Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Culturing Rat Sympathische Neuronen van Embryonale Superior Cervicale Ganglia voor morfologische en proteomische analyse

7.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61283

⸱

27 september 2020

 ,  , 
1Department of Biology, Saint Mary's College of California

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel beschrijft de isolatie en het kweken van embryonale rat sympathische neuronen van de superieure cervicale ganglia. Het biedt ook gedetailleerde protocollen voor immunocytochemische kleuring en voor de voorbereiding van neuronale extracten voor massaspectrometrische analyse.

Samenvatting

Sympathische neuronen van de embryonale rat superieure cervicale ganglia (SCG) zijn gebruikt als een in vitro model systeem voor perifere neuronen om axonale groei, axonale handel, synaptogenese, dendritische groei, dendritische plasticiteit en zenuw-doel interacties in co-cultuur systemen te bestuderen. Dit protocol beschrijft de isolatie en dissociatie van neuronen van de superieure cervicale ganglia van E21 rat embryo's, gevolgd door de voorbereiding en het onderhoud van zuivere neuronale culturen in serum-vrij medium. Aangezien neuronen zich niet houden aan ongecoat plastic, neuronen zullen worden gekweekt op 12 mm glazen coverslips of 6-well platen bekleed met poly-D-lysine. Na behandeling met een antimitotisch middel (Ara-C, cytosine β-D-arabinofuranoside), genereert dit protocol gezonde neuronale culturen met minder dan 5% niet-neuronale cellen, die meer dan een maand in vitro kunnen worden gehandhaafd. Hoewel embryonale rat SCG neuronen multipolair zijn met 5-8 dendrieten in vivo; onder serumvrije omstandigheden breiden deze neuronen slechts één axon in de cultuur uit en blijven unipolair voor de duur van de cultuur. Echter, deze neuronen kunnen worden geïnduceerd om dendrieten uit te breiden in de aanwezigheid van kelder membraan extract, bot morfogenetische eiwitten (BMPs), of 10% foetale kalf serum. Deze homogene neuronale culturen kunnen worden gebruikt voor immunocytochemische kleuring en voor biochemische studies. Dit artikel beschrijft ook geoptimaliseerd protocol voor immunocytochemische kleuring voor microtubuli geassocieerde eiwit-2 (MAP-2) in deze neuronen en voor de voorbereiding van neuronale extracten voor massaspectrometrie.

Inleiding

Sympathische neuronen afgeleid van embryonale superieure cervicale ganglia (SCG) zijn op grote schaal gebruikt als een primaire neuronale cultuur systeem voor het bestuderen van vele aspecten van de neuronale ontwikkeling, waaronder groeifactor afhankelijkheid, neuron-target interacties, neurotransmitter signalering, axonale groei, dendriet ontwikkeling en plasticiteit, synaptogenese en signalering mechanismen die ten grondslag liggen aan nerve-target / neuron-glia interacties1,2,3,,4,5,6,7,8,9. Ondanks hun kleine omvang (ongeveer 10000 neuronen / ganglia), zijn er drie belangrijke redenen voor de ontwikkeling en uitgebreid gebruik van dit cultuursysteem zijn i) zijn de eerste ganglia in de sympathieke keten, ze zijn groter, en dus gemakkelijker te isoleren, dan de rest van de sympathieke ganglia10; ii) in tegenstelling tot centrale neuronen, de neuronen in de SCG zijn vrij homogeen met alle neuronen worden afgeleid van de neurale kam, met een vergelijkbare grootte, afhankelijkheid van zenuwgroei factor en wordt noch-adrenerge. Dit maakt ze een waardevol model voor morfologische en genomische studies10,11 en iii) deze neuronen kunnen worden gehandhaafd in een gedefinieerd serum-vrij medium met zenuwgroeifactor voor meer dan een maand10,12. Perinatale SCG neuronen zijn op grote schaal gebruikt voor het bestuderen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de initiatie en het onderhoud van dendrieten2. Dit komt vooral omdat, hoewel SCG neuronen hebben een uitgebreide dendritische prieel in vivo, ze niet uit te breiden denndrites in vitro in de afwezigheid van serum, maar kan worden geïnduceerd om denndrites groeien in aanwezigheid van bepaalde groeifactoren zoals bot morfogenetische eiwitten2,12,13.

