Dit protocol beschrijft drie stappen om larvale en volwassen Drosophila optische kwabben voor te bereiden op beeldvorming: 1) hersendissecties, 2) immunohistochemie en 3) montage. De nadruk wordt gelegd op stap 3, omdat er verschillende montagerichtingen nodig zijn om specifieke optische lobstructuren te visualiseren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Dissectie, immunohistochemie en montage van larvale en volwassen Drosophila-hersenen voor visualisatie van optische kwabben
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De optische kwab van Drosophila , bestaande uit vier neuropils: de lamina, medulla, lobula en lobulaplaat, is een uitstekend modelsysteem voor het verkennen van de ontwikkelingsmechanismen die neurale diversiteit genereren en de assemblage van circuits aandrijven. Gezien de complexe driedimensionale organisatie, vereist analyse van de optische kwab dat men begrijpt hoe de volwassen neuropils en larvale voorlopers ten opzichte van elkaar en de centrale hersenen zijn gepositioneerd. Hier beschrijven we een protocol voor de dissectie, immunokleuring en montage van larvale en volwassen hersenen voor beeldvorming van de oogkwab. Speciale nadruk wordt gelegd op de relatie tussen de montageoriëntatie en de ruimtelijke organisatie van de optische kwab. We beschrijven drie montagestrategieën in de larve (voorkant, posterieur en lateraal) en drie in de volwassen larve (anterieur, posterieur en horizontaal), die elk een ideale beeldvormingshoek bieden voor een duidelijke oogkwabstructuur.
Inleiding
Het visuele systeem van Drosophila, bestaande uit het samengestelde oog en de onderliggende oogkwab, is een uitstekend model geweest voor de studie van de ontwikkeling en functie van neurale circuits. In de afgelopen jaren is met name de optische kwab naar voren gekomen als een krachtig systeem om neurologische ontwikkelingsprocessen zoals neurogenese en circuitbedrading te bestuderen 1,2,3,4,5,6,7,8. Het bestaat uit vier neuropils: de lamina, medulla, lobula en lobulaplaat (de laatste twee vormen het lobulacomplex)1,2,3,4,5,6. Fotoreceptoren van het oog richten zich op neuronen van de lamina en medulla, die visuele input verwerken en doorgeven aan de neuropils van het lobulacomplex 1,2,3,4,5,6. Projectieneuronen in het lobulacomplex sturen vervolgens visuele informatie naar de verwerkingscentra van hogere orde in de centrale hersenen 1,5,9. De complexe organisatie van de optische kwab, noodzakelijk door de noodzaak om retinotopie te handhaven en om verschillende soorten visuele stimuli te verwerken, maakt het een aantrekkelijk systeem om te bestuderen hoe geavanceerde neurale circuits worden samengesteld. Met name de medulla vertoont opvallende overeenkomsten in zowel zijn organisatie als ontwikkeling met de neuroretina, die al lang een model is voor de ontwikkeling van neurale circuits van gewerveldedieren3,8.
De ontwikkeling van de optische kwab begint tijdens de embryogenese, met de specificatie van ~35 ectodermale cellen die de optische placode 2,4,5,6,7,8 vormen. Na het uitkomen van de larven wordt de optische placode onderverdeeld in twee verschillende primordia: 1) het buitenste proliferatiecentrum (OPC), dat de neuronen van de lamina en het buitenste merg genereert en 2) het binnenste proliferatiecentrum (IPC), dat neuronen van het binnenste merg en lobulacomplex genereert 4,5,6,10 . In de late larve van de tweede instar beginnen de neuro-epitheelcellen van de OPC en IPC te transformeren in neuroblasten die vervolgens neuronen genereren via intermediaire ganglionmoedercellen 4,5,11,12. Neuroblasten in de oogkwab worden gevormd door ruimtelijk en temporeel beperkte transcriptiefactoren, die samenwerken om neurale diversiteit in hun nageslacht te genereren 11,12,13,14. In de pop worden de circuits van de neuropils van de oogkwab geassembleerd via de coördinatie van verschillende processen, waaronder geprogrammeerde celdood11,15, neuronale migratie12,16, axonale/dendritische targeting10,17, synapsvorming18,19 en neuropilrotaties10,17.
