Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

X-Ray Kristallografie om de oligomerische staat overgang van de Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050 studie

3.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61288

⸱

13 mei 2020

 ,  ,  , 
1Laboratory of Microbiology, Department of Molecular Biology, Université Libre de Bruxelles, 2Labiris Institut de Recherche

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol is ontwikkeld om de dimer-dodecamer overgang van TmPep1050, een M42 aminopeptidase, op structureel niveau te bestuderen. Het is een eenvoudige pijplijn vanaf eiwitzuivering tot röntgengegevensverwerking. Crystallogenesis, data set indexatie, en moleculaire vervanging zijn benadrukt door middel van een geval van studie, TmPep1050H60A H307A variant.

Samenvatting

De M42 aminopeptidases vormen functioneel actieve complexen gemaakt van 12 subeenheden. Hun assemblageproces lijkt te worden gereguleerd door hun metalen ionen cofactoren triggering een dimer-dodecamer overgang. Bij metaalionbinding vinden verschillende structurele wijzigingen plaats in de actieve site en op de interactie-interface, waardoor dimers worden gevormd om de zelfassemblage te bevorderen. Om dergelijke wijzigingen waar te nemen, moeten stabiele oligomeren vóór de structurele studie worden geïsoleerd. Hier gemeld is een methode die het mogelijk maakt de zuivering van stabiele dodecamers en dimers van TmPep1050, een M42 aminopeptidase van T. maritima, en hun structuur bepaling door X-ray kristallografie. Dimers werden bereid van dodecamers door het verwijderen van metalen ionen met een chelaatvormer. Zonder hun cofactor werden dodecamers minder stabiel en werden ze volledig gescheiden bij verwarming. De oligomeric structuren werden opgelost door de ongecompliceerde moleculaire vervangingsbenadering. Ter illustratie van de methodologie wordt de structuur van een TmPep1050-variant, volledig aangetast in metaalionbinding, gepresenteerd waaruit blijkt dat er geen verdere uitsplitsing van dimers op monomeren wordt weergegeven.

Inleiding

Oligomerisatie is een overheersend proces dat de biologische functies van veel eiwitten dicteert. In Escherichia coliwordt geschat dat slechts 35% van de eiwitten monomeerbaar is1. Sommige eiwitten, genaamd morpheeins, kunnen zelfs verschillende oligomerische toestanden aannemen met subeenheden met een duidelijke structuur in elke oligomerische toestand2. De overgang tussen hun oligomerische toestanden is vaak een gemiddelde om eiwitactiviteit te reguleren, omdat elke oligomerische toestand een andere specifieke activiteit of functie kan hebben. Verschillende voorbeelden van morpheeins zijn goed gedocumenteerd in de literatuur, met name de porphobilinogen synthase3, HPr kinase/phosphatase4, Lon protease5, lactate dehydrogenase6, glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase7, pyruvate kinase8, citraat synthase9, en ribonuclease A10. Onlangs hebben we beschreven de M42 aminopeptidase TmPep1050, een ander voorbeeld van enzym met morphein-achtig gedrag, waarvan de activiteit afhankelijk is van zijn oligomerieke toestanden11. De overgang tussen de oligomerische toestanden wordt bemiddeld door zijn metaalcofactoren die verschillende structurele wijzigingen van de subeenheden veroorzaken.

De M42 aminopeptidase familie behoort tot de MH clan12,13, en wordt op grote schaal verspreid onder Bacteriën en Archaea14. De M42 aminopeptidases zijn echte dinucleaire enzymen die peptiden tot 35 aminozuurresten in lengte15degraderen. Ze nemen een eigenaardige tetraëdervormige structuur aan die bestaat uit 12 subeenheden met hun actieve locaties gericht op een innerlijke holte. Een dergelijke regeling wordt vaak beschreven als een nano-compartimentering van de activiteit om ongecontroleerde proteolyse te voorkomen. De fysiologische functie van de M42 aminopeptidases kan worden geassocieerd met het proteasoom, hydrolyserende peptiden als gevolg van eiwitafbraak16,17. Pyrococcus horikoshii bezit vier M42 aminopeptidases, die elk verschillende maar complementaire specificiteiten18,19,20,21presenteren . Bijzonder, heterocomplexen gemaakt van twee verschillende soorten subeenheden zijn beschreven in P. horikoshii, wat wijst op het bestaan van peptidasome complexen22,23.

Verschillende structuren van M42 aminopeptidases zijn beschreven in de literatuur11,16,18,19,20,24,25,26. De subunit bestaat uit twee verschillende domeinen, een katalytisch domein en een dimerisatiedomein. De katalytische domein neemt een gemeenschappelijke α / β vouw bewaard in de hele MH-clan, de archetypische katalytische domein wordt de aminopeptidase Ap1 van Vibrio proteolyticus27. De dimerization domein neemt een PDZ-achtige vouw16 en kan, naast zijn rol in de oligomerisatie, een rol hebben bij het regelen van substraattoegang en binding in de binnenholte11. Aangezien de basisbouwsteen een dimer is, wordt de dodecamer vaak omschreven als de associatie van zes dimers, waarbij elke dimer aan elke rand van de tetraëder16wordt geplaatst. De oligomerisatie van de M42 aminopeptidases is afhankelijk van de beschikbaarheid van zijn metaalcofactoren. Divalent metaalionen, vaak Zn2+ en Co2+, zijn katalytisch betrokken bij de peptide binding en hydrolyse. Ze zijn te vinden in twee verschillende bindende sites, namelijk M1 en M2 sites. De twee metalen ionen rijden ook en stemmen de oligomerisatie zoals aangetoond voor PhTET2, PhTET3, PfTET3 en TmPep105011,24,28,29. Wanneer de metaalcofactoren uitgeput zijn, demonteert de dodecamer in dimers, zoals in PhTET2, PhTET3 en TmPep105011,16,28of zelfs monomeren, zoals in PhTET2 en PfTET324,29.

