol wordt gegenereerd. Alle bestanden die nodig zijn voor dit experiment en om het werkstation te bedienen, worden opgeslagen in deze map die is vernoemd naar de protocolnaam. De map kan zonder problemen naar verschillende mappen worden gekopieerd.
12. Sluit de interface niet, omdat deze wordt gebruikt om het protocol uit te voeren (zie stap 6.6.).

5. Kalibratie van de pipetteermodule

OPMERKING: Containers (bijv. putplaten, tiprek, afval) en pipetten (bijv. M1000E) moeten in eerste instantie worden gekalibreerd. Als een container en/of een pipetpositie worden gewijzigd/gewijzigd, moet de nieuwe positie worden gekalibreerd.

1. Navigeer naar de protocolmap en open de kalibratieterminal door het bestand 'calibrate.py' in een terminalwindox uit te voeren (zie stap 1.1.1):
   phython.calibrate.py
   OPMERKING: De 'calibrate.py'-interface leidt de gebruiker door de kalibratie van de dekopstelling en pipetten. Zorg ervoor dat het bestand zich in dezelfde map bevindt als het protocolbestand en de modulebestanden. Het wordt automatisch gegenereerd in stap 4.10.
2. Selecteer bewegingsstappen voor de beweging van de plunjerx, y, z met het numerieke toetsenblok (1−8): '1' voor 0,1 mm, '2' voor 0,5 mm, '3' voor 1 mm, '4' voor 5 mm, '5' voor 10, '6' voor 20 mm, '7' voor 40 mm en '8' voor 80 mm.
3. Kalibreer de pipet.
   1. Druk op sneltoets P om de pipetgrootte te selecteren.
   2. Druk op sneltoets V om de zuigerkalibratiemodus te openen.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om te beginnen met kleine stappen (2, 5 en 10 mm) om vertrouwd te raken met de instapgrootte en bewegingsactie van de pipetkop.
   3. Kalibreer de volgende zuigerposities voor een verdringerpipet: T–Top = rustpositie; B–Bottom = plunjer wordt ingedrukt totdat de weerstand is bereikt; P–Pick-up = plunjer wordt in een positie geduwd waar een zuigerpunt kan worden bevestigd; E–Eject = plunjer wordt ingedrukt totdat een bevestigde punt wordt uitgeworpen. Varieer de zuigerposities met de pijlen naar boven en naar beneden op het toetsenbord en sla de eindpositie op met S op het toetsenbord.
   4. Verlaat de pipetzuigerkalibratiemodus door op sneltoets V te drukken.
4. Kalibreer de positie van de container ten opzichte van de pipetpunt.
   1. Druk op sneltoets P om het pipettype te selecteren. Zorg ervoor dat er een punt is aangesloten op de geselecteerde pipette.
   2. Druk op sneltoets C om het containertype te selecteren.
   3. Selecteer een geschikte bewegingsverhoging en verplaats de pipetpunt naar de volgende posities. Voor putplaten kalibreer je de 'A1'-putpositie aan de onderkant; Kalibreer voor het tiprek naar de positie 'A1'; Kies voor afval een positie (gedefinieerd als een punt) waar de punt in de prullenbak kan worden gegooid.
   4. Druk op sneltoets S om de positie op te slaan.
   5. Herhaal stap 5.3.1−5.3.3 voor alle containers die onder 'C' worden vermeld voor het geselecteerde pipettype.
   6. Herhaal 5.3.1−5.3.5 voor het tweede pipettype.
   7. Sluit het kalibratiescript.

6. Protocoluitvoering met het werkstation

OPMERKING: Protocolbestanden zijn toegankelijk via de repository en zijn ook beschikbaar als aanvullend bestand.

1. Plaats de afvalcontainer, tiprekken, invoerlade, menglade en uitvoer op het dek (gedefinieerd in stap 4.3).
2. Pipetten en instrumenten kalibreren zoals gedefinieerd in punt 5.
3. Schakel indien nodig het temperatuurdock IN en selecteer de temperatuur voor invoer- en menglade.
   OPMERKING: De experimenten in deze tutorial werden uitgevoerd zonder temperatuurregeling en bij 40 °C voor glycerol en 37 °C voor GelMA en pipetteren van alginaat.
4. Plaats buizen met ingangsreagentia in de aluminium blokken op de temperatuurdocks volgens de geselecteerde opstelling.
5. Wacht tot de invoerreagentia de gewenste temperatuur hebben bereikt.
   OPMERKING: Om een goede temperatuurverdeling te garanderen, wordt een incubatietijd van 30 minuten aanbevolen voor GelMA en alginaat.
6. Voer het protocolbestand uit door op 'RUN PYTHON SCRIPT' te klikken
   OPMERKING: Het geselecteerde protocol wordt nu uitgevoerd door het werkstation. De bijbehorende video belicht het geautomatiseerd mengen van GelMA en de verdeling van 60 μL in een 96 putplaat.
7. Uitvoeren is voltooid wanneer 'Voltooid' wordt weergegeven.

