2D-HELS MS Seq: Een algemene LC-MS-gebaseerde methode voor directe en de novo sequencing van RNA-mengsels met verschillende nucleotidemodificaties

Samenvatting

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor een LC-MS-gebaseerde sequencingmethode die kan worden gebruikt als een directe methode om kort RNA (<35 nt per run) te sequencen zonder een cDNA-tussenproduct, en als een algemene methode om verschillende nucleotidemodificaties te sequencen in een enkele studie met precisie op één base.

Samenvatting

Het is aangetoond dat op massaspectrometrie (MS) gebaseerde sequencingbenaderingen nuttig zijn bij directe sequencing van RNA zonder dat er een complementair DNA (cDNA) tussenproduct nodig is. Dergelijke benaderingen worden echter zelden toegepast als een de novo RNA-sequencingmethode, maar worden voornamelijk gebruikt als een hulpmiddel dat kan helpen bij kwaliteitsborging voor het bevestigen van bekende sequenties van gezuiverde enkelstrengs RNA-monsters. Onlangs hebben we een directe RNA-sequencingmethode ontwikkeld door een 2-dimensionale hydrofobe eindlabelingstrategie voor massaretentietijd te integreren in MS-gebaseerde sequencing (2D-HELS MS Seq). Deze methode is in staat om afzonderlijke RNA-sequenties en mengsels die maximaal 12 verschillende RNA-sequenties bevatten, nauwkeurig te sequencen. Naast de vier canonieke ribonucleotiden (A, C, G en U), heeft de methode de capaciteit om RNA-oligonucleotiden die gemodificeerde nucleotiden bevatten te sequencen. Dit is mogelijk omdat de gemodificeerde nucleobase ofwel een intrinsiek unieke massa heeft die kan helpen bij de identificatie en de locatie in de RNA-sequentie, ofwel kan worden omgezet in een product met een unieke massa. In deze studie hebben we RNA gebruikt, waarin twee representatieve gemodificeerde nucleotiden (pseudouridine (Ψ) en 5-methylcytosine (m⁵C)) zijn opgenomen, om de toepassing te illustreren van de methode voor de novo sequencing van een enkel RNA-oligonucleotide en een mengsel van RNA-oligonucleotiden, elk met een andere sequentie en/of gemodificeerde nucleotiden. De procedures en protocollen die hier worden beschreven om deze model-RNA's te sequencen, zullen van toepassing zijn op andere korte RNA-monsters (<35 nt) bij gebruik van een standaard LC-MS-systeem met hoge resolutie, en kunnen ook worden gebruikt voor sequentieverificatie van gemodificeerde therapeutische RNA-oligonucleotiden. In de toekomst, met de ontwikkeling van robuustere algoritmen en met betere instrumenten, zou deze methode het mogelijk kunnen maken om complexere biologische monsters te sequencen.

Inleiding

Op massaspectrometrie (MS) gebaseerde sequencingmethoden, waaronder top-down MS en tandem MS 1,2,3,4, zijn ontwikkeld voor directe sequencing van RNA. In situ fragmentatietechnieken voor het effectief genereren van hoogwaardige RNA-ladders in massaspectrometers kunnen momenteel echter niet worden toegepast op de novo sequencing ^5,6. Bovendien is het niet erg triviaal om de traditionele eendimensionale (1D) MS-gegevens te analyseren voor de novo sequencing van zelfs maar één gezuiverde RNA-sequentie, en het zou nog uitdagender zijn voor MS-sequencing van gemengde RNA-monsters ^7,8. Daarom is een tweedimensionale (2D) vloeistofchromatografie (LC)-MS-gebaseerde RNA-sequencingmethode ontwikkeld, waarbij de productie van 2D-massaretentietijd (t_R) ladders is opgenomen ter vervanging van 1D-massaladders, waardoor het veel gemakkelijker wordt om laddercomponenten te identificeren die nodig zijn voor de novo sequencing van RNA's⁸. De op 2D LC-MS gebaseerde RNA-sequencingmethode is echter voornamelijk beperkt tot gezuiverd synthetisch kort RNA, aangezien het geen volledige sequentie kan lezen uitsluitend op basis van één enkele ladder, maar moet vertrouwen op twee naast elkaar bestaande aangrenzende ladders (5'- en 3'-ladders)⁸. Meer specifiek vereist deze benadering bidirectionele lezingen met gepaarde uiteinden voor het lezen van terminale nucleobasen in het gebied met lage massa⁸. De extra complexiteit van de lezing met gepaarde uiteinden leidt ertoe dat deze methode onhoudbaar is voor de sequentiebepaling van RNA-mengsels, omdat er verwarring ontstaat over welk ladderfragment bij welke ladder hoort voor de onbekende monsters.