Dit artikel beschrijft het protocol voor het isoleren en kweken van embryonale rat SCG neuronen. In de afgelopen 50 jaar zijn primaire neuronale culturen van de SCG voornamelijk gebruikt voor morfologische studies met een beperkt aantal studies die de grootschalige genomische of proteomische veranderingen onderzoeken. Dit is voornamelijk te wijten aan kleine weefselgrootte resulterend in de isolatie van lage hoeveelheden DNA of eiwit, waardoor het moeilijk is om genomische en proteomische analyses uit te voeren op deze neuronen. In de afgelopen jaren heeft de toegenomen detectiegevoeligheid echter de ontwikkeling van methoden mogelijk gemaakt om het genoom, miRNome en proteoom in de SCG-neuronen te onderzoeken tijdens de dendritische groeiontwikkeling14,15,16,17. Dit document zal ook de methode beschrijven voor morfologische analyse van deze neuronen met behulp van immunocytochemie en een protocol om neuronale eiwitextracten te verkrijgen voor massaspectrometrische analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures uitgevoerd in studies met betrekking tot dieren werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) op Saint Mary's College of California. De richtlijnen voor dierverzorging en -gebruik van het Saint Mary's College zijn ontwikkeld op basis van de richtlijnen van het Office of Laboratory Animal Welfare van het National Institute for Health (https://olaw.nih.gov/sites/default/files/PHSPolicyLabAnimals.pdf en https://olaw.nih.gov/sites/default/files/Guide-for-the-Care-and-Use-of-Laboratory-Animals.pdf).

1. Voorbereiding van cultuurmedia (ook wel bestrijdingsmedium genoemd)

  1. Voeg in onderstaande volgorde de volgende ingrediënten toe aan een steriele kolf van 500 mL: 190 mL 1x low-glucose DMEM, 10 mL van 20 mg/mL vetzuurvrij runderserum albumine (FAF-BSA) in DMEM, 2,8 mL van 200 mM L-glutamine, 4 mL van 100x insuline-selenium-transferrine mengsel, 0,4 mL van 125 μg/mL zenuwgroeifactor (in 0,2% inert eiwitstabilisator in DMEM), en 200 mL van Ham's F-12 medium.
  2. Zorg ervoor dat u de pipet bedekt met het medium dat FAF-BSA bevat voordat eiwithoudende oplossingen zoals insuline-selenium-transferrine en NGF worden gebruikt om het plakken van eiwitten aan de pipet te voorkomen.
  3. Draai de kolf om de ingrediënten te mengen na elke toevoeging. Meng grondig met een 25 mL pipet na toevoeging van F-12.
  4. Aliquot de cultuurmedia in 10 mL aliquots en opslag bij -80 °C. De aliquots kunnen gedurende zes maanden worden bewaard zonder verlies van activiteit.

2. Bereiding van platen voor het kweken van neuronen

  1. Verdun een 1 mg/mL-voorraad poly-D-lysine (gemaakt in 0,5 M Tris-buffer, pH 8) tot 100 μg/mL met steriel gedestilleerd water.
  2. Voor proteomische of genomische analyse, een tot twee dagen voor de dissectie, jas 6-well platen met ongeveer 2 mL steriele 100 g/mL van poly-D-lysine (PDL). Dit is nodig om te zorgen voor celhechting aan de put. Wikkel de platen met plakfolie en bewaar de platen 's nachts op 4 °C.
  3. Voor morfologische analyse en microscopie plaatst u 12 mm2 voorbehandelde Duitse glazen covers (die met behulp van salpeterzuurbehandeling zoals eerder beschreven18 of gekocht) in elk van de putten van een 24-putplaat kunnen worden gereinigd.
    1. Bekleed de coverslips met 0,3 mL steriele 100 g/mL poly-D-lysine (PDL). Bewaar de platen 's nachts op 4 °C.
  4. Op de dag van de dissectie, vóór het begin van de dissectie, verwijder de poly-D-lysineoplossing uit de putten en spoel de putten vijf keer af met steriel gedestilleerd water, gevolgd door één keer met een lage glucose DMEM.
  5. Tijdens de enzymatische vertering van de ganglia (ongeveer een uur voor het platbeteren van de cellen), de DMEM uit de platen aanzuigen en vervangen door 0,3 mL controlemedia. Bewaar de platen op 35,5 °C onder 5% CO2 in een bevochtigde kamer.

3. Ontledingsopstelling

  1. Voorbereiding van 200 mL media voor dissectie (aangeduid als Dissectie media)
    1. Voeg 8 mL van 20 mg/mL vetzuurvrij runderserum albumine (FAF-BSA) toe aan low glucose DMEM (met 1 mg/mL glucose) en 2 mL van 100x penicilline-streptomycine tot 193 mL steriele Leibovitz's L-15 medium (of een luchtbufferd medium)
  2. In de motorkap, het opzetten van de volgende items voor dissectie: vier 50 mL steriele kegelvormige buizen met ongeveer 20 mL van dissectie media in elke buis, vier steriele 35 mm gerechten met 1,5 mL dissectie media, een steriele 50 mL kegelvormige buis met 20 mL dissectie media voor centrifugatie, een steriele 15 mL conische buis voor centrifing de ganglia , en een steriele buis van 10 mL voor het verzamelen van de gescheiden cellen.
  3. Gebruik een droge kraal sterilisator om een paar fijne tangen (nr.4 of nr. 5 tang) gedurende ten minste één minuut te steriliseren.