7. Validatie- en verificatieproces

1. Verwijder de putplaat van het werkstation en transporteer de putplaat met de monsters naar een spectrofotometer.
2. Lees de absorptie af met een spectrofotometer bij 450 nm. Lees elke plaat 2x om de resultaten te vergelijken en consistente resultaten te garanderen.
3. Absorbeer absorptiemetingen en sla ze op.
4. Data-analyse.
   OPMERKING: Experimentele gegevens kunnen afzonderlijk worden verwerkt of worden gekopieerd en in de meegeleverde sjabloon worden geplakt om het gemiddelde, de standaarddeviatie en de coëfficiënt van variantie (CV) te evalueren met behulp van spreadsheetsoftware.
   1. Open het Aanvullende Bestand 'supplementary_template-analyse.xlsx", dat ook beschikbaar is binnen de GitHub repository onder 'openworkstation/examples/publication-JoVE.
   2. Kopieer absorptiemetingen naar het blad 'ruwe gegevens', zorg ervoor dat alle celverwijzingen correct zijn gedefinieerd in alle tabellen en klik op het tabblad 'analyse' voor informatie over de gemiddelde, standaardafwijking en coëfficiënt van variantie (CV) waarden.
      OPMERKING: Afhankelijk van de monsterverdeling op een putplaat zijn de volgende vooraf ingestelde evaluatietypen beschikbaar bij de sjabloon: het type 'Uniform' wordt gebruikt wanneer alle monsters dezelfde samenstelling hebben, het type 'Per rij' wordt gebruikt wanneer monsters in verschillende rijen verschillende samenstellingen hebben, het type 'Per kolom' wordt gebruikt wanneer monsters in verschillende kolommen verschillende samenstellingen hebben, en het type 'Aangepast' wordt gebruikt wanneer de voorbeeldposities gebruikersspecifiek zijn.

Resultaten

Deze tutorial presenteert resultaten voor experimenten met glycerol (figuur 3) en GelMA met LAP en alginaat (figuur 4).

De generatie van een 80% (v/v) glyceroloplossing werd onderzocht zonder temperatuurregeling (kamertemperatuur, 22 °C) en zonder tipaanraking (gedefinieerd als opstelling 1), met temperatuurregeling (40 °C) en zonder tipaanraking (opstelling 2), of met temperatuurregeling (40 °C) en met tipaanraking (opstelling 3) (figuur 3a-i). Deze twee temperatuurinstellingen werden gekozen om het verschil in hantering te evalueren, aangezien de viscositeit van glycerol bijna met een factor 3 afneemt bij verhitting van 22 °C (139,5 mPa·s) tot 40 °C (46,6 mPa·s)³⁰. Een 85% (v/v) stamoplossing van glycerol werd verdund tot een eindconcentratie van 80% en gelijkmatig verdeeld in een 96 putplaat (n = 96 per opstelling). De experimentele tijd, die de afgifte van elk materiaal in de mengbuis, de respectieve mengtaken en monsterverdeling in een 96-putplaat omvat, was 30 min 42 s. Om verschillen tussen verdunningsmengsels te identificeren, werd ultrapuur water - als het verdunningsmiddel voor glycerol - bereid met 1 mg / ml Orange G. De absorptiemetingen benadrukken dat de integratie van de temperatuurregeling en de tip touch de mengsels aanzienlijk beïnvloedt (p < 0,0001). Naast de uitgevoerde tweerichtingsvariantieanalyse (ANOVA) werden de CV-waarden berekend om de relatieve standaarddeviatie te evalueren. De variatiecoëfficiënt beschrijft een gestandaardiseerde indicator om de mate van afwijking ten opzichte van het gemiddelde te bepalen en wordt uitgedrukt als een percentage. Als de steekproefmiddelen niet bepaald het aandachtspunt zijn, maar de variabiliteit binnen de metingen, biedt de variatiecoëfficiënt aanvullende inzichten om reproduceerbare mengsels te ^{identificeren46}. Binnen dit experiment met drie verschillende opstellingen vertoonden de absorptiewaarden dalende CV-waarden van respectievelijk 5,6%, 4,2% tot 2,0% voor setup 1, setup 2 en setup 3, wat de significante invloed van het temperatuurdock en de tip touch-functie op het produceren van betrouwbare resultaten aantoont (figuur 3a-ii). Het uitzetten van de absorptiewaarden van het monster voor opstelling 3 (monsternummer #1 tot en met #96 in een putplaat van 96) levert gedurende het hele experiment geen stijgende of dalende waarden op en geeft daarom aan dat de positie van het monster niet van invloed is op de absorptiewaarden (figuur 3a-iii). Het visualiseren van de gegevens voor elke gemeten putplaat met heatmaps biedt aanvullende inzichten om heterogeniteiten voor een specifieke rij of kolom te identificeren, of variërende absorptiewaarden tijdens de doseertaken. De gevisualiseerde heatmaps voor de drie opstellingen tonen verminderde heterogeniteiten over de gehele putplaten van opstelling 1 tot opstelling 3 (figuur 3b). Ten slotte werd de repliceerbaarheid van de uitgevoerde menging geëvalueerd binnen acht onafhankelijke runs (figuur 3c-i,ii), waarbij elke run 6 min 57 s duurde. Enkele mengruns vertoonden lage CV-waarden tussen 1,1% en 2,6%, wat wijst op zeer betrouwbare meng- en doseertaken voor de afzonderlijke runs. Absorptiewaarden van alle acht runs leverden een CV-waarde van 3,3% op en toonden de reproduceerbaarheid van het vastgestelde mengprotocol aan.