Hier gepresenteerd is een protocol dat wordt gebruikt voor het bestuderen van de structuren van TmPep1050 oligomers. Dit protocol is een reeks gemeenschappelijke methoden, waaronder eiwitzuivering, proteolytische activiteitscreening, kristallisatie, röntgendiffractie en moleculaire vervanging. Subtiliteiten die inherent zijn aan het omgaan met metalloenzymen, eiwit oligomerisatie, eiwit kristallisatie en moleculaire vervanging worden benadrukt. Er wordt ook een studiegeval gepresenteerd om aan te tonen of TmPep1050 dodecamers zich verder kunnen distantiëren in monomeren of niet. Om deze vraag te beantwoorden, een TmPep1050 variant, TmPep1050H60A H307A, is onderzocht waarvan de metalen binding sites worden aangetast door het muteren van His-60 (M2 site) en His-307 (M1 site) naar Ala residuen. Dit protocol kan worden ondergebracht om andere M42 aminopeptidases of metaalloenzymen met morpheein-achtig gedrag te bestuderen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Productie en zuivering van recombinant TmPep1050

OPMERKING: Hierna worden de kloonprocedure en de zuivering van wild-type TmPep1050 aangepast aan een eerdere studie11beschreven . Als alternatief kan het klonen worden gedaan met behulp van een synthetisch gen. Om TmPep1050-varianten te genereren, kan site directed mutagenesis worden uitgevoerd volgens bijvoorbeeld de single-primer reacties in parallel protocol (SPRINP) methode30. Het zuiveringsprotocol kan worden gebruikt voor TmPep1050-varianten. Het gebruik van His-tag moet worden vermeden omdat het de metaalionbinding verstoort.