Om de bovengenoemde barrières in MS-gebaseerde RNA-sequencingbenaderingen te overwinnen en dergelijke toepassingen in directe RNA-sequencing te verbreden, moeten twee problemen worden aangepakt: 1) hoe een hoogwaardige massaladder te genereren die kan worden gebruikt om een volledige sequentie te lezen, van het eerste nucleotide tot de laatste in een RNA-streng, en 2) hoe elke RNA/massaladder in een complexe MS-dataset effectief kan worden geïdentificeerd. Samen met een goed gecontroleerde zuurdegradatie hebben we een nieuwe sequencingmethode ontwikkeld door een hydrofobe eindlabelingstrategie (HELS) te introduceren in de op MS gebaseerde sequencingtechniek, en deze twee problemen met succes aan te pakken door een hydrofobe tag toe te voegen aan het 5'- en/of 3'-einde van de RNA's waarvan de sequentie moet worden gegeven⁹. Deze methode creëert een "ideale" sequentieladder van RNA - elk ladderfragment is uitsluitend afgeleid van plaatsspecifieke RNA-splitsing bij elke fosfodiësterbinding, en het massaverschil tussen twee aangrenzende ladderfragmenten is de exacte massa van het nucleotide of nucleotidemodificatie op die positie ^8,9,10. Dit is mogelijk omdat we een zeer gecontroleerde zure hydrolysestap opnemen, waarbij het RNA gemiddeld één keer per molecuul wordt gefragmenteerd voordat het in het instrument wordt geïnjecteerd. Als gevolg hiervan wordt elk afbraakfragmentproduct gedetecteerd op de massaspectrometer en vormen alle fragmenten samen een sequentieladder ^8,9,10. Deze nieuwe strategie maakt het mogelijk om een RNA-sequentie volledig af te lezen van de ene enkele ladder van een RNA-streng zonder gepaarde uitlezing van de andere ladder van het RNA, en maakt bovendien MS-sequencing mogelijk van RNA-mengsels met meerdere verschillende strengen die combinatorische nucleotidemodificaties bevatten⁹. Door een tag toe te voegen aan het 5'- en/of 3'-uiteinde van het RNA, vertonen de gelabelde ladderfragmenten een aanzienlijke vertraging van t_R, wat kan helpen om de twee massaladders van elkaar en ook van het luidruchtige gebied met een lage massa te onderscheiden. De massa-t_{R-verschuiving} die wordt veroorzaakt door het toevoegen van de hydrofobe tag vergemakkelijkt de identificatie van de massaladder en vereenvoudigt de gegevensanalyse voor het genereren van sequenties. Bovendien kan de toevoeging van de hydrofobe tag helpen om de terminale basis in de streng te identificeren door te voorkomen dat het overeenkomstige ladderfragment zich in het luidruchtige_{R-gebied met} lage massa bevindt als gevolg van de massa- en hydrofobiciteitstoename veroorzaakt door de tag, waardoor de volledige sequentie van een RNA van een enkele ladder kan worden geïdentificeerd; Er zijn geen lezingen met gekoppelde uiteinden vereist. Als gevolg hiervan hebben we eerder de succesvolle sequentiebepaling aangetoond van een complex mengsel van maximaal 12 verschillende RNA-strengen zonder het gebruik van een geavanceerd sequencing-algoritme⁹, wat de deur opent voor de novo MS-sequencing van RNA dat zowel canonieke als gemodificeerde nucleotiden bevat en het haalbaarder maakt voor de sequentiebepaling van gemengde en complexere RNA-monsters. Met behulp van 2D-HELS MS Seq hebben we zelfs met succes een gemengde populatie van tRNA-monsters¹⁰ gesequenced en breiden we de toepassing ervan actief uit naar andere complexe RNA-monsters.