GelMA-verdunningsreeksen werden bereid door een 20% (w/v) stamoplossing met PBS te verdunnen tot 14, 12, 10, 8, 6, 4, 2 en 0% (w/v) en LAP toe te voegen aan een constante concentratie van 0,15% (w/v) (figuur 4a-i), die in totaal 55 min 12 s in beslag nam. Zoals gespecificeerd in het experimentele protocolscript, was de hydrogel crosslinking gedurende 30 s met een intensiteit van 2,0 mW / ^cm2 bij 400 nm. Om de verschillen tussen de mengsels te evalueren, werd PBS – als verdunningsmiddel voor GelMA en alginaat – bereid met 1 mg/ml Orange G. Daarom worden absorptieverschillen tussen monsters binnen één mengsel en tussen de seriële verdunningen geïdentificeerd met een spectrofotometer. De gemeten absorptiewaarden van elke concentratiestap zijn significant verschillend (p < 0,0001) en hebben zeer lage CV-waarden tussen 1,2% en 3,4% gedurende de concentratiestappen (n = 12 per concentratiestap). Lineaire regressie vertoonde een hoge fit met een R²-waarde van 0,9869 (figuur 4a-ii) en een heatmap bevestigde de homogene verdeling voor elke concentratie en het verschil tussen de concentraties (figuur 4a-iii). Geautomatiseerd mengen van vier reagentia werd uitgevoerd voor de generatie van 5% (w/v) GelMA, 2% (w/v) alginaat, 0,15% (w/v) LAP en PBS als verdunningsmiddel zonder (setup 2) en met (setup 3) touch tip (n = 96 voor elke setup) met dezelfde crosslinking parameters (30 s, 2,0 mW/^cm2, 400 nm). Het doseren van de vier materialen, mengen en verdelen in een 96 putplaat duurde 32 min 22 s. Alle experimenten met GelMA en alginaat werden uitgevoerd bij 37 °C om thermische geleer te voorkomen die pipetteren van GelMA voorkomt. Met de tip touch-optie werd de CV-waarde verlaagd van 5,2% naar 3,4% en vooral uitschieters in het onderste gebied werden voorkomen door overtollig materiaal uit de tip te verwijderen (figuur 4b-i). Hoewel de gemiddelde waarde van 1,927 en 1,944 voor opstelling 2 en opstelling 3 zeer dicht bij elkaar liggen, benadrukt de variatiecoëfficiënt de afnemende afwijking ten opzichte van het gemiddelde. Enkele rijen van de 96 putplaat kunnen met elkaar worden vergeleken met behulp van een heatmapvisualisatie om rij- en/of kolomverschillen te detecteren (figuur 4b-ii).