  1. Expressievectorontwerp
    1. Verwerven genomisch DNA van Thermotoga maritima MSB8 (ATCC 43589) of TmCD00089984 (Joint Center for Structural Genomics).
    2. Versterken TM_1050 open leeskader (ORF) met genomisch DNA of sjabloon plasmide, een high-fidelity DNA polymerase, en de volgende primers: ocej419 (5'- TTTAACTTTAAGAGGAGATATACCCATGAAGGAAGGAACTGAAAGGECTG) en ocej420 (5'- ATCCGCCAAAACAGCCAAGCTGGAGACCGTTTACCCCCACCKKGATGATGAG). Voer de polymerasekettingreactie (PCR) screening uit volgens het volgende schema: 5 min bij 95 °C, 30 cycli van 3 stappen (30 s bij 95 °C, 30 s bij 55 °C, 90 s bij 72 °C) en 10 min bij 72 °C als laatste stap.
    3. Kloon het PCR-fragment in een geschikte expressievector(Tabel van materialen) door homologe recombinatie (figuur 1) in E. coli volgens het SLiCE-protocol31. Voeg pcr-fragment toe in een 10:1-molaire verhouding van fragment tot vector, 1 μL PPY stamextract, 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM MgCl2, 10 mM ATP en 10 mM dithiothreitol (DTT) voor een reactievolume van 10 μL. Incubate voor 1 h bij 37 °C.
    4. Transformeer chemisch competente E. coli XL1 blauwe stam (of een recA- geschikte stam) met 1 μL recombinatiereactie. Plaats de cellen op LB-medium met 100 μg/mL ampicilline. Incubeer de platen 's nachts bij 37 °C.
    5. Pluk kolonies op verse LB platen met 100 μg/mL ampicilline. Incubeer de platen op 37 °C gedurende ten minste 8 uur.
    6. Scherm voor positieve kandidaten door kolonie PCR met behulp van geschikte primer pair (5'- ATGCCATAGCATTTTTATCC en 5'- ATTTAATCTGTATCAGGC bij gebruik van de aanbevolen vector vermeld in Table of Materials). Met een microtip-uiteinde krast je een geplukte kolonie en breng je de cellen over op 20 μL reactiemix met 0,5 μM van elke primer en 10 μL van een commerciële Taq DNA polymerase mix.
    7. Voer de PCR-screening uit volgens de volgende regeling: 5 min bij 95 °C als de denaturatiestap, 30 cycli van 3 stappen (30 s bij 95 °C, 30 s bij 55 °C, 90 s bij 72 °C) en 10 min bij 72 °C als laatste stap.
      LET OP: De PCR-reacties kunnen 's nachts worden opgeslagen in de PCR-machine bij 12 °C.
    8. Laad 10 μL van elke PCR-reactie op een 0,8% agarosegel bereid in Tris-acetaat-EDTA (TAE) buffer. Voer de elektroforese 25 minuten uit op 100 V.
      LET OP: Er wordt een amplicon van 1,1 kbp verwacht.
    9. Haal plasmiden uit kandidaten met behulp van een commerciële kit(Table of Materials)en sequentie ze met behulp van dezelfde primer paar gebruikt in stap 1.1.6.
  2. Celcultuur
    OPMERKING: Wanneer een geschikte kandidaat is geïdentificeerd door sequencing, kan de kloon direct als expressie worden gebruikt als u de aanbevolen vector(Tabel van materialen) gebruikt. In dat geval wordt de uitdrukking gecontroleerd door de arabinose-inducible PBAD promotor32.
    1. Inoculate 10 mL LB medium met 100 μg/mL ampicilline met de kandidaat en incuberen de precultuur 's nachts bij 37 °C bij orbitale schudden. Voeg 5 mL van de precultuur toe aan 1 L LB medium met 100 μg/mL ampicilline. Let op een lucht-vloeistofverhouding van 3 te respecteren.
    2. Laat cellen groeien bij 37 °C onder orbitale schudden. Controleer de optische dichtheid op 660 nm (OD660).
    3. Wanneer OD660 0,5−0,6 heeft bereikt, koelt u de cultuur snel gedurende 5 minuten op ijs en breng deze over naar een couveuse die is ingesteld op 18 °C.
    4. Voeg 0,2 g/L arabinose toe om genexpressie te induceren en incubeer gedurende 12−18 uur bij 18 °C.
    5. Oogst cellen door de cultuur te centrifugeren op 6.000 x g gedurende 30 min bij 4 °C. Gooi de supernatant weg en was cellen met 100 mL van 0,9% (w/v) NaCl.
    6. Centrifuge opnieuw op 6.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C en gooi de supernatant weg.
      LET OP: Celpellets kunnen direct worden gebruikt voor eiwitextractie of worden opgeslagen bij -80 °C.
  3. Eiwitzuivering
    1. Resuspend de celpellets in 40 mL van 50 mM MOPS, 1 mM CoCl2, pH 7.2. Voeg 1 μL van 25 U/μL DNA/RNA endonuclease toe en één tablet proteaseremmercocktail die geen EDTA bevat. Sonicate de vering in pulsmodus onder koeling gedurende 30 min.
    2. Centrifugeren het ruwe extract op 20.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C. Verzamel de supernatant en verwarm het in een waterbad op 70 °C gedurende 10 minuten.
    3. Centrifugeer het gedenatureerde celextract op 20.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C en verzamel de supernatant voor zuivering.