Om 2D-HELS MS Seq in staat te stellen een breder scala aan RNA-monsters direct te sequencen, zullen we ons hier concentreren op de technische aspecten van deze sequencing-benadering en alle essentiële stappen behandelen die nodig zijn bij het toepassen van de techniek op directe sequencing van RNA-monsters. Specifieke voorbeelden zullen worden gebruikt om de sequencingtechniek te illustreren, waaronder synthetische enkelvoudige RNA-sequenties, mengsels van meerdere verschillende RNA-sequenties en gemodificeerde RNA's die zowel canonieke als gemodificeerde nucleotiden bevatten, zoals pseudouridine (ψ) en 5-methylcytosine (m⁵C). Aangezien RNA's allemaal fosfodiësterbindingen bevatten, kan elk type RNA met zuur worden gehydrolyseerd om een ideale sequentieladder te genereren voor 2D-HELS MS Seq onder optimale omstandigheden ^8,9. De detectie van alle ladderfragmenten van een bepaald RNA is echter instrumentafhankelijk. Op een standaard LC-MS met hoge resolutie (40K) is de minimale laadhoeveelheid voor het sequencen van een gezuiverd kort RNA-monster (<35 nt) 100 pmol per run. Er is echter meer materiaal nodig (tot 400 pmol per RNA-monster) wanneer aanvullende experimenten moeten worden uitgevoerd (bijvoorbeeld om isomere basemodificaties te onderscheiden die identieke massa's delen). Het protocol dat wordt gebruikt bij het sequencen van de modelsynthetische gemodificeerde RNA's zal ook van toepassing zijn op het sequencen van bredere RNA-monsters, inclusief biologische RNA-monsters met onbekende basenmodificaties. Er is echter een nog grotere monsterhoeveelheid nodig, zoals 1000 pmol voor het sequencen van tRNA (~76 nt) met behulp van een standaard LC-MS-instrument, om het volledige tRNA met alle wijzigingen te sequencen, en er moet een geavanceerd algoritme worden ontwikkeld voor de novo sequencing¹⁰.

Protocol

1. Ontwerp RNA-oligonucleotiden

1. Ontwerp synthetische RNA-oligonucleotiden met verschillende lengtes (19 nt, 20 nt en 21 nt), waaronder één (RNA #6) met zowel canonieke als gemodificeerde nucleotiden. ψ wordt gebruikt als een model voor niet-massaveranderende modificaties, wat een uitdaging is voor MS-sequencing omdat het een identieke massa heeft als U. m⁵C wordt gekozen als model voor massaveranderende modificaties om de robuustheid van de benadering aan te tonen.
   
   RNA #1: 5'-HO-CGCAUCUGACUGACCAAAA-OH-3'
   RNA #2: 5'-HO-AUAGCCCAGUCAGUCUACGC-OH-3'
   RNA #3: 5'-HO-AAACCGUUACCAUUACUGAG-OH-3'
   RNA #4: 5'-HO-GCGUACAUCUUCCCCUUUAU-OH-3'
   RNA #5: 5'-HO-GCGGAUUUAGCUCAGUUGGGA-OH-3'
   RNA #6: 5'-HO-AAACCGUψACCAUUAm⁵CUGAG-OH-3'
    
2. Los elk synthetisch RNA op in nucleasevrij diethylpyrocarbonaat (DEPC)-behandeld water (uitgedrukt als DEPC-behandeld H₂O, tenzij anders aangegeven) om een 100 mM RNA-stockoplossing te verkrijgen. Voorraadoplossingen worden langdurig bewaard bij -20 °C.
3. Om mogelijke degradatie van RNA-monsters te voorkomen, gebruikt u RNase-vrije experimentele benodigdheden, waaronder DEPC-behandeld water, microcentrifugebuisjes en pipetpunten. Veeg oppervlakken van laboratoriumbenodigdheden regelmatig af met RNase-eliminatiedoekjes.