Hier beschrijven we de methodologie waarmee larvale en volwassen hersenen worden ontleed, immunogekleurd en gemonteerd voor beeldvorming van de oogkwab. Gezien de complexe driedimensionale organisatie, vereist analyse van de optische kwab dat men begrijpt hoe de volwassen neuropils en larvale voorlopers ten opzichte van elkaar en de centrale hersenen zijn gepositioneerd. Daarom leggen we speciale nadruk op hoe de oriëntatie van de montage zich verhoudt tot de ruimtelijke organisatie van de optische lobstructuren. We beschrijven drie montagestrategieën voor larvale hersenen (voorste, achterste en laterale) en drie voor volwassen hersenen (voorste, achterste en horizontale), die elk een optimale hoek bieden voor het afbeelden van een specifieke populatie van optische kwab-voorlopercellen of neuropil.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Larvale hersenen voorbereiden op confocale beeldvorming
- Dissecties
OPMERKING: Voordat u met de dissectie begint, bereidt u de fix- (4% formaldehyde in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)) en PBT (0,1-0,3% Triton in PBS) oplossingen voor. De fixeeroplossing moet tijdens de dissectie op ijs worden geplaatst. Hoewel paraformaldehyde (PFA) fixeermiddel in dit protocol wordt gebruikt, zijn alternatieve fixatiestrategieën (met behulp van PLP20 of PEM21) beschreven voor specifieke epitopen. Voor larvale dissecties zijn twee pincetten (Dumont #5 of #55s) nodig. Zie de Tabel met Materialen voor meer details.- Begin met het vullen van elk putje van de snijschaal met 400 μL 1x PBS. Gebruik een pincet om voorzichtig rondzwervende larven van de derde instar te plukken die aan de binnenkant van de injectieflacon kruipen. Plaats de larven in het eerste kuiltje van de met PBS gevulde schaal.
- Neem een larve en breng deze over naar de middelste put. Houd met de niet-dominante hand het lichaam van de larve vast aan de voet van de put.
- Pak met de dominante hand voorzichtig de mondhaak van de larve vast en trek weg van het lichaam. De larvale hersenen moeten worden bevestigd aan de mondhaak en ander hulpweefsel en zullen loskomen als het weefsel wordt weggetrokken.
- Verwijder de bijbehorende denkbeeldige schijven en breng de larvale hersenen over naar het derde putje van de dissectieschaal. De denkbeeldige schijven zijn epitheelweefsels rond de larvale hersenen, die volwassen structuren genereren zoals de antennes, ogen, benen en vleugels20. Als ze op het weefsel achterblijven, kunnen de denkbeeldige schijven een goede immunokleuring van de larvale hersenen belemmeren.
- Om de denkbeeldige schijven te verwijderen, gebruikt u een pincet om de hersenen stevig vast te pakken via het ventrale zenuwkoord. Gebruik een andere pincet om de schijven voorzichtig weg te trekken.
- Verwijder de oogschijf voorzichtig, omdat deze zich over het oppervlak van de hersenkwabben wikkelt. Om de oogschijf te verwijderen, gebruikt u een pincet om de hersenen tegen de basis van de schaal te houden. In plaats van de hersenen vast te houden via het ventrale zenuwkoord, gebruik je de tang om de hersenkwab lichtjes vast te pakken en zorg ervoor dat je de kwab niet samenknijpt. Trek met een andere pincet de oogschijf voorzichtig weg.
OPMERKING: De denkbeeldige schijf van het oog zal uiteindelijk aanleiding geven tot fotoreceptoren van het netvlies. Voor degenen die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van neurale connectiviteit tussen het netvlies en de oogkwab, kan de oogschijf op de hersenen worden achtergelaten. Voor degenen die alleen geïnteresseerd zijn in de structuren van de optische kwab, wordt het echter aanbevolen om de oogschijf te verwijderen, omdat deze de beeldkwaliteit kan belemmeren vanwege de locatie op het oppervlak van de hersenen.
- Herhaal stap 1.1.2\u20121.1.4 totdat er voldoende hersenen zijn verzameld (of er 30 minuten dissectietijd is verstreken). Dissecties mogen niet langer dan 30 minuten duren om ervoor te zorgen dat de integriteit van het weefsel niet in gevaar komt.
- Zodra de dissectieperiode voorbij is, gebruikt u een P200-pipet om PBS voorzichtig uit het derde putje te verwijderen. Zorg ervoor dat er een kleine hoeveelheid vloeistof in de put blijft om de hersenen ondergedompeld te houden.
OPMERKING: Het is van cruciaal belang om de hersenen op alle punten van het protocol ondergedompeld te houden in vloeistof. Als het weefsel uitdroogt, kan de kwaliteit van de vlek worden aangetast door ongewenste autofluorescentie in het confocale beeld. - Voeg 500 μL van de cold fix-oplossing toe aan het derde putje. Gebruik een pincet om de vloeistof voorzichtig te roeren, zodat de hersenen in de schaal kunnen wervelen. Dek de schaal af met een glazen glaasje en plaats deze 30 minuten op ijs om weefselfixatie mogelijk te maken.