4. Isolatie van de superieure cervicale ganglia van embryonale rattenpups

  1. Verwijdering van E21 embryo's van de drachtige rat
    OPMERKING: Verwijdering van de baarmoederhoorn kan buiten de kap worden uitgevoerd als de omgeving grondig wordt gesteriliseerd.
    1. Euthanaseer de zwangere2 rat met CO 2-inademing. Schuif de vacht uit de buikstreek en veeg de huid in het gebied af met 70% alcohol om het te steriliseren.
    2. Met behulp van een verse set steriele scharen en tangen, snijd door de huid en vervolgens de spierlaag om de baarmoeder hoorns met de embryo's bloot te stellen. Verwijder de baarmoederhoorns met de embryo's met behulp van een nieuwe set schaar en tangen, waarbij ervoor wordt gezorgd dat de darmen daarbij niet worden beschadigd.
    3. Breng de baarmoederhoorns met de embryo's in een 150 mm2 steriele petrischaal en breng ze in de kap.
    4. Verwijder met behulp van een nieuwe set tangen en scharen de embryo's uit de baarmoederhoorn en scheid de embryo's van de vruchtwatermembranen en de placenta.
    5. Om de embryo's te euthanaseren, snijd het ruggenmerg van de embryo's langs de middellijn onder de rechterarm. Dit zal ook het bloeden van de halsslagader tijdens het verwijderen van de SCG verminderen.
    6. Breng deze embryo's over in de bereide conische buizen van 50 mL met dissectiemedia. Zorg ervoor dat de embryo's in de media worden ondergedompeld. Elke buis kan maximaal 3 embryo's bevatten.
  2. Isolatie van het superieure cervicale ganglion van het embryo
    1. Breng één pup van de dissectiemedia over op een steriele 150 mm2 Petri schotel half gevuld met massief substraat (paraffinewas of siliconenpolymeer), met zijn dorsale oppervlak op het substraat. Met behulp van drie steriele 23 G naalden, pin de pup aan de schotel met een naald onder elke arm en een derde naald door de mond om zorgvuldig hyperextend de nek.
    2. Snijd door de huid in het nekgebied met behulp van steriele fijne tangen (nr. 4 of nr. 5 tangen) om de speekselklieren eronder bloot te leggen. Verwijder deze klieren met behulp van fijne tangen.
    3. Zoek de sternocleidomastoïde en omohyoïde spieren in de buurt van het sleutelbeen en luchtpijp, respectievelijk. Snijd eerst de dwarse sternocleidomastoïde spieren en snijd vervolgens zorgvuldig de dunne omohyoïde spier met fijne tangen. Zodra deze spieren zijn verwijderd, zal de splitsing in de halsslagader aan het voorste uiteinde zichtbaar zijn aan weerszijden van de luchtpijp, met de SCG onder deze vork in de halsslagader.
    4. Til met gesloten tangen voorzichtig de halsslagader op om de SCG te visualiseren. Met behulp van een tang aan weerszijden van de SCG, trek de halsslagader en breng het naar de bereide steriele 35 mm2 gerechten. Dit weefsel zal waarschijnlijk bevatten de SCG met de halsslagader, de nervus vagus met de nodose ganglia evenals andere segmenten van spier of vet in het gebied.
    5. Herhaal het dissectieproces aan de andere kant. Verwijder SGT's uit alle embryo's voordat u verdergaat met de resterende dissectiestappen die hieronder worden beschreven. Verdeel de geïsoleerde weefsels over twee van de 35 mm2 gerechten om de verwerking van de weefselmonsters te vergemakkelijken.
  3. Nabewerking van SCG
    1. Om de SCG te scheiden van het ontleed weefsel, eerst gebruik maken van fijne tangen om eventuele vreemde weefsels te verwijderen, zoals vet of spieren, het verzorgen van het gebied in de buurt van de halsslagader te voorkomen.