Afbeelding 1: Protocolworkflow met afzonderlijke taken. De beschreven workflow is onderverdeeld in zeven taken, die zijn onderverdeeld in setup, voorbereiding, uitvoering en analyse. In het begin moeten zowel de software (taak 1) als de hardware (taak 2) worden ingesteld. Na de voorbereiding van de materialen (taak 3) en het genereren van het protocolscript (taak 4) wordt de pipetteermodule gekalibreerd door de pipet- en containerposities te definiëren (taak 5). Vervolgens wordt het protocolscript uitgevoerd op het werkstation (taak 6) en worden validatie en verificatie (taak 7) van mengsels uitgevoerd om mengsels te evalueren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Open source werkstation en deck setup van de pipetteermodule. (a) Het ontwikkelde werkstation is geïnspireerd op een assemblagelijnbenadering, waarbij monsters door verschillende modules worden getransporteerd, en bestaat uit de volgende modules: pipetteren, crosslinker, opslag, transport en rekenmodule. b) Het dek van de pipetteermodule wordt ingesteld afhankelijk van de experimentele lay-out (bijv. type putplaat, buisvolume, enz.). De weergegeven dekopstelling werd gebruikt voor de gepresenteerde experimenten en bestaat uit verdringerpipetjes met een bereik van 10−100 μL (M100E) en 100−1.000 μL (M1000E), de tiprekken met capillaire zuigers (CP) voor 100 μL (CP1000) en 1.000 μL (CP1000), een afvalcontainer, een mengbak en een invoerlade voor de ingangsreagentia. c) De beschikbare dekposities worden gedefinieerd met de weergegeven nummers. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Resultaten voor geautomatiseerd pipetteren van glycerolmengsels. (a) Het flexibele werkstationontwerp maakt de evaluatie van drie verschillende opstellingen mogelijk (i) om optimale parameters voor reproduceerbare resultaten te identificeren. ii) De toevoeging van een tip touch en verwarming van het materiaal resulteerde in een verlaagde variantiecoëfficiënt (CV) en zeer reproduceerbare mengsels voor opstelling 3. Elk experiment werd uitgevoerd met 96 monsters. iii) Uitzetten van afzonderlijke monsterwaarden vertoonde geen invloed op de pipetteervolgorde. (b) Experimentele resultaten van elke opstelling werden gevisualiseerd met heatmaps om de invloed op ruwe / kolomverschillen, randen of hoofdmengsel te identificeren. (c) De reproduceerbaarheid van setup 3 werd binnen acht onafhankelijke runs geanalyseerd met behulp van (i) mediaan, standaarddeviatie, CV-waarde en (ii) heatmaps. Gegevens in de panelen a-ii (n = 96) en b-i (n = 12) worden gepresenteerd met de middelen en de enkelvoudige gegevenspunten. Statistische significantie werd gedefinieerd als ****p < 0,0001 met behulp van tweerichtingsvariantieanalyse (ANOVA). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Resultaten voor mengtaken met hydrogels. (a) Uit een gelatinemetacryloyl (GelMA) 20% (w/v) stamoplossing werd binnen één experimentele run een seriële verdunning van 14, 12, 10, 8, 6, 4, 2 en 0% (w/v) gegenereerd met behulp van een 96 putplaat (n = 12 per concentratie). (i) De variantiecoëfficiënt (CV) varieerde tussen 1,2% en 3,4% gedurende de bereide concentraties, en (ii) lineaire regressie vertoonde een hoge fit met een R²-waarde