Remmers van histonacetyltransferases (HAT's, ook bekend als lysine acetyltransferasen), zoals CBP/p300, zijn potentiële therapieën voor de behandeling van kanker. Er zijn echter rigoureuze methoden nodig om deze remmers te valideren. Drie in vitro methoden voor validatie omvatten HAT-tests met recombinant acetyltransferases, immunoblotting voor histonacetylatie in de celcultuur en ChIP-qPCR.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Assays voor het valideren van Histon Acetyltransferase Inhibitors
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Lysine acetyltransferases (KATs) katalyseren acetylatie van lysineresiduen op histonen en andere eiwitten om chromatinedynamica en genexpressie te reguleren. KATs, zoals CBP/p300, worden intensief onderzocht als therapeutische doelstellingen toe te schrijven aan hun kritieke rol in tumorigenese van diverse kankers. De ontwikkeling van nieuwe kleine molecuulremmers gericht op de histon acetyltransferase (HAT) functie van KATs is uitdagend en vereist robuuste tests die de specificiteit en potentie van potentiële remmers kunnen valideren.
Dit artikel schetst een pijplijn van drie methoden die rigoureuze in vitro validatie voor nieuwe HAT-remmers (HATi) bieden. Deze methoden omvatten een reageerbuis HAT-test, Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) test, en Chromatine Immunoprecipitatie-kwantitatieve PCR (ChIP-qPCR). In de HAT-test worden recombinant HAT's geïncubeerd met histonen in een reageerbuisreactie, waardoor specifieke lysineresiduen op de histonstaarten kunnen worden geaced. Deze reactie kan worden geblokkeerd door een HATi en de relatieve niveaus van site-specifieke histonacetylatie kunnen worden gemeten via immunoblotting. Remmers geïdentificeerd in de HAT-test moeten worden bevestigd in de cellulaire omgeving.
De ChHAI-test gebruikt immunoblotting om te screenen op nieuwe HATi die de robuuste hyperacetylatie van histonen verzwakt, veroorzaakt door een histone deacetylase inhibitor (HDACi). De toevoeging van een HDACi is nuttig omdat basale niveaus van histonacetylatie moeilijk te detecteren zijn via immunoblotting.
De HAT en ChHAI testen meten wereldwijde veranderingen in histon acetylatie, maar geven geen informatie over acetylatie in specifieke genomische regio's. Daarom wordt ChIP-qPCR gebruikt om de effecten van HATi op histonacetylatieniveaus op genregulerende elementen te onderzoeken. Dit wordt bereikt door selectieve immunoprecipitatie van histon-DNA complexen en analyse van het gezuiverde DNA via qPCR. Samen, deze drie tests zorgen voor de zorgvuldige validatie van de specificiteit, potentie, en werkingsmechanisme van de nieuwe HATi.
Inleiding
Lysine acetyltransferases (KAT's) katalyseren de acetylatie van lysineresiduen op zowel histon- als niet-histoneiwitten1,2,3,4. Recent onderzoek toont aan dat DE's en hun acetyltransferase functie kan bevorderen vaste tumorgroei4,5,6,7,8,9. Creb-bindend eiwit (CBP)/p300 zijn bijvoorbeeld twee paralogeuze KAT's die talrijke signaleringstrajecten b....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. In vitro HAT-test
- Buffervoorbereiding
LET OP: Zie tabel 1 voor bufferrecepten.- Bereid 5x testbuffer en 6x Natrium Dodecyl Sulfaat (SDS) en bewaar bij -20 °C. Aliquot SDS in 1 mL aliquots.
- Bereid 10x SDS gel running buffer en 10x TBST en op te slaan op kamertemperatuur.
- Bereid 1x transferbuffer voor en bewaar bij 4 °C.