    2. Zodra deze weefsels zijn verwijderd, zijn twee ganglia zichtbaar. De nodose ganglion is kleiner en cirkelvormig, terwijl de SCG amandelvormig is. Trek voorzichtig aan de nervus vagus om de nervus vagus en nodose ganglia van de halsslagader te scheiden en vervolgens de SCG te scheiden van de halsslagader.
    3. Gebruik fijne tangen om de capsule die de SCG omringt te verwijderen. Breng de SCG over op een nieuw 35 mm cultuurgerecht. Herhaal het proces met alle ontleed weefselmonsters.
    4. Bedek een gesteriliseerde, katoenen aangesloten glazen pipet met ontledingsmedia om te voorkomen dat het weefsel zich aan de pipetwanden vastkleven. Gebruik de pipet om de dissectiemedia te vervangen door steriele 2 mL collagenase type II (1 mg/mL)/dispase type II (5 mg/mL) in calcium- en magnesiumvrije HBSS, en incubeer gedurende 50 min bij 37 °C om de weefsels te helpen afbreken.
      OPMERKING: De incubatietijd kan nodig zijn om te worden geoptimaliseerd met verschillende partijen Collagenase / Dispase en varieert meestal van 40 min tot een uur.
    5. Tijdens de incubatie, aspirate de DMEM van de platen en vervang het door 0,3 mL van de controle media. Bewaar de platen op 35,5 °C onder 5% CO2 in een bevochtigde kamer.
    6. Breng na de incubatie de SGT's in collagenase/dispase over naar een steriele conische buis van 15 mL. Gebruik de dissectiemedia om de platen te spoelen en de oplossing over te brengen naar de buis. Voeg voldoende dissectiemedia toe om het volume tot ongeveer 10 mL te brengen.
    7. Centrifuge bij 200 x g (1000 - 1200 rpm) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om het monster te pelleteren. Aspirate de supernatant, het verzorgen van niet verjagen van de pellet. Resuspend de pellet met 10 mL van dissectie media. Herhaal de centrifugatie en gooi de supernatant weg.
    8. Vervangen door 1 - 2 mL cultuurmedium. Met behulp van een smal-bore, gebogen-tip steriele pasteur pipet (voorgecoat met cultuurmedium), mechanisch scheiden van de klonten door zachtjes triturating 5-6 keer. Laat de grotere klonten genoegen nemen met ongeveer een minuut. Breng de supernatant celsuspensie over naar een nieuwe 10 mL buis.
    9. Herhaal dit proces nog 3 keer, met toenemende kracht van trituratie elke keer om te zorgen voor bijna volledige dissociatie van de SCGs. Breng de supernatant na elke ronde van trituratie naar een 10 mL buis met de supernatant van de eerste trituratie.
    10. Voeg voldoende cultuurmedia toe om het volume op te brengen tot 8 - 10 mL. Meng voorzichtig de celsuspensie en kwantificeer de celdichtheid met een hemocytometer.
    11. Verdeel de celsuspensie in de putten bij de aangewezen celdichtheid voor de experimenten. Meng de celsuspensie voortdurend tijdens het beplatingsproces om een gelijkmatige verdeling van cellen in de putten te garanderen.
      OPMERKING: Voor morfologische analyse, plaat de cellen rond 8.000 cellen / goed in een 24 put platen en voor genomische en proteomische protocollen, plaat de cellen zo hoog als 30.000 cellen / goed.
    12. Breng de platen over op een glazen desiccator met steriel water aan de onderkant om een bevochtigde kamer te creëren. Injecteer voldoende CO2 (ongeveer 120 mL) om een 5% CO2-omgeving in de desiccator te verkrijgen, voorafgaand aan het afdichten. Houd de platen op 35,5 °C. Dit wordt in het protocol dag 0 genoemd.
      LET OP: Deze platen kunnen ook worden onderhouden in een reguliere 5% CO2 incubator. De hierboven beschreven methode minimaliseert temperatuur- en pH-veranderingen en helpt ook kruisbesmetting te voorkomen.