van 0,9869. iii) Homogene verdunningen werden visueel bevestigd met de gegenereerde heatmap. (b) Hydrogels met dubbel netwerk werden gegenereerd met 5% (w/v) GelMA, 2% (w/v) alginaat en 0,15% (w/v) LAP (i) met en zonder tip touch (n = 96 voor elke opstelling) en gecrosslinkt gedurende 30 s met een intensiteit van 2,0 mW/^cm2 bij 400 nm. De integratie van de tip touch resulteerde in dalende CV waarden van 5,2% naar 3,4%. ii,iii) Heatmaps bevestigen minder afwijkingen bij het gebruik van tip touch om overtollig materiaal van de tip te verwijderen. Gegevens in de panelen a-i en b-i worden gepresenteerd met de middelen en de afzonderlijke gegevenspunten. Statistische significantie werd gedefinieerd als *p < 0,05, ***p < 0,001 en ****p < 0,0001 met behulp van eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Samenvatting van het pipettypeverschil en problemen met viskeuze biomaterialen. a) Het reagens en de zuiger worden gescheiden door een luchtkussen dat krimpt tijdens doseerstappen en uitzet tijdens aanzuigen. Bij het aanzuigen en doseren van viskeuze materialen brengt de langzame 'stroming' problemen met zich mee zoals luchtbellen en onregelmatig pipettergedrag. b) Verdringerpipeten maken betrouwbaar aanzuigen en doseren van viskeus materiaal mogelijk door het gebruik van een zuiger in de punt. c) Pipetten van zeer viskeuze materialen (bijv. 4% (w/v) alginaat) kan leiden tot de accumulatie van overtollig materiaal op de punt, wat leidt tot onnauwkeurigheid gedurende de experimenten. d) De toepassing van een eenvoudige tip touch tray maakt het mogelijk om het overtollige materiaal op de punt te verwijderen en resulteert in nauwkeurige aanzuigende en doseervolumes. Dit wordt gerealiseerd door gebruik te maken van de binnenkant van het putplaatdeksel dat op een tip rack container wordt geplaatst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Materiaal #1 (voorraadconcentratie)	Eindconcentratie van materiaal #1	Materiaal #2 (voorraadconcentratie)	Eindconcentratie van materiaal #2	Materialen #3 (voorraadconcentratie)	Eindconcentratie van materiaal #3	Verdunningsmiddel (Oranje G-werkoplossing)	Uiteindelijke Orange G-concentratie in mengsel	Weergegeven in figuur
Glycerol (85% (w / v))	80% (met v)					water (1 mg/ml Orange G)	0,059 mg/ml	Figuur 3a−c
GelMA (20% (w/v))	0% (w/v)	LAP (3% (w/v))	0,15% (w/v)			PBS (1 mg/ml Oranje G)	1mg/ml	Figuur 4a
GelMA (20% (w/v))	2% (w/v)	LAP (3% (w/v))	0,15% (w/v)			PBS (1 mg/ml Oranje G)	0,85 mg/ml	Figuur 4a
GelMA (20% (w/v))	4% (met v)	LAP (3% (w/v))	0,15% (w/v)			PBS (1 mg/ml Oranje G)	0,75 mg/ml	Figuur 4a
GelMA (20% (w/v))	6% (met v)	LAP (3% (w/v))	0,15% (w/v)			PBS (1 mg/ml Oranje G)	0,65 mg/ml	Figuur 4a
GelMA (20% (w/v))	8% (w/v)	LAP (3% (w/v))	0,15% (w/v)			PBS (1 mg/ml Oranje G)	0,55 mg/ml	Figuur 4a
GelMA (20% (w/v))	10% (w/v)	LAP (3% (w/v))	0,15% (w/v)			PBS (1 mg/ml Oranje G)	0,45 mg/ml	Figuur 4a
GelMA (20% (w/v))	12% (w/v)	LAP (3% (w/v))	0,15% (w/v)			PBS (1 mg/ml Oranje G)	0,35 mg/ml	Figuur 4a
GelMA (20% (w/v))	14% (w/v)	LAP (3% (w/v))	0,15% (w/v)			PBS (1 mg/ml Oranje G)	0,25 mg/ml	Figuur 4a
GelMA (20% (w/v))	5% (w/v)	Alginaat (4% (w/v))	2% (w/v)	LAP (3% (w/v))	0,15% (w/v)	PBS (1 mg/ml Oranje G)	0,2 mg/ml	Figuur 4b