2. Label het 3'-uiteinde van RNA's met biotine

1. Tweestapsreactieprotocol (adenylatie en ligatie)
   1. Voeg 1 μL 10x adenylatiereactiebuffer bevattende 50 mM natriumacetaat, pH 6,0, 10 mM MgCl₂, 5 mM dichloordifenyltrichloorethaan (DTT), 0,1 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA), 1 μL 1 mM ATP, 1 μL 100 μM gebiotinyleerd cytidinebisfosfaat (pCp-biotine), 1 μL 50 μM Mth RNA-ligase en 6 μL DEPC-behandelde H₂O (een totaal volume van 10 μL) toe aan een RNase-vrije dunwandige PCR-buis van 0,2 ml.
      OPMERKING: Bewaar de reagentia bij -20 °C vóór de tweestapsreactie. Ontdooi de reagentia bij kamertemperatuur en meng goed door vortex en centrifugeren voordat u ze aan de reactie toevoegt.
   2. Incubeer de reactie in een PCR-machine bij 65 °C gedurende 1 uur en inactiveer de reactie bij 85 °C gedurende 5 min.
   3. Voer de ligatiestap uit in een RNasevrije, dunwandige PCR-buis van 0,2 ml die 10 μl reactieoplossing van de vorige stap bevat door 3 μl 10x T4 RNA-ligasereactiebuffer toe te voegen die 50 mM tris(hydroxymethyl)aminomethaan (Tris)-HCl, pH 7,8, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 1,5 μl van de 100 mM monstervoorraad van het RNA waarvan de sequentie moet worden bepaald, toe te voegen; 3 μL watervrij dimethylsulfoxide (DMSO) om 10% (v/v) te bereiken, 1 μL T4 RNA-ligase (10 eenheden/μL) en 11,5 μL DEPC-behandelde H₂O (voor een totaal volume van 30 ml). Incubeer de reactie een nacht bij 16 °C in een PCR-machine.
      OPMERKING: Combineer reactiecomponenten bij kamertemperatuur vanwege het hoge vriespunt van DMSO (18,45 °C).
   4. Incubeer de reactie een nacht bij 16 °C.
   5. Blus en zuiver de reactie door kolomzuivering om enzymen te verwijderen en pCp-biotine vrij te maken met behulp van Oligo Clean & Concentrator (Zymo Research, Irvine, CA, VS). Oligo Binding Buffer, DNA Wash Buffer, spinkolommen en verzamelbuisjes worden meegeleverd in de kit. Voeg 20 ml met DEPC behandelde H₂O toe aan de reactieoplossing om een monstervolume van 50 ml te bereiken voordat de bindingsbuffer wordt toegevoegd.
   6. Voeg 100 ml bindingsbuffer toe aan elke reactieoplossing. Voeg 400 μL ethanol toe, meng door pipetteren en breng het mengsel over naar de kolom. Centrifugeren op 10.000 x g gedurende 30 s. Gooi de doorstroom weg.
   7. Voeg 750 μL DNA Wash Buffer toe aan de kolom. Centrifugeer bij 10.000 x g en maximale snelheid gedurende respectievelijk 30 s en 1 minuut.
   8. Breng de kolom over naar een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Voeg 15 μL DEPC-behandelde H₂O toe aan de kolom en centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 30 s om het RNA-product te elueren.
      OPMERKING: Monsters kunnen in dit stadium bij -20 °C worden bewaard totdat de volgende stap is uitgevoerd.
2. Reactieprotocol in één stap
   1. Voer een eenstaps labelingsreactie uit door 2 μL 150 μM adenosine-5'-5'-difosfaat-{5'-(cytidine-2'-O-methyl-3'-fosfaat-TEG}C-biotine (AppCp-biotine), 3 μL 10x ligasereactiebuffer, 1,5 μL van de 100 mM monstervoorraad van het RNA waarvan de sequentie moet worden bepaald, 3 μL watervrije DMSO om 10% (v/v) te bereiken, 1 μL T4 RNA-ligase (10 eenheden/μL), en 19,5 μl DEPC-behandelde H₂O (voor een totaal volume van 30 ml) in een RNasevrije microcentrifugebuis van 1,5 ml.
   2. Incubeer de reactie een nacht bij 16 °C in een PCR-machine.
   3. Voer kolomzuivering uit zoals hierboven beschreven in stap 2.1.5-2.1.8.
      OPMERKING: Bereid een afzonderlijke/exclusieve reactiebuis voor elk RNA-monster voor (150 pmol-schaal RNA). Labeling van het 5'-uiteinde van de RNA('s) met sulfocyanine3 (Cy3) of Cy3 kan nodig zijn (bv. voor verificatie van bidirectionele sequencing). De methode is anders dan die van 3'-biotinylering en is beschreven in een eerdere publicatie⁹.