5. Onderhoud van de gekweekte SCG neuronen en behandelingen

  1. Verwijder op dag 1 (24 uur na het beplating) voorzichtig de helft van de kweekmedia en vervang deze door 2 μM Ara-C (cytosine β-D-arabinofuranoside, een anti-mitotisch middel). Laat de behandeling 48 uur op de cellen staan. Meestal is deze duur van de behandeling voldoende om niet-neuronale cellen in de cultuur te elimineren.
  2. Op dag 3, zachtjes aspirate de helft van het medium en vervangen door controlemedium.
  3. Op dag 4 zijn de cellen klaar voor experimentele behandelingen. Voer culturen om de andere dag met het juiste medium, voorzichtig ter vervanging van de helft van het medium in de put met vers medium.
  4. Gekweekte SCG-neuronen in serumvrij medium breiden alleen axonen uit. Als experimenten de aanwezigheid van dendrieten vereisen, behandel cellen dan met 10% foetaal kalfsserum, 75-100 μg/mL keldermembraanmatenextract of 50 ng/mL botmorfogenetisch eiwit-7. Dendritische groei wordt waargenomen binnen 48 uur na de behandeling met uitgebreide dendritische prieel waargenomen binnen een week na de behandeling.

6. Immunostaining gekweekte SCG neuronen

  1. Vervang geleidelijk het celkweekmedium in de put door 4% paraformaldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer, pH 7.2 in een rookkap.
    1. Verwijder de helft van de cultuurmedia in de put en vervang deze voorzichtig door 4% paraformaldehyde. Herhaal het proces vervolgens nog minstens twee keer, verwijder telkens twee derde van de media in de put en vervangt het met 4% paraformaldehyde. Aan het einde van dit proces, de kleur van de media in de put moet zijn veranderd van roze naar kleurloos.
    2. Zodra al het medium is vervangen door 4% paraformaldehyde, incubeer de putten voor 15 - 20 minuten bij kamertemperatuur.
  2. Met een vergelijkbaar proces zoals hierboven beschreven, geleidelijk vervangen van de 4% paraformaldehyde oplossing met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7.2. Laat 5 minuten staan. Spoel de putten nog twee keer gedurende 5 minuten met PBS.
    1. Zodra de 4% paraformaldehyde is verwijderd, verplaats de platen naar het bankje voor verdere verwerking. Deze stap is een goed stoppunt waar platen 's nachts bij 4 °C kunnen worden opgeslagen.
  3. Verwijder alle PBS. Voeg voldoende volume van 0,1% Triton X-100 in PBS toe om de cellen te bedekken. Laat het op de culturen voor 5 minuten om de neuronen permeabiliseren. De timing van deze stap is van cruciaal belang om een goede kleuring te garanderen met behoud van de integriteit van de cellen.
  4. Verwijder de Triton X-100-oplossing voorzichtig en spoel de putten telkens 5 minuten af met PBS. Verwijder de PBS-oplossing.
  5. Voeg voldoende 5% BSA in PBS toe om de cellen te bedekken en 20 minuten bij kamertemperatuur uit te broeden om niet-specifieke antilichaambinding te verminderen.
  6. Verwijder de blokkerende oplossing en vervang deze door een monoklonal antilichaam van de muis tegen MAP-2-eiwit verdund in 5% BSA in PBS. Laat het primaire antilichaam 's nachts op de cellen bij 4 °C.
  7. Verwijder en bewaar het primaire antilichaam voor hergebruik. Het primaire antilichaam kan ten minste tweemaal worden hergebruikt zonder verlies van detectieintensiteit.
  8. Spoel drie keer met voldoende PBS om de cellen te bedekken. Laat PBS 10 minuten per spoeling op de cellen staan.
  9. Verwijder de PBS-oplossing en vervang deze door fluorescerende tag-conjugated Goat anti-Mouse IgG secundaire antilichaam bij 1:1000 verdunning in 5% BSA in PBS. Incubeer gedurende 2 uur in het donker bij kamertemperatuur.
  10. Verwijder het secundaire antilichaam en vervang het door PBS. Spoel de putten drie keer af met PBS gedurende 10 minuten per spoeling. Spoel de putten een keer met water om zouten te verwijderen.
  11. Monteer de coverslips op glazen platen met een druppel waterige mountant die geschikt is voor fluorescerende monsters. Bewaar de dia's op 4 °C, in een diamap tot ze klaar zijn voor beeldvorming.

7. Monstervoorbereiding voor analyse van het proteoom met behulp van vloeibare chromatografie in combinatie met massaspectrometrie