    4. Gebruik geschikte anionuitwisselingsroeren (Tabel van materialen) verpakt in een kolom van ~ 15 mL volume. Raadpleeg de aanbevelingen van de fabrikant voor de werkstroomsnelheid en de kolomdruklimiet. Equilibrate de hars met 50 mM MOPS, 1 mM CoCl2, pH 7.2.
    5. Laad de supernatant verzameld vanaf stap 1.3.3 in de kolom. Controleer de absorptie van het eluaat op 280 nm. Wanneer het de basislijn heeft bereikt, gaat u naar de elutie.
    6. Breng een verloop aan van 0 naar 0,5 M NaCl in 50 mM MOPS, 1 mM CoCl2, pH 7.2 voor 5 kolomvolumes (CV). Wacht tot de geleidbaarheid is gestabiliseerd en de absorptie de basislijn heeft bereikt.
    7. Breng een laatste helling aan van 0,5 tot 1 M NaCl in 50 mM MOPS, 1 mM CoCl2, pH 7.2 voor 1 CV.
    8. Analyseer enkele breuken (zie figuur 2A ter begeleiding) door natrium dodecylsulfaat polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE).
      LET OP: TmPep1050 verschijnt als een 36 kDa band na Coomassie kleuring. Als alternatief kan de aanwezigheid van TmPep1050 worden bevestigd door activiteitstest (zie punt 2.1). Bij deze stap kunnen breuken 's nachts bij 4 °C worden opgeslagen.
    9. Pool de fracties met TmPep1050 en voeg fijn gemalen poeder van (NH4)2SO4 toe om een concentratie van 1,5 M (NH4)2DUS4te verkrijgen . Meng zachtjes door de buis ondersteboven om te keren tot volledige ontbinding.
    10. Gebruik hydrofobe interactie hars(Tabel van materialen) verpakt in een kolom van ~ 30 mL volume. Raadpleeg de aanbevelingen van de fabrikant voor de werkstroomsnelheid en de kolomdruklimiet. Equilibrate de hars met 50 mM MOPS, 1.5 M (NH4)2SO4, 1 mM CoCl2, pH 7.2.
    11. Laad het monster op de kolom en controleer de absorptie van het eluaat op 280 nm. Wanneer de absorptie de basislijn heeft bereikt, elute gebonden eiwitten door het toepassen van een gradiënt van 1,5 M tot 0 M (NH4)2SO4 in 50 mM MOPS, 1 mM CoCl2, pH 7.2 voor 5 CV.
    12. Analyseer enkele breuken (zie figuur 2B voor richtlijnen) door SDS-PAGE.
      LET OP: TmPep1050 verschijnt als een 36 kDa band na Coomassie kleuring. Als alternatief kan de aanwezigheid van TmPep1050 worden bevestigd door activiteitstest (zie punt 2.1). Bij deze stap kunnen breuken 's nachts bij 4 °C worden opgeslagen.
    13. Pool de fracties met TmPep1050 en concentreer je op 2 mL met ultrafiltratie-eenheden met 30 kDa cutoff(Tabel van materialen). Ga naar sectie 1.4 om het molecuulgewicht te bepalen.
  4. Grootte uitsluiting chromatografie
    1. Gebruik grootteuitsluitings hars (Tabel van materialen) verpakt in een kolom van ~ 120 mL volume. Raadpleeg de aanbevelingen van de fabrikant voor de werkstroomsnelheid en de kolomdruklimiet. Equilibrate de hars met 50 mM MOPS, 0.5 M (NH4)2SO4, 1 mM CoCl2, pH 7.2.
    2. Laad het monster op de kolom en controleer de absorptie van het eluaat op 280 nm. Fractioneren van de kolom dode volume (~ 0,33 CV) tot het einde van de elutie (1 CV).
    3. Meet het elutievolume voor elke waargenomen piek.
      OPMERKING: Voor begeleiding, dodecameric TmPep1050 elutes at ~82 mL (Figuur 3A) onder de huidige experimentele omstandigheden, terwijl dimeric TmPep1050, zoals de TmPep1050H60A H307A variant, elutes op ~ 95 mL (Figuur 3B). Sommige TmPep1050 kunnen beide oligomerische vormen aannemen, zoals TmPep1050H60A (figuur 3C).
    4. Analyseer breuken die overeenkomen met de maxima en staarten van waargenomen pieken met behulp van SDS-PAGE.
      LET OP: TmPep1050 verschijnt als een 36 kDa band na Coomassie kleuring.
    5. Pool de fracties van elke piek en concentraat met behulp van ultrafiltratie-eenheden met 30 kDa cutoff (Tabel van materialen) om een concentratie van ~ 300 μM te verkrijgen.
    6. Meet de absorptie op 280 nm op een nanovolumespectrfotometer en bereken de concentratie met behulp van de moleculaire extinctiecoëfficiënt van 18.910 M-1 cm-1.
    7. Bewaar het gezuiverde eiwit op -18 °C.
    8. Om het molecuulgewicht te bepalen, kalibreer de kolom grootteuitsluitingschromatografie (SEC) met behulp van moleculaire gewichtsnormen(Tabel van materialen). Analyseer de standaarden met behulp van 50 mM MOPS, 0,5 M (NH4)2SO4,1 mM CoCl2 pH 7.2 als lopende buffer.

2. Activiteitstest en apo-enzympreparaat

OPMERKING: Oorspronkelijk werd het apo-enzym bereid door 1 volume TmPep1050 te verdunnen in 10 volumes van 2,1 M malic zuur pH 7.0 en zich terug te concentreren tot 1 volume voorafgaand aan dialyse11. Hieronder wordt gepresenteerd een alternatieve procedure met behulp van 1,10-fenanthroline, een metalen ionchelator. Deze procedure vermindert eiwitverlies en geeft dezelfde resultaten als de eerder gepubliceerde methode.