- Verwijder de fixatieoplossing en was de hersenen 5 keer met 400 μL PBT.
OPMERKING: Triton is een wasmiddel in PBT dat ervoor zorgt dat de hersenen niet aan elkaar of aan het gerecht blijven plakken en het weefsel voorbereidt op een optimale penetratie van antilichamen.
- Immunohistochemie
OPMERKING: Er zijn verschillende primaire antilichamen beschikbaar van de Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) die kunnen worden gebruikt om specifieke oogkwabstructuren of celtypen te labelen. DE-Cadherin labelt de IPC- en OPC-neuro-epitheel, Bruchpilot (Brp) markeert de zich ontwikkelende neuropil- en teckellabels lamina- en lobula-neuronen (evenals een kleine subset van medulla-neuronen). Daarnaast kan Elav worden gebruikt om neuronen te labelen, Prospero om ganglionmoedercellen te markeren en Repo om glia te identificeren.- Bereid de primaire antilichaamoplossing voor door antilichamen aan PBT toe te voegen tot een totaal volume van 100 μl. Een blokker (10% normaal geitenserum) kan worden gebruikt om niet-specifieke binding tussen het primaire antilichaam en weefsel te voorkomen 20,22,23. De antilichamen die in dit protocol worden gebruikt, labelen specifiek hersenweefsel zonder dat er blokkers nodig zijn.
- Verwijder de laatste wasbeurt na de fixatie en voeg de primaire antilichaamoplossing toe. Zorg ervoor dat er slechts een kleine hoeveelheid PBT in het putje zit voordat de antilichaamoplossing wordt toegevoegd. Roer na het toevoegen van de oplossing de hersenen 5-10 keer voorzichtig met een tang. Dek af met een glasplaatje, sluit af met laboratoriumfolie en incubeer een nacht bij 4 °C.
- Als alternatief, als er een gekoelde orbitale shaker beschikbaar is, plaatst u de schaal op de shaker om de incubatie 's nachts te optimaliseren.
OPMERKING: De incubatie van het primaire antilichaam en alle daaropvolgende stappen kunnen ook worden uitgevoerd in een microcentrifugebuisje van 1,5 ml. Het volume van primaire en secundaire incubaties kan 100 μL blijven, maar de wasstappen moeten worden uitgevoerd met 800 μL of meer PBT.
- Als alternatief, als er een gekoelde orbitale shaker beschikbaar is, plaatst u de schaal op de shaker om de incubatie 's nachts te optimaliseren.
- Spoel na incubatie de primaire antilichamen uit met PBT zoals in stap 1.1.8 van de vorige paragraaf.
OPMERKING: De primaire antilichaamoplossing moet worden bewaard en bewaard bij 4 °C, omdat deze opnieuw kan worden gebruikt voor volgende experimenten. Veel primaire antilichamen kunnen tot vier keer worden hergebruikt. - Voeg 400 μL PBT toe aan de hersenen voor een laatste wasbeurt. Dek de schaal af met een glaasje, sluit af met laboratoriumfolie en plaats deze op een orbitale schudder op lage snelheid (100 tpm) en kamertemperatuur (RT) gedurende ~4 uur.
OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Hersenen kunnen 2-33 dagen bij 4 °C in de was worden gelaten. - Bereid de secundaire antilichaamoplossing voor in een totaal volume van 100 μl.
OPMERKING: In dit protocol worden alle secundaire antilichamen gebruikt in een verdunning van 1:500, zonder blokkers. - Verwijder de PBT-wassing uit het putje en voeg de secundaire antilichaamoplossing toe. Meng het weefsel in de oplossing met behulp van een pincet. Dek de schaal af met een objectglaasje en laboratoriumfolie. Plaats de schaal op een orbitale schudder bij RT gedurende een minimale incubatietijd van 2 uur. Aangezien secundaire antilichamen lichtgevoelige fluoroforen bevatten, dek de schaal af met aluminiumfolie.
OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Hersenen kunnen een nacht in een secundaire antilichaamoplossing bij 4 °C worden bewaard. - Spoel de secundaire antilichamen uit zoals beschreven in stap 1.2.3. Voeg 400 μL PBT toe aan de hersenen voor een laatste wasbeurt. Dek de schaal af met een glaasje, sluit af met laboratoriumfolie en folie. Plaats de hersenen op een shaker bij RT gedurende 4 uur.
OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Hersenen kunnen 2-33 dagen bij 4 °C in de was worden gelaten.
- Montage
- Verwijder de laatste PBT-wasbeurt en vervang deze door twee druppels fluorescentiebestendige montagemedia. Plaats een druppel van het montagemedium op het midden van een objectglaasje.
- Breng de hersenen over van de put naar de druppel op de dia met behulp van een pincet. Om beschadiging van de oogkwabben te voorkomen, kunnen de hersenen worden vastgehouden door het ventrale zenuwkoord terwijl ze naar het glaasje worden overgebracht.
- Monteer de hersenen volgens de volgende montagestrategieën (Figuur 1A).
- Voorste kant naar boven
OPMERKING: Voor diegenen die geïnteresseerd zijn in het visualiseren van de voorste medulla, lamina of lobula plug, is deze montagerichting ideaal. De beste manier om de voorste versus achterste mounts te onderscheiden, is door de positie van het ventrale zenuwkoord ten opzichte van de hersenkwabben te onderzoeken.- Gebruik de voorste oriëntatie om te zien hoe het ventrale zenuwkoord over de lobben uitsteekt (Figuur 1B).
- Achterkant naar boven
OPMERKING: Deze oriëntatie wordt aanbevolen voor diegenen die geïnteresseerd zijn in het visualiseren van de achterste uiteinden van de OPC (pOPC) of IPC 10,11.- Gebruik de posterieure oriëntatie om te zien hoe het ventrale zenuwkoord onder de hersenkwabben uitsteekt (Figuur 1C).
- Zijaanzicht
OPMERKING: Een laterale montageoriëntatie wordt gebruikt om de halve maan van lamina-, medulla- of lobula-plug-neuronen in zowel de dorsale-ventrale als de voorste-posterieure as in een enkel vlak te visualiseren (Figuur 1G).- Voor een zijwaartse montage splitst u de hersenkwabben van elkaar om plat op hun kant te vallen, met de lamina en lobulaplug naar boven gericht.
- Splits met behulp van twee scherpe tangen het ventrale zenuwkoord in tweeën, beginnend vanaf het punt waar het koord aan de lobben vastzit. Merk op dat de twee lobben al van elkaar gescheiden zijn, waarbij het ventrale zenuwkoord ze intact houdt. Splits dus het ventrale zenuwkoord naar beneden vanaf het splijtingspunt tussen de lobben, om ze te scheiden. Draai vervolgens elke hersenkwab en het aangehechte ventrale zenuwkoord aan hun zijkanten om met de zijvlakken naar boven gericht.
OPMERKING: Voor montage vanuit het zijaanzicht wordt aanbevolen om een wolfraamnaald met een fijne punt te gebruiken om de hersenkwab op zijn kant te oriënteren. Om de oriëntatie van de lobben en de richting van het ventrale zenuwkoord bij de montage duidelijk te visualiseren, kan de microscoopverlichting worden aangepast. Als u een LED-lichtbron met zwanenhals gebruikt, moeten de zwanenhalzen evenwijdig aan het oppervlak van de slede worden geplaatst voor een duidelijke zichtbaarheid. Ook kan de lichtintensiteit worden verhoogd of verlaagd om het contrast tussen de hersenstructuren te verbeteren en duidelijkheid te bieden tijdens het monteren.
- Voorste kant naar boven
- Plaats een kleine druppel PBS aan weerszijden van het bevestigingsmedium met de hersenen. Plaats een dekglaasje op elke druppel en een laatste dekglaasje over de hersenen. De rechter- en linkerrand van het bovenste dekglaasje moeten op de twee andere dekglaasjes rusten (Figuur 1A).
OPMERKING: Voordat een dekglaasje over de hersenen wordt geplaatst, moet er een brug worden gebouwd. Larvale hersenen zijn ongeveer 200 μm dik en om de integriteit van het weefsel te behouden, wordt dus een brug gemaakt die de afstand tussen de dekglaasje en het oppervlak van het glaasje vergroot. - Dicht de randen van de brug af met nagellak om de gemonteerde hersenen vast te zetten.
- Breng de hersenen in beeld met behulp van confocale microscopie.
2. Volwassen hersenen voorbereiden op confocale beeldvorming
- Dissecties
OPMERKING: Volwassen hersendissecties zijn uitdagender dan larvale hersenen en vereisen een zorgvuldige behandeling. Het wordt sterk aanbevolen om ten minste één ultrafijne pincet (Dumont #55) te gebruiken voor dit deel van het protocol.- Verdoof vliegen met CO2, gebruik een naald of vliegenpad en leg ze op een laboratoriumdoekje of keukenpapier over ijs (om ze verdoofd te houden).