  1. Lysis van gekweekte neuronen
    1. Verwijder voorzichtig alle cultuurmedia in de putten. Vervang het door koud, steriel calcium en magnesiumvrije fosfaatvrije zoutoplossing (PBS), pH 7.4. Verwijder snel en vervang met PBS en laat het zitten voor 5 min. Deze stap wordt gedaan om alle eiwitten aanwezig in de cultuur media te verwijderen.
    2. Verwijder voorzichtig alle PBS uit alle putten voor een bepaalde behandeling. Herhaal het proces nog een keer. Onderhoud platen boven ijs bij het lysing van de cellen om neuronale schade en proteolyse te minimaliseren.
    3. Voeg 100 - 150 μL van 50 mM ammoniumbicarbonaat, pH 7.5 (NH4HCO3) toe aan een van de putten en schraapcellen met behulp van een steriele celschraper. Breng met behulp van een micropipet de vloeistof over en herhaal het schraapproces met alle putten voor een bepaalde behandeling. Bestudeer de putten onder de microscoop na het schrapen om ervoor te zorgen dat de meeste cellen zijn verwijderd.
      1. Met het lage aantal neuronen, gebruik een beperkt volume om de cellen lyse om te zorgen voor een hoog genoeg concentratie voor proteomische analyse.
    4. Bevries de oplossing 's nachts bij -80 °C om te helpen met cellyse. De lysates kunnen in dit stadium worden opgeslagen tot klaar voor verdere verwerking.
    5. Eenmaal ontdooid spuit u de monsters door een spuit met een naald van 26 G of 28 G om de cellen mechanisch te lyse.
    6. Sonicate de monsters in een sonicating water bad twee keer gedurende 10 minuten. Voeg ijs toe aan het waterbad om oververhitting en denaturatie van eiwitten te voorkomen. Centrifuge gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 12.000 x g.
    7. Meet de eiwitconcentratie. Typische eiwitconcentraties variëren van 0,4 - 1 μg/μL
  2. Monstervoorbereiding en trypsinevertering voor proteomeanalyse
    1. Breng maximaal 60 μL van het lysaat of 50 μg eiwit over in een DNase-, RNase- en protease-vrije 1,5 mL buis. Als het volume van het lysaat minder dan 60 μL is, voeg dan voldoende ammoniumbicarbonaat van 50 mM toe om het volume te vormen.
    2. Voeg 25 μL van 0,2% zuur labile oppervlakteactieve en vortex toe. Incubeer de buis in een blokverwarming bij 80 °C gedurende 15 minuten. Centrifuge de buis op 12.000 x g voor 30 s.
    3. Voeg 2,5 μL van 100 mM dithiothreitol en vortex toe. Dit maakt het eiwit toegankelijker voor alkylation en spijsvertering. Broed de buis 30 minuten in een blokverwarming in een blokverwarming. Koel af tot kamertemperatuur en centrifuge.
    4. Voeg 2,5 μL van 300 mM iodoacetamide toe aan het monster en de vortex. Deze stap helpt om de cysteines te alkylaat en voorkomt dat ze de disulfide obligaties hervormen. Broed de buizen 30 minuten in het donker op kamertemperatuur.
    5. Voeg massaspectrometrie kwaliteit trypsine (0,5 μg/μL) aan de buis bij een trypsine: eiwit verhouding van 1:10. Verteren de monsters op 37 °C 's nachts.
    6. Voeg 10 μL trifluoroacetisch zuur (TFA) en vortex toe. Incubeer de monsters 90 minuten bij 37 °C. Deze stap is nodig om de zure labiele oppervlakteactieve stof hydrolyseren om interferentie tijdens massaspectrometrie te voorkomen.
    7. Centrifugeren de monsters op 12.000 x g bij 4 °C gedurende 30 minuten en breng supernatant over naar een chromatografie gecertificeerd helder glas flacon met voorgesneden Teflon/Siliconen septumdoppen. Monsters kunnen worden opgeslagen bij -20 °C voorafgaand aan massaspectrometrieanalyse.
    8. Onderwerp de monsterfolken aan vloeibare chromatografie in combinatie met high definition massaspectrometrie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het isoleren en onderhouden van neuronale culturen van embryonale SCG-neuronen
Gescheiden cellen van de rat embryonale SCG werden verguld in een poly-D-lysine gecoate plaat of coverslip en onderhouden in serum vrije kweekmedia met b-zenuw groeifactor. De gescheiden cellen met een mengsel van neuronen en gliacellen zien er cirkelvormig uit op beplating(figuur 1A). Binnen 24 uur na beplating breiden de neuronen kleine axonale processen uit met gliacellen die afvlakken en fa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit artikel beschrijft de protocollen voor het kweken van sympathische neuronen van superieure cervicale ganglia van embryonale rattenpups. De voordelen van het gebruik van dit model systeem zijn dat het mogelijk is om een homogene populatie van neuronen die een vergelijkbare reactie op groeifactoren te verkrijgen, en aangezien de groeifactor eisen voor deze neuronen is goed gekarakteriseerd, is het mogelijk om deze neuronen groeien in vitro in gedefinieerde media, onder serum-vrije omstandigheden10