3. Leg een gebiotinyleerd RNA-monster vast op streptavidinekorrels

1. Activeer 200 μL streptavidine C1 magneetkralen door 200 μL 1x zwart-wit buffer (5 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl) toe te voegen in een 1,5 ml RNasevrije microcentrifugebuis. Draai deze oplossing en plaats deze 2 minuten op een magneetstandaard. Gooi vervolgens het bovenstaande weg door de oplossing voorzichtig uit te pipetteren.
2. Was de parels twee keer met 200 μl oplossing A (DEPC-behandeld 0,1 M NaOH en DEPC-behandeld 0,05 M NaCl) en eenmaal in 200 μl oplossing B (DEPC-behandeld 0,1 M NaCl). Draai voor elke wasstap de oplossing en plaats deze gedurende 2 minuten op een magneetstandaard, gevolgd door het weggooien van het supernatant. Voeg vervolgens 100 μL 2x zwart-witbuffer toe (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl).
3. Voeg 1x zwart-witbuffer toe aan het gebiotinyleerde RNA-monster tot het volume 100 μl is. Voeg deze oplossing vervolgens toe aan de gewassen korrels die zijn opgeslagen in 100 μL 2x zwart-witbuffer. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op een schommelplateauschudder bij 100 tpm. Plaats de buis 2 minuten op een magneetstandaard en gooi de supernatant weg.
4. Was de gecoate parels 3 keer in 1x zwart-witbuffer en meet de uiteindelijke concentratie van het bovenstaande in elke wasstap met Nanodrop voor herstelanalyse, om te bevestigen dat de doel-RNA-moleculen op de korrels achterblijven.
5. Incubeer de korrels in 10 mM EDTA, pH 8,2 met 95% formamide bij 65 °C gedurende 5 minuten in een PCR-machine. Houd de buis 2 minuten op de magneetstandaard en vang het bovenstaande (met de gebiotinyleerde RNA's die vrijkomen uit de streptavidinekorrels) op door te pipetten.
   OPMERKING: Deze fysieke scheidingsstap voorafgaand aan zuurafbraak wordt alleen gebruikt voor sequentiebepaling van RNA#1 in figuur 1c, en is niet verplicht voor de 2D-HELS MS Seq, aangezien het hydrofobe biotine-label ervoor kan zorgen dat de 3'-gelabelde ladderfragmenten een aanzienlijk vertraagde t_R hebben tijdens LC-MS-meting, waardoor de gelabelde 3'-ladderfragmenten duidelijk kunnen worden onderscheiden van de niet-gelabelde 5'-ladderfragmenten in de 2D mass-t_R-plot .

4. Zure hydrolyse van RNA om MS-ladders te genereren voor sequencing

1. Verdeel elk RNA-monster in drie gelijke aliquots. Verdeel bijvoorbeeld een RNA-monster met een volume van 15 μL RNA-monster in drie aliquots van 5 μL.
2. Voeg een gelijk volume mierenzuur toe om 50% (v/v) mierenzuur in het reactiemengsel te verkrijgen ^8,9.
3. Incubeer de reactie bij 40 °C in een PCR-machine, waarbij één reactie respectievelijk 2 minuten, één 5 minuten en één 15 minuten duurt.
4. Blus de zuurdegradatie door het monster onmiddellijk op droogijs in te vriezen nadat elke reactie is voltooid.
5. Gebruik een centrifugale vacuümconcentrator om het monster te drogen. Het monster wordt doorgaans binnen 30 minuten volledig gedroogd en mierenzuur wordt tijdens het droogproces samen met H₂O verwijderd, omdat mierenzuur een kookpunt (100,8 °C) heeft dat vergelijkbaar is met dat van H₂O (100 °C).
6. suspendeer en combineer in totaal drie gedroogde monsters in 20 μl DEPC-behandelde H₂O voor LC-MS-meting.
   OPMERKING: Monsters kunnen in dit stadium bij -20 °C worden bewaard in afwachting van de LC-MS-meting.

5. Converteer ψ naar CMC-ψ adduct

1. Voeg 80 μl met DEPC behandelde H₂O toe aan een RNasevrije microcentrifugebuis van 1,5 ml die 0,0141 g N-cyclohexyl-Nʹ-(2-morfolinoethyl)-carbodiimide metho-p-tolueensulfonaat (CMC) en 0,07 g ureum bevat. Voeg 10 μL van de 100 μM monstervoorraad van het RNA toe waarvan de sequentie moet worden bepaald, 8 μL 1 M bicine buffer (pH 8,3) en 1,28 μL 0,5 M EDTA. Voeg DEPC-behandelde H₂O toe om een totaal volume van 160 μL te bereiken. De uiteindelijke concentraties zijn 0,17 M CMC, 7 M ureum en 4 mM EDTA in 50 mM bicine (pH 8,3)¹¹.
   OPMERKING: Dit protocol is van toepassing op een enkele synthetische RNA-sequentie of RNA-mengsels.
2. Verdeel de reactieoplossing van 160 μl in vier gelijke hoeveelheden in RNasevrije, dunwandige PCR-buisjes van 0,2 ml en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 °C in een PCR-machine.
   OPMERKING: 50 μL per buisje is het maximale reactievolume dat in een PCR-machine kan worden gebruikt.
3. Blus elke reactie af met 10 μL 1,5 M natriumacetaat en 0,5 mM EDTA (pH 5,6).
4. Voer kolomzuivering uit met vier parallelle spinkolommen om overtollige reactanten te verwijderen volgens de procedure zoals beschreven in de stappen 2.1.5-2.1.8. Los het gezuiverde product op in 15 μl DEPC-behandelde H₂O in elke 1,5 ml RNasevrije microcentrifugebuis.
5. Breng het gezuiverde product over in vier RNase-vrije, dunwandige PCR-buisjes van 0,2 ml. Voeg 20 μL 0,1 M Na₂CO₃ buffer (pH 10,4) toe aan elke 15 μL gezuiverd product en voeg DEPC-behandelde H₂O toe om een eindvolume van 40 μL te maken voor elke reactiebuis (in totaal vier buisjes). Incubeer de reactie gedurende 2 uur bij 37 °C in een PCR-machine.
6. Quen en zuiveren van de reactie door kolomzuivering met vier parallelle spinkolommen zoals beschreven in stap 2.1.5. Elute het CMC-ψ geconverteerde product naar een RNasevrije microcentrifugebuis van 1,5 ml met elk 15 μl DEPC-behandelde H₂O.
7. Combineer het gezuiverde CMC-ψ geconverteerde monster van vier verzamelbuisjes in één buisje. Voer mierenzuurafbraak 50% (v/v) uit volgens de procedures zoals beschreven in stap 4.1-4.6 om MS-ladders te genereren voor sequencing.