- Voeg 400 μL PBS toe aan alle drie de putjes van de glazen schaal. Gebruik een pincet om een volwassen vlieg voorzichtig bij de vleugels te pakken en in het eerste putje van de schaal te plaatsen.
- Gebruik een pincet in de niet-dominante hand om de thorax van de vlieg tegen de basis van de put te houden. Trek met de dominante hand voorzichtig het hoofd van de rest van het lichaam.
- Breng het hoofd over in het tweede putje. Vaak blijft het hoofd drijven in de PBS en kan het moeilijk te hanteren zijn. Gebruik een pincet om het bij de proboscis tegen de bodem van de put te houden.
- Trek met beide tangen een deel van de nagelriem tussen de ogen weg. Aangezien de hersenen zich direct onder de nagelriem bevinden, moet u zo voorzichtig mogelijk zijn om beschadiging van het onderliggende weefsel te voorkomen. Ga door met het afpellen van de nagelriem, stukje bij beetje, totdat de hersenen bloot komen te liggen. Verwijder al het bijkomende weefsel (d.w.z. netvlies, luchtpijp, luchtzakken) dat mogelijk aan de hersenen vastzit.
OPMERKING: Verwijdering van het netvlies is beschreven in eerdere protocollen22,24, maar de lamina kan ook worden gescheiden van de rest van de optische kwab. Dit is handig voor diegenen die het medulla- of lobula-complex willen bestuderen, aangezien de lamina aan het oppervlak zit en de visualisatie van deze andere neuropils van de oogkwab bij beeldvorming kan belemmeren. Om de lamina te verwijderen, gebruikt u een scherpe pincet om voorzichtig aan de inkeping tussen de lamina en medulla neuropils te trekken. De lamina begint langzaam los te pellen van de medulla. Herhaal deze beweging totdat de hele lamina is verwijderd. Tijdens dit proces is het belangrijk om de hersenen stevig vast te houden. Gebruik een andere pincet om de hersenen tegen de basis van de schaal te houden door deze zo te plaatsen dat de boven- en onderkant van de centrale hersenen perfect tussen de uiteinden van de pincet passen. Een stevige grip rond de centrale hersenen voorkomt ongewenste schade aan de oogkwab. - Breng de schone hersenen over naar de derde put. Herhaal stap 2.1.2\u20122.1.6 totdat er voldoende hersenen zijn verkregen of een maximale dissectieperiode van 30 minuten is verstreken.
- Verwijder het PBS in het derde putje en voeg 500 μL fixeeroplossing toe. Zorg ervoor dat de hersenen hier of tijdens wasstappen niet uitdrogen, omdat dit zal leiden tot achtergrondfluorescentie in de confocale beelden. Dek de schaal af met een glazen glaasje en laat de hersenen 20 minuten in fix incuberen bij RT.
- Was de hersenen na fixatie 5 keer met 400 μL PBT.
OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Hersenen kunnen worden afgedekt met een objectglaasje en laboratoriumfilm en 2-33 dagen bij 4 °C worden gewassen. Voor onderzoekers die nieuw zijn in het systeem, kan het gemakkelijker zijn om voor en tijdens de fixatie accessoire weefsel op de hersenen achter te laten. Dit zal onderzoekers in staat stellen om het aantal hersenmonsters dat in een bepaalde dissectieperiode wordt verkregen, te maximaliseren. Nadat het weefsel is gefixeerd en gewassen, kunnen de hersenen zorgvuldig worden gereinigd voordat de primaire antilichaamoplossing wordt toegevoegd. Volwassen hersenen met bijkomend weefsel hebben de neiging om te drijven en lopen daarom het risico uit te drogen. Als gevolg hiervan wordt aanbevolen om een pincet te gebruiken om alle hersenen voorzichtig in het midden van de schaal te verzamelen bij het toevoegen van fixatieoplossing, en om de hersenen onmiddellijk na fixatie schoon te maken.
- Immunohistochemie
- Voer immunohistochemie uit zoals beschreven voor larvale hersenen in rubriek 1.2.
- Nuttige primaire antilichamen uit de DSHB zijn onder meer de antilichamen die worden genoemd in het protocol voor immunohistochemie van larven in rubriek 1.2. Zie de Materiaaltabel voor een volledige lijst van antilichamen en bijbehorende verdunningen.