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de Faculty Development Fund en Summer Research Program subsidie aan Saint Mary's College of California. De auteurs willen ook dr. Pamela Lein aan de Universiteit van Californië in Davis en Dr. Anthony Iavarone aan de UC Berkeley Mass spectrometrie faciliteit bedanken voor hun advies tijdens de ontwikkeling van deze protocollen. De auteurs willen haley Nelson ook bedanken in het Office of College Communications aan het Saint Mary's College of California voor haar hulp bij videoproductie en -bewerking.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2D nanoACQUITYWaters Corporation
Ammonium bicarbonateSigma-Aldrich9830
BMP-7R&D Systems354-BP
Bovine Serum AluminSigma-Aldrich5470
Cell scraperCorningCLS-3010
CollagenaseWorthington Biochemical4176
Corning Costar or Nunc Flat bottomed Cell culture platesFisher Scientific07-200, 140675, 142475
Cytosine- β- D-arabinofuranosideSigma-AldrichC1768
D-phosphate buffered saline (Calcium and magnesium free)ATCC30-2200
Dispase IIRoche4942078001
Distilled WaterThermo Fisher Scientific15230
DithiothreitolSigma-AldrichD0632
DMEM - Low glucose + Glutamine, + sodium pyruvateThermo Fisher Scientific11885
Fatty Acid Free BSACalbiochem12660920 mg/mL stock in low glucose DMEM
Fine forceps Dumont no.4 and no.5Ted Pella Inc5621, 5622
Forceps and Scissors for DissectionTed Pella Inc1328, 1329, 5002
Glass coverlips - 12mmNeuvitro CorporationGG-12
Goat-Anti Mouse IgG Alexa 488 conjugatedThermo Fisher ScientificA32723
Ham's F-12 Nutrient MixThermo Fisher Scientific11765
Hank's balanced salt soltion (Calcium and Magnesium free)Thermo Fisher Scientific14185
Insulin-Selenium-Transferrin (100X)Thermo Fisher Scientific41400-045
IodoacetamideSigma-AldrichA3221
L-GlutamineThermo Fisher Scientific25030
Leibovitz L-15 mediumThermo Fisher Scientific11415064
Mounting media for glass coverslipsThermo Fisher ScientificP36931, P36934
Mouse-anti- MAP2 antibody (SMI-52)BioLegendSMI 52
Nerve growth factorEnvigo Bioproducts (formerly Harlan Bioproducts)BT5017Stock 125 μg/mL in 0.2% Prionex in DMEM
ParaformaldehyeSpectrum ChemicalsP1010
Penicillin-Streptomycin (100X)Thermo Fisher Scientific15140
Poly-D-LysineSigma-AldrichP0899
PrionexMillipore52960010% solution, 100 mL
RapiGest SFWaters Corporation1860018615 X 1 mg
Synapt G2 High Definition Mass SpectrometryWaters Corporation
Trifluoro acetic acid - Sequencing gradeThermo Fisher Scientific2890410 X 1 mL
Triton X-100Sigma-AldrichX100
TrypsinPromega or NEBV511A, P8101S100 μg or 5 X 20 mg
Waters Total recovery vialsWaters Corporation186000385c