  1. Activiteitstest
    1. Bereid een voorraadoplossing van 100 mM L-Leucine-p-nitroanilide(Tabel van materialen)in methanol.
    2. Voeg 25 μL van 100 mM L-Leucine-p-nitroanilide toe in 965 μL van 50 mM MOPS, 250 μM CoCl2, pH 7.2, 10% methanol. Preincubate het reactiemengsel bij 75 °C in een droog bad.
    3. Verdun het enzym in 50 mM MOPS pH 7.2 tot een concentratie van 1 μM. Voeg 10 μL toe aan het reactiemengsel, de vortex en de incubaat bij 75 °C, hetzij totdat het geelachtig is geworden of voor 1 uur.
    4. Stop de reactie door 1 mL azijnzuur toe te voegen. Vortex goed en laat het afkoelen tot kamertemperatuur.
    5. Breng de reactiemix over in een spectrofotometercel. Lees de absorptie op 410 nm tegen een negatieve controle (geïncubeerde reactiemix zonder enzym).
  2. Apo-enzympreparaat
    1. Bereid een voorraadoplossing van 1 M 1,10-fenanthroline in ethanol voor. Voeg 10 μL 1,10-fenanthroline stockoplossing toe aan 890 μL van 50 mM MOPS, 0,5 M (NH4)2SO4, pH 7.2. Voeg 100 μL gezuiverde TmPep1050 (300 μM−1 mM-concentratie) toe.
    2. Controleer het activiteitsverlies met behulp van de activiteitstest beschreven in punt 2.1 zonder CoCl2 in de reactiemix toe te voegen.
    3. Breng het monster over in een dialysebuis. Dialyze tegen 200 mL van 50 mM MOPS, 0,5 M (NH4)2SO4, pH 7.2 bij 4 °C. Wissel driemaal het dialysaat met verse buffer tijdens de 48 h dialyse.
    4. Verzamel het monster uit de dialysebuis en concentreer je terug naar 100 μL met ultrafiltratie-eenheden met 30 kDa cutoff(Tabel van materialen). Controleer de concentratie door het lezen van de absorptie op 280 nm met behulp van een nano-volume spectrofotometer.
  3. Dimer voorbereiding
    1. Verdun het apo-enzym tot een concentratie van 1 μM in 50 mM MOPS, 0,5 M (NH4)2SO4, pH 7.2. Incubeer 2 uur bij 75 °C in een droog bad en laat het monster afkoelen tot kamertemperatuur.
    2. Concentreer het monster op een enzymconcentratie van ten minste 50 μM. Controleer het molecuulgewicht per SEC (zie punt 1.4). De elutiepiek moet verschuiven van ~ 82 mL naar ~ 95 mL (onder de huidige experimentele omstandigheden).

3. TmPep1050 kristallisatie

OPMERKING: Eiwitkristallisatie blijft een empirische wetenschap omdat het een multifactorieel fenomeen is33. Hoewel sommige parameters kunnen worden geïdentificeerd en gecontroleerd (zoals temperatuur, pH, concentratie van neerslagmiddelen), kunnen andere parameters de kristallisatie ongrijpbaar beïnvloeden (zoals eiwit- en chemische zuiverheid, proteolyse, monstergeschiedenis). Tegenwoordig wordt eiwitkristallisatie op een rationele en systematische manier aangepakt dankzij een aantal commerciële kristallisatiescreeningomstandigheden en automatisering. De optimalisatie van een kristallisatievoorwaarde is echter vooral gebaseerd op een trial-and-error-benadering. Hierna wordt een blauwdruk beschreven voor het kristalliseren van eiwitten en verschillende tips voor het optimaliseren van de kristallisatieomstandigheden.

  1. Kristallisatiescreening
    OPMERKING: Met behulp van commerciële kristallisatiekits zijn kristallen van dodecameric TmPep1050 verkregen in 2,2 M DL-malic acid pH 7.0, 0.1 M Bis-Tris propaan pH 7.0 en 0.18 M tri-ammonium citrate, 20% polyethyleenglycol (PEG) 3350. Kristallen van dimeric TmPep1050 zijn verkregen in 0,1 M natriumcitraat pH 5.6, 0.2 M ammonium acetaat, 30% PEG4000. Kristallen van dodecamers verschijnen binnen een week en bereiken hun volledige grootte in een maand. Kristallen van dimers verschijnen meestal binnen 24 uur en groeien tot volledige grootte in een week.
    1. Verwerf verschillende commerciële kristallisatiekits (zie Tabel van Materialen voor voorbeelden).
    2. Stel kristallisatieplaten(Tabel van materialen) invoor de ophangdruppelmethode. Vul de putten met 500 μL van elke oplossing van een kristallisatie screening kit.
    3. Voor elke put, het opzetten van een kristallisatie ondersteuning. Op de steun, deponeren een 1 μL daling van gezuiverd eiwit (meestal ~ 10 mg/mL).
    4. Onmiddellijk pipet 1 μL kristallisatieoplossing uit de put. Voeg het voorzichtig toe aan de eiwitdruppel en meng voorzichtig door driemaal ondersteboven te pipetten. De druppel moet semisferisch blijven zonder bubbels.
    5. Schroef de steun bovenop de overeenkomstige put. Herhaal de bewerking voor de hele kit.
    6. Let na het instellen van de platen op elke druppel met een verrekijker. Raadpleeg de gebruiksgids voor kristallisatiekit voor interpretatie (duidelijke val, fasescheiding, neerslag, naalden, enz.).
    7. Broed de platen uit op 20 °C. Controleer de platen eenmaal per dag tijdens de eerste week en een keer per week daarna.
    8. Score elk goed met behulp van de score blad en de handleiding voorzien van de kristallisatie kits.
  2. Kristallisatieoptimalisatie
    OPMERKING: De initiële kristallisatieomstandigheden van dodecameric TmPep1050 zijn geoptimaliseerd voor 2,1 M DL-appelzuur pH 6.75 en 0,18 M tri-ammonium citraat pH 7.5, 40% (w/v) PEG3350 terwijl de kristallisatievoorwaarde van dimeric TmPep1050 is verschoven naar 0,1 M natriumcitraat pH 6.0, 10% (w/v) PEG3350. Een cyclus van zaaien is nodig geweest om de kristalliniteit te verbeteren. Hierna wordt beschreven hoe de kristallisatie van TmPep1050H60A H307A variant is geoptimaliseerd.
    1. Bereid voorraadoplossingen voor van 0,5 M natriumcitraatbuffer bij verschillende pH-oplossingen (4,5, 5,2 en 6,0) en 50% (w/v) PEG3350-oplossing.
    2. Stel een kristallisatieplaat in als matrix van pH vs. neerslagmiddel (zie figuur 4A).
    3. Broed de plaat uit op 20 °C. Observeer elke put met een verrekijker een keer per dag gedurende een week.
    4. Score elk goed op basis van kristal grootte en vorm. Selecteer een voorwaarde die kristallen van ten minste 50 μm geeft. Ga over tot microzaeding.
  3. Microseeding
    OPMERKING: Microseeding is een krachtige methode om de vorm, grootte en kristallijnheid van eiwitkristallen te verbeteren34. Een snellere zaaien aanpak is streep zaaien met behulp van een kat snorharen. Zie figuur 4 als voorbeeld hoe kristallisatieoptimalisatie en microseeding de kristalvorm en -grootte voor TmPep1050H60A H307Ahebben verbeterd.
    1. Bereid de zaden met behulp van de geselecteerde goed in stap 3.2.4.
    2. Verhoog het volume van een druppel met kristallen tot 10 μL door kristallisatieoplossing uit de put toe te voegen. Pipet de druppel en voeg 90 μL kristallisatie oplossing van de put. Vortex grondig en houd de zaden op ijs.
    3. Bereid verschillende verdunningen van de zaden: 1x, 10x, 25x en 100x. Vortex goed de zaden voor pipetten. Houd de verdunningen op ijs.
    4. Stel voor elke zaadverdunning een kristallisatieplaat in als matrix van pH vs. neerslagmiddel (zie figuur 4B). Gebruik de voorraadoplossingen die in stap 3.2.1 zijn opgesteld.
    5. Voeg bij het maken van de druppel 0,2 μL zaden toe voor een druppel van 2 μL. Broed de plaat uit op 20 °C. Observeer elke put met een verrekijker een keer per dag gedurende een week.
      OPMERKING: De verdeling en vorm van de kristalgrootte moeten worden verbeterd, zie figuur 4C als voorbeeld voor TmPep1050H60A H307A. Voor verder gebruik kunnen zaden worden opgeslagen bij -20 °C.