OPMERKING: Tijdens de wasstappen moet extra voorzichtig worden geweest voor volwassen hersenen, omdat ze naar het oppervlak van de wasoplossing kunnen drijven en het risico lopen uit te drogen aan de zijkanten van de put wanneer de oplossing wordt verwijderd (wat zal leiden tot achtergrondfluorescentie). Een goede gewoonte is om de pipet in de ene hand te houden om vloeistof toe te voegen of weg te zuigen, en een pincet in de andere om de hersenen onder water te houden.
- Montage
- Voer voorafgaand aan de montagestap een laatste wasbeurt uit met PBS (in plaats van PBT). PBS zorgt ervoor dat de hersenen een beetje plakkerig worden, waardoor ze tijdens het monteren in de gewenste richting kunnen blijven.
- Verwijder de laatste wasbeurt en vervang deze door drie druppels fluorescentiebestendige montagemedia. Plaats een druppel van het montagemedium op het midden van een microscoopglaasje.
- Breng de hersenen over van de put naar de druppel op de dia met behulp van een pincet. Om beschadiging van de oogkwabben te voorkomen en te voorkomen dat het weefsel uitdroogt, moet u voorzichtig een brein ophalen via capillaire werking. Sluit langzaam een tang rond een brein totdat een kleine hoeveelheid vloeistof met de hersenen tussen de uiteinden wordt opgezogen.
OPMERKING: Wanneer u de hersenen naar de dia overbrengt, moet u ervoor zorgen dat u de tang niet sluit, omdat dit de hersenen beschadigt. Als alternatief kan een P200-pipet worden gebruikt om de hersenen over te dragen. Snijd het uiteinde van de punt af om de opening te verbreden en spoel voor met PBT om te voorkomen dat de hersenen aan de binnenkant van de punt blijven plakken. - Monteer de hersenen volgens de volgende strategieën (Figuur 2A).
- Voorste kant naar boven
OPMERKING: Om lamina- en medulla-neuronen te visualiseren, oriënteert u de hersenen met de voorste kant naar boven (Figuur 2B). Dit kan worden bereikt door de anatomie en kromming van de centrale antennelobben te onderzoeken.- Draai met een pincet de hersenen voorzichtig op hun zij om zowel de voorste als de achterste kant te onderzoeken. Merk op dat aan de voorste kant de kromming van de hersenen uitgesproken is en dat de antennelobben iets uit het midden steken.
- Achterkant naar boven
- Plaats de hersenen met de achterste (platte) kant naar boven en de antennelobben naar beneden (Figuur 2C).
OPMERKING: Dit brengt de lobula en de lobulaplaat dichter bij het beeldvormingsoppervlak en is ideaal voor diegenen die geïnteresseerd zijn in het visualiseren van lobula-complexe neuronen.
- Plaats de hersenen met de achterste (platte) kant naar boven en de antennelobben naar beneden (Figuur 2C).
- Horizontale weergave
OPMERKING: Om alle neuropils van de oogkwab tegelijkertijd te visualiseren, gebruikt u een horizontale montagestrategie (Figuur 2G). In deze oriëntatie kunnen neuronale cellichamen, axonale trajecten en dendritische arborisaties in hetzelfde vlak worden gevisualiseerd.- Oriënteer in eerste instantie de hersenen met de voorste kant naar boven. Kantel met een wolfraamnaald de hersenen voorzichtig 90° naar boven zodat ze op hun dorsale kant zitten met hun antennelobben naar buiten gericht. Controleer of zowel de voorste als de achterste kant van de hersenen in deze richting zichtbaar zijn.
- Voorste kant naar boven
- Gebruik in plaats van een dekslipbrug klei om de dekslip van de dia te tillen. Het gebruik van klei maakt het mogelijk om de hersenen opnieuw te monteren na beeldvorming (beschreven in het discussiegedeelte).
- Leg op elke hoek van een dekglaasje een klein stukje klei. Zorg ervoor dat elk stuk klei relatief even dik is. De stukjes klei moeten tussen de 0,5 en 1 mm dik zijn. Plaats het dekglaasje voorzichtig over de hersenen en oefen lichte druk uit op de hoeken. Het dekglaasje moet de vloeistof onmiddellijk opvangen en een afdichting vormen. De dia is nu klaar voor beeldvorming.
OPMERKING: Voor langdurige opslag van de dia wordt aanbevolen om het dekglaasje af te dichten met nagellak en te bewaren bij 4 °C uit de buurt van licht.