Tabel 1: Parameteroverzicht voor de uitgevoerde experimenten.

Protocol stap	Probleem	Mogelijke reden	Oplossing
1.1	Software kan niet worden geïnstalleerd of bijgewerkt	Onvoldoende schijfruimte op sd-kaart	Controleer de schijfruimte op de SD-kaart. Verwijder indien nodig onnodige items, maak de prullenbak leeg of gebruik een SD-kaart van de juiste grootte
1.2	API kan niet worden geïnstalleerd	Gebruikers mogelijkheid voor installatie is beperkt (geen root gebruiker toestemming)	Gebruik de opdracht 'sudo' voor opgegeven opdrachten om beheerdersrechten te verkrijgen. In Linux staat dit soort toegang bekend als de superuser.
3.1	Problemen met GelMA	Functionalisering, dialyse of lyofilisatie	Gedetailleerd stap-voor-stap protocol inclusief probleemoplossing lijst beschikbaar in Loessner et al.33.
5.1 en 6.2	Werkstation reageert niet op opdrachten	Verbindingsproblemen	Draai alles om en sluit de computer af. Schakel de voeding uit voor 10 s. Zet computer en werkstation weer aan.
5.1 en 6.2	Werkstation reageert niet op opdrachten	Verbindingsproblemen	Controleer of de computer de USB-verbinding herkent en of de USB-poort correct is gedefinieerd. Zorg ervoor dat de firewall het verbindingsproces niet verhindert (zie de link onder tabel 2).
5.1 en 6.2	Kan bestand niet openen	Verkeerde directory	Controleer director (mappad) om er zeker van te zijn dat het juiste pad wordt gebruikt. Als een bestand (bijvoorbeeld interface.py) niet kan worden gevonden, is het waarschijnlijk dat het verkeerde pad wordt gebruikt.
6.6.2	Tip is niet goed bevestigd of valt tijdens beweging	Kalibratieprobleem	Herhaal de kalibratiestappen voor de pipet en zorg ervoor dat de capillaire zuiger goed is aangesloten op de pipet.
6.6.2	Tip is niet goed bevestigd of valt tijdens beweging	Bijlage probleem	Pipet is niet goed aangesloten op de pipetas en beweegt tijdens de bewegingsstappen. Draai schroeven stevig vast om dit te voorkomen.
6.6.2	Tip is aspirateert boven materiaal	Kalibratieprobleem	Herhaal de kalibratie van dit ladetype om de hoogte goed te definiëren.
6.6.2	Tip is aspirateert boven materiaal	Kalibratieprobleem	Controleer het volume in de buis en zorg ervoor dat het volume gelijk is aan het volume dat is gedefinieerd in de protocolontwerperstoepassing.
6.6.2	Materiaal dompelt tijdens beweging	Te veel overtollig materiaal op de punt	Tip touch dock optie toevoegen; optioneel kan ook de tijd voor tip touch worden verlengd.
6.6.2	Materiaal is stevig of te stroperig om te pipetteren	Thermoresponsief gedrag van materiaal	Controleer de thermoresponsieve materiaalkarakterisering en pas de verwarmings- / koeltemperatuur van het temperatuurdok dienovereenkomstig aan.
https://support.opentrons.com/en/articles/2687601-c-having-trouble-connecting-try-this-basic-troubleshooting

Tabel 2: Tabel voor probleemoplossing met geïdentificeerde problemen, mogelijke redenen en oplossingen om de problemen op te lossen.

Aanvullend bestand. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Pipetteren van viskeuze materialen, met name hydrogels voor biomedische toepassingen19,20,21,33,47, zijn routinetaken in veel onderzoekslaboratoria om een door de gebruiker gedefinieerde concentratie of een verdunningsreeks met verschillende concentraties voor te bereiden. Hoewel het repetitief is en de uitvoering vrij eenvoudig is, wordt het meestal handmatig uitgevoerd met een lage ^{monsterdoorvoer18}. Deze tutorial introduceert de werking van een open source werkstation, dat speciaal is ontworpen voor viskeuze materialen, om geautomatiseerde menging van viskeuze materialen mogelijk te maken voor reproduceerbare generatie van gewenste concentraties. Dit werkstation is geoptimaliseerd voor het pipetteren van hydrogels om geautomatiseerde en zeer betrouwbare verwerking mogelijk te maken door de integratie van temperatuurdokken voor thermoresponsieve materialen, pipetten met positieve verplaatsing voor viskeuze materialen en een optioneel tipaanrakingsdok om overtollig materiaal van de punt te verwijderen. De pipetteermodule is specifiek geoptimaliseerd om de verwerking van viskeus materiaal op een gestandaardiseerde en geautomatiseerde manier mogelijk te maken. In vergelijking met luchtkussenpipeten (figuur 5a) doseren pipetten met verdringer (figuur 5b) viskeuze materialen zonder restmateriaal in de punt achter te laten, wat resulteert in nauwkeurige aanzuig- en doseervolumes. Het optionele tip touch dock verwijdert overtollig monstermateriaal van de punt (figuur 5c,d), wat handig is voor lijmachtige materialen (bijv. 4% (w/v) alginaat).