4. Röntgendiffractie

  1. Kristalplukken
    OPMERKING: De voorbereiding van de monsters is afhankelijk van de röntgenbronfaciliteit (thuisfaciliteit versus synchrotron). Gebruik opslagapparaten (flacons en flacon-houdermand) dienovereenkomstig. Afhankelijk van de concentratie van zout/neerslagmiddelen kan cryoprotectant (zoals glycerol) nodig zijn. Voor TmPep1050-kristallen is een cryoprotectant niet nodig omdat PEG of bufferconcentratie hoog genoeg is om waterkristallen te voorkomen.
    1. Bereid een bad gevuld met vloeibare stikstof, duik alle flesjes of mand gebruikt voor monster behandeling.
    2. Stel monsterpluklussen van verschillende afmetingen in: 100, 150 en 200 μm (Tabel van materialen). Kies de maten op basis van de kristalgrootte.
    3. Controleer met behulp van een verrekijker de druppel met kristallen en spot geïsoleerde kristallen (de gemakkelijkste om te plukken). Met een lus, kies voorzichtig een kristal van de bodem. Duik onmiddellijk de lus in vloeibare stikstof en plaats de lus in een geschikte flacon.
  2. Gegevensverzameling
    OPMERKING: Het verzamelen van gegevens kan sterk variëren, afhankelijk van de röntgenbron (thuisfaciliteit vs. synchrotron) en de gevoeligheid van de detector. De collectiestrategie kan ook sterk verschillen van een monster tot een ander voorbeeld, afhankelijk van de resolutie, de steunintensiteit, de ruimtegroep, enz. Het onderwerp is uitgebreid beoordeeld door Dauter35.
    1. Monteer de lus die het kristal op de goniometerkop van de diffractometer draagt.
    2. Stem de goniometerkop langs XYZ-assen af om het kristal uit te lijnen met het röntgenstraalpad.
    3. Stel de golflengte in op 0,98 Å en verplaats de detector om 2 Å resolutie te krijgen.
    4. Start een korte gegevensverzameling door afbeeldingen te verkrijgen in ten minste twee verschillende kristaloriëntasaties. Maak 10 beelden (1 beeld per 0,1°) bij 0° en 90°.
    5. Controleer de verzamelde afbeeldingen met geschikte software (bijvoorbeeld ADXV, XDS-Viewer of Albula Viewer). Bepaal de spotintensiteit en de hoogste resolutie waar vlekken worden gezien. Controleer ook de monokristallijnheid en ter plaatse scheiding.
    6. Herhaal uiteindelijk stap 4.2.3−4.2.5 door de detectorpositie te wijzigen voor een hogere of lagere resolutie en de belichtingstijd in overeenstemming met de waarneming.
    7. Start het verzamelen van gegevens rond 360° met 1 beeld genomen per 0,1°. Vergeet niet om de detectorpositie en belichtingstijd optimaal in te stellen.