- Leg op elke hoek van een dekglaasje een klein stukje klei. Zorg ervoor dat elk stuk klei relatief even dik is. De stukjes klei moeten tussen de 0,5 en 1 mm dik zijn. Plaats het dekglaasje voorzichtig over de hersenen en oefen lichte druk uit op de hoeken. Het dekglaasje moet de vloeistof onmiddellijk opvangen en een afdichting vormen. De dia is nu klaar voor beeldvorming.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Confocale beelden van larvale en volwassen oogkwabben gemonteerd in de oriëntaties beschreven in het protocol worden weergegeven in figuur 1 en figuur 2.
Figuur 1 toont schema's en representatieve confocale plakjes van larvale hersenen, gepositioneerd in de anterieure, posterieure en laterale oriëntaties. In de voorste montageoriëntatie verschijnen het OPC-epitheel (DE-Cadherin), medulla-neuroblasten (
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In dit protocol beschrijven we een methode om de hersenen van larven en volwassen Drosophila te immunokleuren en ze in verschillende richtingen te monteren. Hoewel methoden om larvale en volwassen hersenen te kleuren eerder zijn beschreven 22,23,24,27,28, hebben montagestrategieën voor de optimale visualisatie van specifieke oogkwabstructuren minder aandacht gekregen
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
We willen Claude Desplan bedanken voor het met ons delen van een aliquot van het Bsh-antilichaam. De DE-Cadherin, Dachshund, Eyes Absent, Seven-up en Bruchpilot monoklonale antilichamen werden verkregen van de Developmental Studies Hybridoma Bank, gemaakt door de NICHD van de NIH en onderhouden aan de Universiteit van Iowa, Department of Biology, Iowa City, IA 52242. Dit werk werd ondersteund door een NSERC Discovery Grant toegekend aan T.E.. UA wordt ondersteund door een NSERC Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarship. PV wordt ondersteund door een Ontario Graduate Scholarship.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 10x PBS | Bioshop | PBS405 | |
| 37% formaldehyde | Bioshop | FOR201 | |
| Alexa Fluor 488 (geit) secundair | Invitrogen | A-11055 | gebruik bij 1:500 |
| Alexa Fluor 555 (muis) secundair | Invitrogen | A-31570 | gebruik bij 1:500 |
| Alexa Fluor 647 (guinea pig) secundair | Invitrogen | A-21450 | gebruik bij 1:500 |
| Alexa Fluor 647 (rat) secundair | Invitrogen | A-21247 | gebruik bij 1:500 |
| Dekselglazen | VWR | 48366-067 | |
| Dissectiepincet - #5 | Dumont | 11251-10 | |
| Dissectiepincet - #55 | Dumont | 11295-51 | |
| Dissectiebakje | Corning | 722085 | |
| Droogdoekjes | Kimbery Clark | 34155 | |
| Geit anti-Bgal primaire antistof | Biogenesis | gebruik bij 1:1000 | |
| Guinea pig anti-Bsh primaire antistof | Gift van Claude Desplan | gebruik bij 1:500 | |
| Guinea pig anti-Vsx1 primaire antistof | Erclik et al. 2008 | gebruik bij 1:1000 | |
| Laboratoriumfolie | Parafilm | PM-996 | |
| Microcentrifugebuisjes | Sarstedt | 72.706.600 | |
| Microscoopglaasjes | VWR | CA4823-180 | |
| Muis anti-dac primaire antistof | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | mabdac2-3 | gebruik bij 1:20 |
| Muis anti-eya primaire antistof | DSHB | eya10H6 | gebruik bij 1:20 |
| Muis anti-nc82 primaire antistof | DSHB | nc82 | gebruik bij 1:50 |
| Muis anti-svp primaire antistof | DSHB | Seven-up 2D3 | gebruik bij 1:100 |
| Polymer Clay | Elke soort klei kan worden gebruikt | ||
| Konijn anti-GFP | Invitrogen | A-11122 | gebruik bij 1:1000 |
| Rat anti-DE-Cadherin primaire antistof | DSHB | DCAD2 | gebruik bij 1:20 |
| Slowfade montagemedium | Invitrogen | S36967 | Vectashield montagemedium ( cat# H-1000) kan ook worden gebruikt |
| Triton-x-100 | Bioshop | TRX506 |
Referenties
- Fischbach, K. -F., Dittrich, A. P. M. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell Tissue Research. 258, (1989).
- Hofbauer, A., Campos-Ortega, J. A. Proliferation pattern and early differentiation of the optic lobes in Drosophila melanogaster. Roux's Archives of Developmental Biology. 198, 264-274 (1990).
- Sanes, J. R., Zipursky, S. L. Design Principles of Insect and Vertebrate Visual Systems. Neuron. 66, 15-36 (2010).