6. LC-MS meting

1. Bereid mobiele fasen voor op LC-MS-metingen. Mobiele fase A is 25 mM hexafluor-2-propanol met 10 mM diisopropylamine in water van LC-MS-kwaliteit; mobiele fase B is methanol.
2. Breng het monster over naar de LC-MS-monsterinjectieflacon voor analyse. Elk injectievolume van het monster is 20 μl met 100-400 pmol RNA.
3. Gebruik de volgende LC-omstandigheden: kolomtemperatuur van 35 °C, debiet van 0,3 ml/min; een lineaire gradiënt van 2-20% mobiele fase B over 15 minuten, gevolgd door een wasstap van 2 minuten met 90% mobiele fase B.
   OPMERKING: Voor meer hydrofobe eindlabels zoals Cy3 en sulfo-Cy3 zoals vermeld in sectie 2, kan een hoger percentage organisch oplosmiddel nodig zijn voor de elutie van het monster (d.w.z. een vergelijkbare gradiënt kan worden gebruikt, maar met een verhoogd percentagebereik van mobiele fase B). Bijvoorbeeld, 2-38% mobiele fase B gedurende 30 minuten met een wasstap van 2 minuten met 90% mobiele fase B.
4. Scheid en analyseer monsters op een Agilent Q-TOF (Quadrupole Time-of-Flight) massaspectrometer gekoppeld aan een LC-systeem uitgerust met een autosampler en een MS HPLC-systeem (High Performance Liquid Chromatography). De LC-kolom is een C18-kolom van 50 mm x 2,1 mm met een deeltjesgrootte van 1,7 μm. Gebruik de volgende MS-instellingen: negatieve ionenmodus; bereik, 350 m/z tot 3200 m/z; scansnelheid, 2 spectra/s; drooggasstroom, 17 l/min; temperatuur drooggas, 250 °C; vernevelingsdruk, 30 psig; capillaire spanning, 3500 V; en fragmentorspanning, 365 V. Houd er rekening mee dat deze parameters specifiek zijn voor het type of model van de massaspectrometer die wordt gebruikt.
5. Verkrijg gegevens met Agilent MassHunter-acquisitiesoftware. Gebruik de Agilent moleculaire functie-extractie (MFE) -workflow om samengestelde informatie te extraheren, waaronder massa, retentietijd, volume (de MFE-overvloed voor de respectieve ionensoorten) en kwaliteitsscore, enz. Gebruik de volgende MFE-instellingen: "centroid dataformaat, kleine moleculen (chromatograaf), piek met hoogte ≥ 100, tot een maximum van 1000, kwaliteitsscore ≥ 50".
   OPMERKING: Optimaliseer de MFE-instellingen om zoveel mogelijk potentiële verbindingen te extraheren, tot een maximum van 1000, met kwaliteitsscores van ≥ 50.

7. Automatiseer het genereren van RNA-sequenties door een computationeel algoritme

OPMERKING: Deze procedure wordt alleen getoond voor RNA #1 in figuur 1c.