5. Indexatie, moleculaire vervanging en modelbouw

  1. Indexering
    OPMERKING: Indexatie is een methode voor het meten van diffractieplekken intensiteit, waardoor de amplitudes van structuurfactoren36. Vier softwarepakketten worden vaak gebruikt voor het verwerken van verzamelde afbeeldingen: Mosflm37, HKL200038, DIALS39en XDS40. Deze laatste is gebruikt voor het indexeren van de gegevenssets verkregen uit TmPep1050 kristaldiffractie.
    1. Installeer XDS-pakket en XDSME41. Als u HDF5-bestanden verwerkt, installeert u XDS Neggia plugin (beschikbaar op de website van Dectris). Ga voor meer informatie naar de XDS wiki webpagina https://strucbio.biologie.uni-konstanz.de/xdswiki/index.php/Main_Page en XDSME webpagina https://github.com/legrandp/xdsme.
    2. Voordat u gegevens verwerkt, maakt u een map van waaruit XDS wordt uitgevoerd. Zoek het pad naar de afbeeldingen.
    3. Als u XDSME wilt uitvoeren, typt u xdsme /path_to_images/image.extension in een terminalvenster.
    4. Nadat XDS de taak heeft beëindigd, controleert u de CORRECTe. LP-bestand. Let op de waarschijnlijkheid van de bepaling van de ruimtegroep, de volledigheid van gegevens, de hoogste resolutie, kristalmozaïek en gegevenskwaliteit. Controleer ook XDS_pointless.log om de waarschijnlijkheid van ruimtegroepen te verkrijgen.
      OPMERKING: Zie figuur 5 als een voorbeeld van uitvoer.
    5. Herhaal XDSME opnieuw met verschillende ruimtegroepoplossingen die XDS in afzonderlijke map voorstelt om te voorkomen dat het vorige proces wordt overschrijft. Typ xdsme -s space_group_name -c "unit_cell_parameters" /path_to_images/image.extension (bijvoorbeeld xdsme -s P21 -c "43.295 137.812 61.118 90.000 110.716 90.000).
    6. Controleer de CORRECTe. LP-bestanden en kies de beste oplossing op basis van gegevensstatistieken.
    7. Voer XSCALE uit door xscale.py XDS_ASCII te typen. HKL. Voer XDSCONV uit door xdsconv.py XSCALE te typen. HKL ccp4.
      OPMERKING: In sommige gevallen kan XDSME de ruimtegroep niet identificeren of het resolutiebereik niet goed knippen of rare gegevensstatistieken genereren. Als een dergelijk probleem wordt aangetroffen, is het de moeite waard om XDS native uit te voeren. In de XDS moeten verschillende parameters worden ingevoerd. INP-initiatiebestand (zie XDS wikipagina). Bij het gebruik van XDS kan de waarschijnlijkheid van mogelijke ruimtegroepen worden gecontroleerd met Pointless, onderdeel van CCP4-pakket42. Om de resolutie van de gegevensset te verlagen, worden Rmeas < 60% en I/σ ~2 algemeen geaccepteerd om de hoogste resolutie43te bepalen. De moleculaire vervanging en model verfijning, echter, kan worden verbeterd door de resolutie uit te breiden tot I / σ ~ 0,5−1,5 en CC1/2 tot 0,2−0,444.
  2. Moleculaire vervanging
    OPMERKING: Experimentele gegevens geven toegang tot de amplitude van structurele factoren, maar zonder de fase te kennen, zijn ze nutteloos. De fase kan experimenteel worden bepaald door verschillende methoden die afhankelijk zijn van een afwijkend signaal (van een zwaar atoom, bijvoorbeeld)45. Moleculaire vervanging is een andere methode voor het bepalen van de fase zonder een afwijkend verstrooiend atoom46,47. Deze methode maakt gebruik van de coördinaten van een verwante molecuul te vinden en te verbeteren van de fase iteratief. We gebruiken Phaser48 in Phenix GUI49 voor moleculaire vervanging.
    1. Bereid het startmodel voor op moleculaire vervanging met behulp van 4P6Y-coördinaten. Uit het pdb-bestand haal je de monomeer A eruit en verkapte je de aminozuren in alanine met behulp van de PDB-bestandseditor in Phenix (onder het tabblad Hulpmiddelen voor model).
    2. Voer Xtriage uit in Phenix (onder het tabblad Gegevensanalyse) met het reflectiebestand gegenereerd door XDSCONV (5.1.9) en de volgorde als ingangen.
    3. Controleer het logbestand van Xtriage. Let op de volledigheid, het aantal subeenheden in de asymmetrische eenheid, de anisotropie, de aanwezigheid van ijsringen en jumelages.
    4. Run Phaser-MR in Phenix (onder het tabblad Moleculaire vervanging) voor moleculaire vervanging met behulp van het reflectiebestand, de sequentie en het startmodel 4P6Y afgekapt in poly alanine (stap 5.2.1).
    5. Controleer na afloop of er een model is gevonden en of de moleculaire vervanging is. Een vertaalfactor Z-score (TFZ) van ten minste 8 geeft aan dat de oplossing definitief correct is.
  3. Modelbouw
    OPMERKING: Na het bepalen van de fase door moleculaire vervanging, moet het model worden gebouwd en verfijnd. Dit protocol maakt gebruik van Phenix GUI49 voor automatische bouw- en iteratieve verfijningen en Coot50 voor handmatige structuuropbouw en verfijning.
    1. Na moleculaire vervanging met Phase-MR in Phenix selecteert u Run Autobuild. Alle benodigde bestanden worden automatisch toegevoegd. Druk gewoon op Run om autobuild te starten.
    2. Na voltooiing, controleer het model in Coot. Bouw en verfijn het model handmatig volgens de elektronendichtheidskaart in Coot.
    3. Verfijn het handmatig samengestelde model in Phenix (in het tabblad Verfijning) met behulp van het model, de reeks en de diffractiegegevens als invoer. Raadpleeg Phenix help om de juiste strategie te kiezen.
    4. Controleer na verfijning de resultaten:R-vrij enR-werk moet afnemen, Molprobity51-indicatoren moeten worden gerespecteerd en uitschieters met een lage correlatie tussen reële ruimte moeten worden beperkt.
    5. Herhaal stap 5.3.2−5.3.4 totdat het beste verfijnde model is gegenereerd.
    6. Voer Molprobity uit op de server: http://molprobity.biochem.duke.edu/. Controleer eventuele uitschieters geïdentificeerd door Molprobity.
    7. Herhaal uiteindelijk stap 5.3.2−5.3.6 totdat het beste verfijnde model is verkregen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om een mogelijke dodecamer dissociatie in monomeren in TmPep1050 te bestuderen, werden de His-60 en His-307 codons vervangen door alanine codon met behulp van een synthetisch gen. Dit gen werd vervolgens gekloond in pBAD vector voor expressie en zuivering van de overeenkomstige TmPep1050 variant vervolgens genaamd TmPep1050H60A H307A. Grootte uitsluiting chromatografie (Figuur 3B) toonde aan dat het gezuiverde eiwit had een schijnbare moleculaire gewicht van 56 kDa (moleculair gew...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het protocol hierin beschreven maakt het mogelijk inzicht in de dimer-dodecamer overgang van TmPep1050 op structureel niveau. De methodologie werd eerder ervaren voor het bepalen van de structuur van beide TmPep1050 oligomers11. De meest uitdagende stap was het vinden van voorwaarden ter bevordering van de dissociatie van dodecamers in stabiele dimers. Dergelijke omstandigheden moesten mild genoeg zijn om de koppeling van dimers in dodecamers mogelijk te maken toen de metaal-ionencofactor werd toe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij danken Martine Roovers voor het nalezen van deze krant en het geven van constructieve opmerkingen. Toegang tot Proxima 2 beamline (SOLEIL synchrotron) viel binnen Block Allocation Groups 20151139.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1,10-fenantrolineSigma-Aldrich13, 137-7
Amicon Ultra 0.5 ml Centrifugal Filters Ultracel 30KMerck MilliporeUFC503096
Amicon Ultra 15 Centrifugal Filters Ultracel 30KMerck MilliporeUFC903024
Benzonase NucleaseMerck Millipore70664-3
CCP4N/Abezoek http://www.ccp4.ac.uk/
cOmplete EDTA-freeRoche5056489001
CootN/Abezoek https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/
Crystal Screen IHampton ResearchHR2-110
Crystal Screen IIHampton ResearchHR2-112
DreamTaq Green PCR Master MixThermoFisher ScientificK1082
EasyXtal 15-well toolNeXtal132007
Escherichia coli PPY strainN/Azie referentie 31
Escherichia coli XL1 blue strainAgilent200249
Gel Filtration Calibration Kit HMWGE Healthcare Life Sciences28-4038-42
Gel Filtration Calibration Kit LMWGE Healthcare Life Sciences28-4038-41
Gel Filtration StandardBiorad1511901
GeneJET Plasmid Miniprep KitThermoFisher ScientificK0503
IndexHampton ResearchHR2-144
LitholoopsMolecular Dimensions
L-leucine-p-nitroanilideBachem AG40010720025
Natrix 1Hampton ResearchHR2-116
Natrix 2Hampton ResearchHR2-117
Neggia pluginDectrisN/Abezoek https://www.dectris.com/
NeXtal Tubes JCSG Core Suite INeXtal130724
NeXtal Tubes JCSG Core Suite IINeXtal130725
NeXtal Tubes JCSG Core Suite IIINeXtal130726
NeXtal Tubes JCSG Core Suite IVNeXtal130727
pBAD-TOPOThermoFisher ScientificK430001
PhenixN/Abezoek https://www.phenix-online.org/
Phusion High-Fidelity DNA polymeraseThermoFisher ScientificF-530L
Salt RX 1Hampton ResearchHR2-107
Salt RX 2Hampton ResearchHR2-109
SnakeSkin Dialysis Tubing, 3.5K MWCOThermoFisher Scientific88242
Source 15PheGE Healthcare Life Sciences17014702
Source 15QGE Healthcare Life Sciences17094705
Superdex 200 prep gradeGE Healthcare Life Sciences17104301
Thermotoga maritima MSB8 strainAmerican Type Culture CollectionATCC 43589
TmCD00089984DNASU Plasmid RepositoryN/A
XDSN/Abezoek http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/
xdsmeN/Abezoek https://github.com/legrandp/xdsme