Referenties

  1. Rees, R. P., Bunge, M. B., Bunge, R. P. Morphological Changes in the neuritic growth cone and target neuron during synaptic junction development in culture. Journal of Cell Biology. 9, (1976).
  2. Chandrasekaran, V., Lein, P. J. Regulation of Dendritogenesis in Sympathetic Neurons. Autonomic Nervous System. , (2018).
  3. Higgins, D., Burack, M., Lein, P., Banker, G. Mechanisms of neuronal polarity. Current Opinion in Neurobiology. 7 (5), 599-604 (1997).
  4. Lein, P., Guo, X., Hedges, A. M., Rueger, D., Johnson, M., Higgins, D. The effects of Extracellular Matrix And Osteogenic Protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons. International Journal of Developmental Neuroscience. 14 (3), 203-215 (1996).
  5. Kobayashi, M., Fujii, M., Kurihara, K., Matsuoka, I. Bone morphogenetic protein-2 and retinoic acid induce neurotrophin-3 responsiveness in developing rat sympathetic neurons. Molecular Brain Research. 53 (1-2), 206-217 (1998).
  6. Burnham, P., Louis, J. C., Magal, E., Varon, S. Effects of ciliary neurotrophic factor on the survival and response to nerve growth factor of cultured rat sympathetic neurons. Developmental Biology. 161 (1), 96-106 (1994).
  7. Hou, X. E., Li, J. Y., Dahlström, A. Clathrin light chain and synaptotagmin I in rat sympathetic neurons. Journal of the Autonomic Nervous System. 62 (1-2), 13-26 (1997).
  8. Harris, G. M., et al. Nerve Guidance by a Decellularized Fibroblast Extracellular Matrix. Matrix Biology. , 176-189 (2017).
  9. Wingerd, K. L., et al. α4 integrins and vascular cell adhesion molecule-1 play a role in sympathetic innervation of the heart. Journal of Neuroscience. 22 (24), 10772-10780 (2002).
  10. Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D. J., Johnson, M. Tissue culture of autonomic neurons. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge, MA. 177-205 (1991).
  11. Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons. Neuron. 15 (3), 597-605 (1995).
  12. Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. Developmental Biology. 128 (2), 337-348 (1988).
  13. Voyvodic, J. T. Development and regulation of dendrites in the rat superior cervical ganglion. The Journal of Neuroscience. 7 (3), 904-912 (1987).
  14. Garred, M. M., Wang, M. M., Guo, X., Harrington, C. A., Lein, P. J. Transcriptional Responses of Cultured Rat Sympathetic Neurons during BMP-7-Induced Dendritic Growth. PLoS ONE. 6 (7), 21754(2011).
  15. Pravoverov, K., et al. MicroRNAs are Necessary for BMP-7-induced Dendritic Growth in Cultured Rat Sympathetic Neurons. Cellular and Molecular Neurobiology. 39 (7), 917-934 (2019).
  16. Natera-Naranjo, O., Aschrafi, A., Gioio, A. E., Kaplan, B. B. Identification and quantitative analyses of microRNAs located in the distal axons of sympathetic neurons. RNA (New York, N.Y.). 16 (8), 1516-1529 (2010).
  17. Aschrafi, A., et al. Angiotensin II mediates the axonal trafficking of tyrosine hydroxylase and dopamine β-hydroxylase mRNAs and enhances norepinephrine synthesis in primary sympathetic neurons. Journal of Neurochemistry. 150 (6), 666-677 (2019).
  18. Ghogha, A., Bruun, D. a, Lein, P. J. Inducing dendritic growth in cultured sympathetic neurons. Journal of Visualized Experiments. (61), 4-8 (2012).
  19. Caceres, A., Banker, G., Steward, O., Binder, L., Payne, M. MAP2 is localized to the dendrites of hippocampal neurons which develop in culture. Brain Research. 315 (2), 314-318 (1984).
  20. Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons. Neuroscience Letters. 245 (3), 131-134 (1998).
  21. Mi, H., et al. PANTHER version 11: Expanded annotation data from Gene Ontology and Reactome pathways, and data analysis tool enhancements. Nucleic Acids Research. 45, 183-189 (2017).
  22. Chandrasekaran, V., et al. Retinoic acid regulates the morphological development of sympathetic neurons. Journal of Neurobiology. 42 (4), (2000).
  23. Courter, L. A., et al. BMP7-induced dendritic growth in sympathetic neurons requires p75 NTR signaling. Developmental Neurobiology. 76 (9), 1003-1013 (2016).
  24. Lein, P. J., Fryer, A. D., Higgins, D. Cell Culture: Autonomic and Enteric Neurons. Encyclopedia of Neuroscience. , 625-632 (2009).
  25. Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In vitro Tools for Neurobiological Research. Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
  26. Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9 (1), 82(2016).
  27. Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), e3200(2011).
  28. Takeuchi, A., et al. Microfabricated device for co-culture of sympathetic neuron and iPS-derived cardiomyocytes. Proceedings of the Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, EMBS. 2013, 3817-3820 (2013).
  29. Takeuchi, A., et al. Development of semi-separated co-culture system of sympathetic neuron and cardiomyocyte. Proceedings of the 31st Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society: Engineering the Future of Biomedicine, EMBC 2009. , 1832-1835 (2009).
  30. Chandrasekaran, V., Lea, C., Sosa, J. C., Higgins, D., Lein, P. J. Reactive oxygen species are involved in BMP-induced dendritic growth in cultured rat sympathetic neurons. Molecular and Cellular Neuroscience. 67, (2015).
  31. Kim, W. Y., et al. Statins decrease dendritic arborization in rat sympathetic neurons by blocking RhoA activation. Journal of Neurochemistry. 108 (4), 1057-1071 (2009).
  32. Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: Primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods. 33 (2), 95-103 (2004).
  33. Szpara, M. L., et al. Analysis of gene expression during neurite outgrowth and regeneration. BMC Neuroscience. 8 (1), 100(2007).
  34. Pop, C., Mogosan, C., Loghin, F. Evaluation of rapigest efficacy for the digestion of proteins from cell cultures and heart tissue. Clujul Medical. 87 (4), 5(2014).
  35. Vit, O., Petrak, J. Integral membrane proteins in proteomics. How to break open the black box. Journal of Proteomics. 153, 8-20 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Neuronale kweekPoly-D-lysine coatingAra-C-behandelingimmunocytochemische kleuringmassaspectrometrieMAP-2-kleuringmorfologische analyse
Culturing Rat Sympathische Neuronen van Embryonale Superior Cervicale Ganglia voor morfologische en proteomische analyse
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.