1. Sorteer MFE-geëxtraheerde verbindingen in volgorde van afnemend volume (piekintensiteit) en t_R. Voer gegevensvoorselectie uit via 1) instelling t_R van 4 tot 10 minuten om de RNA-fragmenten te selecteren die door het biotine zijn gelabeld, aangezien de t_Rs van de biotine-gelabelde massaladdercomponenten worden verschoven naar_{dit TR-venster} (4 minuten tot 10 min), en 2) met behulp van een orde van grootte hoger van invoerverbindingen dan het aantal ladderfragmenten voor algoritmeberekening om de gegevenshoeveelheid te verminderen op basis van volume. Voor een 20 nt RNA zijn bijvoorbeeld 20 gelabelde massa-t_{R-laddercomponenten} nodig voor de sequentiebepaling van het 20 nt RNA, en dus worden 200 verbindingen uit het MFE-gegevensbestand geselecteerd op basis van volume. Houd er rekening mee dat het_TR-venster kan afwijken wanneer een ander type of model massaspectrometer wordt gebruikt.
2. Voer gegevensverwerking en sequentiegeneratie van RNA #1 uit met behulp van een herziene versie van een gepubliceerd algoritme⁸. De broncodes van het herziene algoritme zijn eerder beschreven (https://academic.oup.com/nar/article/47/20/e125/5558343#supplementary-data)⁹.
3. Naast het automatiseren van het genereren van sequenties met behulp van het algoritme, berekent u handmatig de massaverschillen tussen twee aangrenzende laddercomponenten voor basisoproepen. Alle basen in het RNA kunnen handmatig worden aangeroepen en vergeleken met de theoretische basen in de RNA-nucleotide- en modificatiedatabase⁸; zo kan de volledige sequentie van de RNA-streng nauwkeurig handmatig worden uitgelezen, wat wordt gebruikt om de nauwkeurigheid van de door het algoritme gerapporteerde sequentie te bevestigen. Meer structuren van RNA-modificaties zijn te vinden in RNA-modificatiedatabases¹², en de bijbehorende theoretische massa's worden verkregen door ChemBioDraw. In de tabellen S1-S2 wordt het massaverschil van ppm (parts per million) weergegeven bij het vergelijken van de waargenomen massa met de theoretische massa voor een specifieke laddercomponent, en een waarde van minder dan 10 ppm wordt beschouwd als een goede overeenkomst voor elke basisaanroeping.

8. Sequencing RNA-mengsels

1. Label een mengsel van vijf RNA-strengen (RNA #1 tot #5) aan hun 3'-uiteinden met A(5')pp(5')Cp-TEG-biotine met behulp van een eenstapsprotocol beschreven in stap 2.2. Voeg in een totaal volume van 150 μl reactieoplossing 15 μl 10x T4 RNA-ligasereactiebuffer, 1,5 μl van elke RNA-streng (100 μM voorraad RNA #1 tot #5 respectievelijk voor een totaal volume van 7,5 μl), 10 μl 150 μM A(5')pp(5')Cp-TEG-biotine, 15 μl watervrije DMSO toe, 5 μL T4 RNA-ligase (10 eenheden/μL) en 97,5 μL DEPC-behandelde H₂O. Verdeel de reactieoplossing gelijkmatig over vijf aliquots. Elke RNasevrije microcentrifugebuis bevat 30 μL reactieoplossing.
2. Incubeer de reactie een nacht bij 16 °C in een PCR-machine.
3. Voer de kolomzuivering uit volgens de procedure zoals beschreven in de stappen 2.1.5-2.1.8 met vijf parallelle spinkolommen. Elute een mengselmonster van 3'-gebiotinyleerde 5 RNA-strengen (mengsel van RNA #1 tot #5) in een RNasevrije microcentrifugebuis van 1,5 ml met elk 15 μL DEPC-behandelde H₂O.
4. Combineer de gezuiverde mengselmonsters uit de vijf verzamelbuisjes in één buisje. Voer de afbraak van mierenzuur uit volgens de procedure beschreven in hoofdstuk 4.
5. Meet monsters met LC-MS zoals beschreven in sectie 6 en analyseer de gegevens met behulp van de gegevensanalysesoftware met geoptimaliseerde MFE-instellingen om gegevens te extraheren die massa, t_R en volume bevatten, zoals beschreven in stap 6.5. Het typische verwerkings- en base-calling-algoritme wordt niet toegepast vanwege de aanzienlijk verhoogde gegevenscomplexiteit als gevolg van het mengsel. Alle basen in het RNA van het gemengde monster worden handmatig aangeroepen op een manier die vergelijkbaar is met sectie 7.3 en komen goed overeen met de theoretische basen in de RNA-nucleotide- en modificatiedatabase⁸, zodat de volledige sequenties van alle vijf RNA-strengen in het gemengde monster nauwkeurig worden uitgelezen. In de tabellen S7-S11 wordt alle informatie vermeld, inclusief waargenomen massa, t_R, volume, kwaliteitsscore en verschil in ppm-massa.