- Nériec, N., Desplan, C. From the Eye to the Brain. Development of the Drosophila Visual System. Current Topics in Developmental Biology. 116, Academic Press Inc. 247-271 (2016).
- Apitz, H., Salecker, I. A Challenge of Numbers and Diversity: Neurogenesis in the Drosophila Optic Lobe. Journal of Neurogenetics. 28, 233-249 (2014).
- Contreras, E. G., Sierralta, J., Oliva, C. Novel strategies for the generation of neuronal diversity: Lessons from the fly visual system. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 140(2019).
- Erclik, T., Hartenstein, V., Lipshitz, H. D., McInnes, R. R. Conserved Role of the Vsx Genes Supports a Monophyletic Origin for Bilaterian Visual Systems. Current Biology. 18, 1278-1287 (2008).
- Erclik, T., Hartenstein, V., McInnes, R. R., Lipshitz, H. D. Eye evolution at high resolution: The neuron as a unit of homology. Developmental Biology. 332, 70-79 (2009).
- Wu, M., et al. Visual projection neurons in the Drosophila lobula link feature detection to distinct behavioral programs. eLife. 5, (2016).
- Ngo, K. T., Andrade, I., Hartenstein, V. Spatio-temporal pattern of neuronal differentiation in the Drosophila visual system: A user's guide to the dynamic morphology of the developing optic lobe. Developmental Biology. 428, 1-24 (2017).
- Li, X., et al. Temporal patterning of Drosophila medulla neuroblasts controls neural fates. Nature. 498, 456-462 (2013).
- Erclik, T., et al. Integration of temporal and spatial patterning generates neural diversity. Nature. 541, 365-370 (2017).
- Apitz, H., Salecker, I. A region-specific neurogenesis mode requires migratory progenitors in the Drosophila visual system. Nature Neuroscience. 18, 46-55 (2015).
- Suzuki, T., Kaido, M., Takayama, R., Sato, M. A temporal mechanism that produces neuronal diversity in the Drosophila visual center. Developmental Biology. 380, 12-24 (2013).
- Hara, Y., Sudo, T., Togane, Y., Akagawa, H., Tsujimura, H. Cell death in neural precursor cells and neurons before neurite formation prevents the emergence of abnormal neural structures in the Drosophila optic lobe. Developmental Biology. 436, 28-41 (2018).
- Morante, J., Erclik, T., Desplan, C. Cell migration in Drosophila optic lobe neurons is controlled by eyeless/Pax6. Development. 138, 687-693 (2011).
- Millard, S. S., Pecot, M. Y. Strategies for assembling columns and layers in the Drosophila visual system. Neural Development. 13, 1-17 (2018).
- Takemura, S. Y., Lu, Z., Meinertzhagen, I. A. Synaptic circuits of the Drosophila optic lobe: The input terminals to the medulla. Journal of Comparative Neurology. 509, 493-513 (2008).
- Akin, O., Bajar, B. T., Keles, M. F., Frye, M. A., Zipursky, S. L. Cell-type-Specific Patterned Stimulus-Independent Neuronal Activity in the Drosophila Visual System during Synapse Formation. Neuron. 101, 894-904 (2019).
- Spratford, C. M., Kumar, J. P. Dissection and immunostaining of imaginal discs from drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (91), e51792(2014).
- Dokucu, M. E., Zipursky, S. L., Cagan, R. L. Atonal, rough and the resoluton of proneural clusters in the developing Drosophila retina. Development. 122, Cambridge, England. 4139-4147 (1996).
- Hsiao, H. Y., et al. Dissection and immunohistochemistry of larval, pupal and adult Drosophila retinas. Journal of visualized experiments. , e4347(2012).
- Kelly, S. M., Elchert, A., Kahl, M. Dissection and immunofluorescent staining of mushroom body and photoreceptor neurons in adult Drosophila melanogaster brains. Journal of Visualized Experiments. , e56174(2017).
- Williamson, R. W., Hiesinger, R. P. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. Journal of Visualized Experiments. , e1936(2010).
- Bertet, C., et al. Temporal patterning of neuroblasts controls notch-mediated cell survival through regulation of hid or reaper. Cell. 158, 1173-1186 (2014).
- Pinto-Teixeira, F., et al. Development of Concurrent Retinotopic Maps in the Fly Motion Detection Circuit. Cell. 173, 485-498 (2018).
- Plevock, D. A., Rusan, K. M. Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts. Journal of Visualized Experiments. , e51756(2014).
- Ting, C. Y., et al. Analyzing dendritic morphology in columns and layers. Journal of Visualized Experiments. , e55410(2017).
- Özel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development. eLife. 4, (2015).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