De protocol designer applicatie is speciaal geprogrammeerd voor hydrogels en maakt de verdunning van maximaal vier reagentia met verschillende concentraties en maximaal twee verdunningsmiddelen mogelijk. Het risico op fouten bij de berekening van eindverdunningen wordt in deze toepassing voorkomen, omdat gebruikers alleen de gewenste concentratie of de seriële verdunningsstappen kiezen. Vereiste aspiratie- en doseervolumes worden automatisch berekend, opgeslagen in een afzonderlijk documentatietekstbestand en vervolgens ingevuld in het protocolscript. Deze protocolontwerptoepassing geeft de gebruiker volledige controle over alle experimentele parameters (bijv. Pipetteersnelheid) en zorgt voor interne documentatie van de belangrijke parameters. De protocolontwerp-app houdt rekening met het vulniveau van het reservoir (bijv. goed) en varieert de aanzuig- / doseerhoogte om onnodige onderdompeling in de viskeuze materialen te voorkomen. Deze geïntegreerde functie voorkomt materiaalophoping op de buitenwand van de tip en zorgt daardoor voor betrouwbare aanzuig- en doseertaken gedurende het hele protocol. Hoewel de protocol designer applicatie is ontwikkeld voor hydrogel verdunningsstappen, kan het ook worden gebruikt voor verdunning van niet-viskeuze vloeistoffen, zoals Orange G-kleurstoffen. De protocol designer applicatie, die toegankelijk is via de repository onder '/examples/publication-JoVE', is de versie die wordt uitgelegd in de protocol sectie en gemarkeerd in de video. Deze versie wordt niet bijgewerkt. Een bijgewerkte versie van de protocolontwerperstoepassing is echter beschikbaar via de hoofdopslagpagina. De kalibratieterminal is in eerste instantie ontwikkeld door ^Sanderson48 en is geoptimaliseerd voor de kalibratie van verdringerpipetjes.

Zoals beschreven in protocol paragraaf 4, moeten pipetten en containers in eerste instantie worden gekalibreerd. Dit kalibratieproces is cruciaal om de posities te definiëren en op te slaan die vervolgens worden gebruikt om de bewegingsstappen te berekenen. Daarom is een succesvolle protocoluitvoering afhankelijk van goed gedefinieerde kalibratieposities, omdat verkeerde kalibratiepunten kunnen leiden tot het crashen van de tip in een container. Aangezien de zuigerposities van de pipetten handmatig moeten worden gekalibreerd, zijn de nauwkeurigheid en precisie van het pipetteren sterk afhankelijk van de uitgevoerde kalibratie. Deze kalibratieprocedures zijn sterk afhankelijk van de gebruikerservaring met de pipetteermodule en daarom wordt aan het begin training met ervaren personeel aanbevolen om de juiste kalibratieprocedures te garanderen. Naast de handmatige kalibratie op de pipetteermodule moet de pipet zelf worden gekalibreerd om nauwkeurig pipetteren te garanderen. Het wordt aanbevolen om de pipetten ten minste om de 12 maanden te kalibreren om te voldoen aan de acceptatiecriteria zoals gespecificeerd in ISO 8655. Om de pipetkalibratie intern te evalueren, zijn validatie en verificatie beschikbaar zoals beschreven door Stangegaard et ^al.16.

Voor het genereren van een betrouwbare dataset is het cruciaal om te beginnen met reagentia van hoge kwaliteit. Dit is vooral belangrijk voor hydrogelverwerkingstaken, omdat batch-to-batch-variaties van invloed kunnen zijn op de gegenereerde resultaten binnen dit protocol. Naast batch-to-batch variaties kunnen subtiele veranderingen in de voorbereiding van kleine volumes ook bijdragen aan eigenschapsverschillen. Om dit te voorkomen, wordt voorbereiding van grotere volumes aanbevolen, die voor de hele experimenten kunnen worden gebruikt.

De validatie- en verificatieprocedures zijn afhankelijk van het gebruik van een kleurstof om betrouwbare mengsels te identificeren. Het gepresenteerde protocol beschrijft de toepassing van Orange G, maar het algemene protocol en de analyseworkflow kunnen ook worden aangepast aan fluorescerende ^{kleurstoffen49,50}. Het gebruik van Orange G vermindert de technische vereisten van de spectrofotometer en elimineert voorzorgsmaatregelen die zijn genomen om bleken van de fluorescerende kleurstoffen na blootstelling aan licht te voorkomen. Problemen in het oplossend gedrag of clustervorming van de kleurstof zijn niet waargenomen met de gepresenteerde materialen tijdens experimenten, maar kunnen zich voordoen met andere materialen. Potentiële clustervorming en daarmee de interactie tussen kleurstof en materiaal konden eenvoudig met een microscoop worden gedetecteerd.