Resultaten

Introductie van een biotine-tag aan het 3'-uiteinde van RNA om gemakkelijk identificeerbare massa-t_R-ladders te produceren. De workflow van de 2D-HELS MS Seq-aanpak wordt gedemonstreerd in figuur 1a. Het hydrofobe biotine-label dat aan het 3'-uiteinde van het RNA wordt geïntroduceerd (zie sectie 2) verhoogt de massa's en t_Rs van de 3'-gelabelde laddercomponenten in vergelijking met die van hun niet-gelabelde tegenhanger...

Discussie

In tegenstelling tot tandemgebaseerde MS-fragmentatie, wordt sterk gecontroleerde zure hydrolyse gebruikt in de 2D-HELS MS Seq-benadering om het RNA te fragmenteren vóór analyse met een massaspectrometer ^9,10. Als gevolg hiervan kan elk door zuur afgebroken fragment door het instrument worden gedetecteerd, wat het equivalent vormt van een sequentieladder. Onder optimale omstandigheden creëert deze methode een "ideale" sequentiela...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
5' DNA Adenylation kit	New England Biolabs	E2610S	50uM concentratie
6550 Q-TOF massaspectrometer	Agilent Technologies	5991-2116EN	Gekoppeld aan een 1290 Infinity LC-systeem
A(5´)pp(5´)Cp-TEG-biotine-3´	ChemGenes	91718	HPLC gezuiverd
ATPγS	Sigma-Aldrich	11162306001	Lithiumzout
Bicine	Sigma-Aldrich	B8660	BioXtra, ≥99% (titratie)
Biotine maleïmide	Vector Laboratories	SP-1501	Lange arm
C18 kolom	Waters	186003532	50 mm × 2.1 mm Xbridge C18 kolom met een deeltjegrootte van 1.7 μm
Centrifugale vacuüm concentrator	Labconco	Refrig 115v/60hz 7310022	Labconco CentriVap
ChemBioDraw	PerkinElmer	ChemDraw Prime	Genereer een chemische structuur en eigenschapsgegevens van structuren & fragmenten
CMC (N-cyclohexyl-N?-(2-morpholinoethyl)-carbodiimide methop-tolueensulfonaat)	Sigma-Aldrich	2491-17-0	95% gezuiverd
Cyanine3 maleïmide (Cy3)	Lumiprobe	11080	In water onoplosbaar
DEPC-behandeld water	Thermo Fisher Scientific	AM9906	Autoclaved, gecertificeerd nuclease-vrij
Diisopropylamine (DIPA)	Thermo Fisher Scientific	108-18-9	99% Alfa Aesar
DMSO	Sigma-Aldrich	276855	Watervrij dimethylsulfoxide, 99.9%
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758	Watervrij, kristallijn, BioReagent, geschikt voor celkweek
Formic acid	Merck	64-18-6	98-100%, ACS reag, Ph Eur
Hexafluoro-2-propanol (HFIP)	Thermo Fisher Scientific	920-66-1	99% Acros Organics
LC-MS monstervialen	Thermo Fisher Scientific	C4000-11	Kunststof schroefdraadvialen
LC-MS viaaldeksels	Thermo Fisher Scientific	C5000-54A	Schroefdraadkapjes voor autosamplervialen
Na2CO3 buffer	Sigma-Aldrich	88975	BioUltra, >0.1 M Na2CO3, >0.2 M NaHCO3
Oligo Clean & Concentrator	Zymo Research	D4060	Spinkolom
OriginLab	OriginLab	OriginPro	Software voor data-analyse en grafieken
pCp-biotine	TriLink BioTechnologies	NU-1706-BIO	20 ul (1 mM)
RNA #1--#6	Integrated DNA Technologies	Custom RNA oligos	19nt-21nt enkelstrengse RNA's, gebruikt zonder verdere zuivering
Schommelend platform schudder	VWR	Orbital Shaker Standard 1000	Snelheidsbereik 40 tot 300 rpm
Streptavidine magnetische kralen	Thermo Fisher Scientific	88816	Binding van ongeveer 55ug biotinyleren konijn lgG per mg kralen
Sulfonaat Cyanine3 maleïmide	Lumiprobe	11380	In water oplosbaar
T4 DNA ligase 1	New England Biolabs	M0202S	400 eenheden/uL
T4 polynucleotide kinase	Sigma-Aldrich	T4PNK-RO	Van faag T4 am N81 pse T1 geïnfecteerd Escherichia coli BB
Tris-HCl buffer	Sigma-Aldrich	T6455	Tris-HCl-buffer, pH 10, 10×, antigeen retriever
Urea	Sigma-Aldrich	81871	Urea voor synthese. CAS-nr. 57-13-6, EC-nummer 200-315-5.