Referenties

  1. Levy, E. D., Teichmann, S. A. Structural, Evolutionary, and Assembly Principles of Protein Oligomerization. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 117, 25-51 (2013).
  2. Selwood, T., Jaffe, E. K. Dynamic dissociating homo-oligomers and the control of protein function. Archives of Biochemistry and Biophysics. 519 (2), 131-143 (2012).
  3. Jaffe, E. K. The Remarkable Character of Porphobilinogen Synthase. Accounts of Chemical Research. 49 (11), 2509-2517 (2016).
  4. Ramström, H., et al. Properties and Regulation of the Bifunctional Enzyme HPr Kinase/Phosphatase in Bacillus subtilis. Journal of Biological Chemistry. 278 (2), 1174-1185 (2003).
  5. Rudyak, S. G., Brenowitz, M., Shrader, T. E. Mg2+-Linked Oligomerization Modulates the Catalytic Activiy of the Lon (La) Protease from Mycobacterium smegmatis. Biochemistry. 40 (31), 9317-9323 (2001).
  6. Yamamoto, S., Storey, K. B. Dissociation-Association of lactate dehydrogenase Isozymes: Influences on the formation of tetramers vs. dimers of M4-LDH and H4-LDH. International Journal of Biochemistry. 20 (11), 1261-1265 (1988).
  7. Sirover, M. A. Structural analysis of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase functional diversity. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 57, 20-26 (2014).
  8. Gupta, V., Bamezai, R. N. K. Human pyruvate kinase M2: A multifunctional protein: Multifunctional Human PKM2. Protein Science. 19 (11), 2031-2044 (2010).
  9. Wiegand, G., Remington, S. J. Citrate synthase: Structure, Control, and Mechanism. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 15, 97-117 (1986).
  10. Libonati, M., Gotte, G. Oligomerization of bovine ribonuclease A: structural and functional features of its multimers. Biochemical Journal. 380 (2), 311-327 (2004).
  11. Dutoit, R., et al. How metal cofactors drive dimer-dodecamer transition of the M42 aminopeptidase TmPep1050 of Thermotoga maritima. Journal of Biological Chemistry. 294 (47), 17777-17789 (2019).
  12. Rawlings, N. D., et al. The MEROPS database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors in 2017 and a comparison with peptidases in the PANTHER database. Nucleic Acids Research. 46 (1), 624-632 (2018).
  13. Neuwald, A. F., Liu, J. S., Lipman, D. J., Lawrence, C. E. Extracting protein alignment models from the sequence database. Nucleic Acids Research. 25 (9), 1665-1677 (1997).
  14. Dutoit, R., Brandt, N., Legrain, C., Bauvois, C. Functional Characterization of Two M42 Aminopeptidases Erroneously Annotated as Cellulases. PLoS ONE. 7 (11), 50639(2012).
  15. Franzetti, B., et al. Tetrahedral aminopeptidase: a novel large protease complex from archaea. The EMBO Journal. 21 (9), 2132-2138 (2002).
  16. Borissenko, L., Groll, M. Crystal Structure of TET Protease Reveals Complementary Protein Degradation Pathways in Prokaryotes. Journal of Molecular Biology. 346 (5), 1207-1219 (2005).
  17. Appolaire, A., et al. TET peptidases: A family of tetrahedral complexes conserved in prokaryotes. Biochimie. 122, 188-196 (2016).
  18. Russo, S., Baumann, U. Crystal Structure of a Dodecameric Tetrahedral-shaped Aminopeptidase. Journal of Biological Chemistry. 279 (49), 51275-51281 (2004).
  19. Schoehn, G., et al. An Archaeal Peptidase Assembles into Two Different Quaternary Structures: A tetrahedron and a giant octahedron. Journal of Biological Chemistry. 281 (47), 36327-36337 (2006).
  20. Durá, M. A., et al. The structural and biochemical characterizations of a novel TET peptidase complex from Pyrococcus horikoshii reveal an integrated peptide degradation system in hyperthermophilic Archaea: Characterization of P. horikoshii TET3 peptidase. Molecular Microbiology. 72 (1), 26-40 (2009).
  21. Basbous, H., Appolaire, A., Girard, E., Franzetti, B. Characterization of a Glycyl-Specific TET Aminopeptidase Complex from Pyrococcus horikoshii. Journal of Bacteriology. 200 (17), 00059(2018).
  22. Appolaire, A., et al. Small-angle neutron scattering reveals the assembly mode and oligomeric architecture of TET, a large, dodecameric aminopeptidase. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 70 (11), 2983-2993 (2014).
  23. Appolaire, A., et al. The TET2 and TET3 aminopeptidases from P yrococcus horikoshii form a hetero-subunit peptidasome with enhanced peptide destruction properties: TET aminopeptidase multi-subunit complex. Molecular Microbiology. 94 (4), 803-814 (2014).
  24. Colombo, M., Girard, E., Franzetti, B. Tuned by metals: the TET peptidase activity is controlled by 3 metal binding sites. Scientific Reports. 6 (1), 20876(2016).
  25. Petrova, T. E., et al. Structure of the dodecamer of the aminopeptidase APDkam598 from the archaeon Desulfurococcus kamchatkensis. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (3), 277-285 (2015).
  26. Kim, D., et al. Structural basis for the substrate specificity of PepA from Streptococcus pneumoniae, a dodecameric tetrahedral protease. Biochemical and Biophysical Research Communications. 391 (1), 431-436 (2010).
  27. Chevrier, B., et al. Crystal structure of Aeromonas proteolytica aminopeptidase: a prototypical member of the co-catalytic zinc enzyme family. Structure. 2, 283-291 (1994).
  28. Rosenbaum, E., Ferruit, M., Durá, M. A., Franzetti, B. Studies on the parameters controlling the stability of the TET peptidase superstructure from Pyrococcus horikoshii revealed a crucial role of pH and catalytic metals in the oligomerization process. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1814 (10), 1289-1294 (2011).
  29. Macek, P., et al. Unraveling self-assembly pathways of the 468-kDa proteolytic machine TET2. Science Advances. 3 (4), 1601601(2017).
  30. Edelheit, O., Hanukoglu, A., Hanukoglu, I. Simple and efficient site-directed mutagenesis using two single-primer reactions in parallel to generate mutants for protein structure-function studies. BMC Biotechnology. 9 (1), 61(2009).
  31. Zhang, Y., Werling, U., Edelmann, W. SLiCE: a novel bacterial cell extract-based DNA cloning method. Nucleic Acids Research. 40 (8), 55(2012).
  32. Schleif, R. AraC protein, regulation of the l-arabinose operon in Escherichia coli, and the light switch mechanism of AraC action. FEMS Microbiology Reviews. 34 (5), 779-796 (2010).
  33. McPherson, A., Gavira, J. A. Introduction to protein crystallization. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 70 (1), 2-20 (2014).
  34. Bergfors, T. Seeds to crystals. Journal of Structural Biology. 142 (1), 66-76 (2003).
  35. Dauter, Z. Collection of X-Ray Diffraction Data from Macromolecular Crystals. Protein Crystallography. 1607, 165-184 (2017).
  36. Powell, H. R. X-ray data processing. Bioscience Reports. 37 (5), 0227(2017).
  37. Battye, T. G. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. W. iMOSFLM a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 271-281 (2011).
  38. Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods in Enzymology. 276, 307-326 (1997).
  39. Clabbers, M. T. B., Gruene, T., Parkhurst, J. M., Abrahams, J. P., Waterman, D. G. Electron diffraction data processing with DIALS. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 74 (6), 506-518 (2018).
  40. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
  41. Legrand, P. legrandp/xdsme: March 2019 version working with the latest XDS version. , Jan 26, 2018. Zenodo (2019).
  42. Evans, P. Scaling and assessment of data quality. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62 (1), 72-82 (2006).
  43. Wlodawer, A., Minor, W., Dauter, Z., Jaskolski, M. Protein crystallography for non-crystallographers, or how to get the best (but not more) from published macromolecular structures: Protein crystallography for non-crystallographers. FEBS Journal. 275 (1), 1-21 (2008).
  44. Karplus, P. A., Diederichs, K. Assessing and maximizing data quality in macromolecular crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 34, 60-68 (2015).
  45. Taylor, G. L. Introduction to phasing. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 325-338 (2010).
  46. Rossmann, M. G., Blow, D. M. The detection of sub-units within the crystallographic asymmetric unit. Acta Crystallographica. 15, 24-31 (1962).
  47. Rossmann, M. G. The molecular replacement method. Acta Crystallographica Section A Foundations of Crystallography. 46 (2), 73-82 (1990).
  48. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674 (2007).
  49. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 213-221 (2010).
  50. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 486-501 (2010).
  51. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (1), 12-21 (2010).
  52. Zwart, P. H., Grosse-Kunstleve, R. W., Lebedev, A. A., Murshudov, G. N., Adams, P. D. Surprises and pitfalls arising from (pseudo)symmetry. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 64 (1), 99-107 (2008).
  53. Yeates, T. O. Detecting and overcoming crystal twinning. Methods in Enzymology. 276, 344-358 (1997).
  54. Terwilliger, T. C. Using prime-and-switch phasing to reduce model bias in molecular replacement. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 60 (12), 2144-2149 (2004).
  55. Terwilliger, T. C., et al. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 64 (1), 61-69 (2008).
  56. Krissinel, E., Henrick, K. Inference of Macromolecular Assemblies from Crystalline State. Journal of Molecular Biology. 372 (3), 774-797 (2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Zuivering van dodecamerenpreparatie van dimerengrootte-uitsluitingschromatografiemoleculaire vervangingPhenix-verfijningnative massaspectrometrie
X-Ray Kristallografie om de oligomerische staat overgang van de Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050 studie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.