De procedures en technieken die in deze zelfstudie worden gepresenteerd, voegen automatiseringsmogelijkheden toe aan de huidige workflows voor viskeuze materialen om zeer betrouwbare taken uit te voeren met minimale menselijke arbeid. De meegeleverde tabel voor probleemoplossing (tabel 2) bevat geïdentificeerde problemen en presenteert mogelijke redenen en oplossingen om de problemen op te lossen. Het gepresenteerde werkstation is met succes toegepast op natuurlijke (gelatine, gellangom, matrigel) en synthetische (bijv. Poly(ethyleenglycol) [PEG], Pluronic F127, Lutrol F127) polymere materialen voor geautomatiseerde pipetteertaken. Met name de combinatie van een open source werkstation en een open source protocol ontwerp applicatie ontworpen voor viskeuze materialen zal zeer nuttig zijn voor onderzoekers die werkzaam zijn op het gebied van biomedische technologie, materiaalkunde en microbiologie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
15 reactiebuizen	Fisher Scientific, Inc. (USA)	14-959-53A
5 mL buizen	Pacific Laboratory Products Australia Pty. Ltd. (Australia)	SCT-5ML	grootte is afhankelijk van het experimentele protocol; ook Eppies (0,5, 1, 1,5 mL) of Falcon buizen (15, 50 mL) kunnen worden gebruikt; product wordt vervaardigd door Axygen, Inc. https://www.pacificlab.com.au/shop/tubes-plastic/sct-5ml-tubewith-screwcap-blue-unassembled-5ml-self-standing/1/name
50 mL reactiebuizen	Fisher Scientific, Inc. (USA)	14-432-22
70% w/w Ethanol	LabChem, Inc. (USA)	aja726-5Lpl
96-well plate	Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA)		https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/168055
Alginaat	NovaMatrix	4200001	https://www.novamatrix.biz/store/pronova-up-lvg/
Demineraliseerd of ultrapuur (MilliQ) water
Gelatine methacryloyl (GelMA)	Gesynthetiseerd in-house		gedetailleerd protocol (incl. materialen en referenties) is beschikbaar in Loessner et al. (2016), Nature Protocols. https://www.nature.com/articles/nprot.2016.037
Lithium fenyl-2,4,6-trimethylbenzoylfosfinaat (LAP)	Sigma-Aldrich, Inc. (USA)	900889
M4 en M5 Allensleutel	OpenBuilds, inc. (USA)	179, 190	ook verkrijgbaar in elke bouwmarkt. https://openbuildspartstore.com/allen-wrench/
OrangeG	Fisher Scientific (USA)	O267-25	https://www.fishersci.com/shop/products/orange-g-certified-biological-stain-fisher-chemical/O26725
Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)	Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA)	14190-144	alternatief: PBS-tabletten: 18912014 (Thermo Fisher Scientific)
Apparatuur
Aluminium blokken voor temperatuur dock	Ratek Instruments Pty. Ltd. (Australia)	SB16	blokken voor verschillende buismaten zijn verkrijgbaar. http://www.ratek.com.au/products/SB16-Block-with-12x16mm-holes.html
Analytische balans	Sartorius AG (Germany)	ED224S
Open source vloeistofbehandelingsrobot: commercieel product	Opentrons Laboratories, Inc. (USA)	OT-One S Pro	https://shop.opentrons.com/products/ot-one-pro
Open source vloeistofbehandelingsrobot: open source hardware	Geassembleerd in-house volgens een open source aanpak		hardware- en softwarebestanden zijn vrij toegankelijk op GitHub en Zenodo (links worden verstrekt); bouwinstructies worden verstrekt. https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation. https://zenodo.org/record/3612757#.XipEjBV7F24
Positieve verplaatsingspipet: MicromanE	Gilson, Inc. (USA)	FD10006	afhankelijk van de vereiste maat. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipettes/positive-displacement.html
Spectrofotometer	BMG LABTECH GmbH (Germany)	CLARIOstar
Tips: capillaire zuigers	Gilson, Inc. (USA)	F148180	afhankelijk van de vereiste maat. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipette-tips.html?technique_en_ww_lk=191