LET OP: Controleer het veiligheidsinformatieblad voor alle chemische stoffen die in dit protocol worden gebruikt. SDS, DTT en bromofenolblauw zijn giftig en mogen niet worden ingenomen, ingeademd of blootgesteld aan de huid of ogen. Zie veiligheidsgegevens voor de juiste ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De in vitro histon acetyltransferase (HAT) test kan worden gebruikt om te sonde voor verbindingen die p300 HAT activiteit remmen in de richting van een histon substraat. Figuur 1A biedt een experimenteel schema voor de HAT-test. Anacardzuur, een bekende HATi3,38, werd gebruikt in deze test in een concentratiebereik van 12,5-100 μM. Bij 100 μM, anacardzuur downreguleert p300 gekatalyseerd histon acetylatie op Histone 3, Lysines 9 en 1.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Lysine acetyltransferases (KATs) acetylaat verschillende lysine residuen op histon staarten en transcriptie factoren om gen transcriptie te reguleren2,3. Uit onderzoek in de afgelopen twee decennia is gebleken dat KAT's, zoals CBP/p300, PCAF en GCN5, interageren met oncogene transcriptiefactoren en tumorgroei stimuleren in verschillende vaste tumortypen4,5,9,<.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten of onthullingen te maken.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door subsidies van James en Esther King Biomedical Research Program (6JK03 en 20K07), en Bankhead-Coley Cancer Research Program (4BF02 en 6BC03), Florida Department of Health, Florida Breast Cancer Foundation, en UF Health Cancer Center. Daarnaast willen we Dr. Zachary Osking en Dr. Andrea Lin bedanken voor hun steun tijdens het publicatieproces.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1.5 ml tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | Voor alle methoden |
| 10 cm dish | Sarstedt AG & Co. | 83.3902 | Voor celcultuur van MCF-7 cellen |
| 10 ul tips | Fisher Scientific | 02-707-454 | Voor alle methoden |
| 1000 ul tips | Corning | 4846 | Voor alle methoden |
| 10X Glycine buffer | Voor methode 3. Zie tabel 1 voor recept. | ||
| 10X Running Buffer | Voor methoden 1 en 2. Zie tabel 1 voor recept. | ||
| 10X TBST | Voor methoden 1 en 2. Zie tabel 1 voor recept. | ||
| 12 well plate | Corning | 3513 | Voor methode 2 |
| 15 cm dish | Sarstedt AG & Co. | 83.3903 | Voor methode 3 |
| 15 ml conical tube | Santa Cruz Biotechnology | sc-200249 | Voor methoden 2 en 3 |
| 1X TBST met 5% melk en 0.02% Sodium Azide | Voor methoden 1 en 2. Kan worden gebruikt om primaire antilichamen te verdunnen die meer dan één keer zullen worden gebruikt. Maakt kortetermijnopslag van primaire antilichaamverdunningen mogelijk. Niet gebruiken voor secundaire antilichaamdilutie. LET OP: Sodium Azide is giftig. | ||
| 1X TBST met 5% melk | Voor methoden 1 en 2. Gebruikt om PVDF-membraan te blokkeren en voor antilichaamverdunningen. Zie tabel 1 voor recept. | ||
| 200 ul tips | Corning | 4844 | Voor alle methoden |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | voor SDS-monsterbuffervoorbereiding |
| 4-20% polyacrylamide gel | Thermo Fisher: Invitrogen | XP04205BOX | Voor methoden 1 en 2 |
| 5X Assay buffer | Voor methode 1. Zie tabel 1 voor recept. | ||
| 5X Passive lysis buffer | Voor methode 2. Zie tabel 1 voor recept. | ||
| 6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Voor methoden 1 en 2. Zie tabel 1 voor recept. | ||
| A-485 | MedChemExpress | HY-107455 | CBP/p300-remmer voor gebruik in methoden 2 en 3. Opgelost in DMSO. |
| Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antilichaam | Cell Signaling Technology | 4771 | Voor methode 1 |
| Acetyl-CoA | Sigma-Aldrich | A2056 | voor gebruik in methode 1 |
| Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antilichaam (H3K27ac) | Cell Signaling Technology | CST 8173 | antilichamen voor H3K27ac voor immunoblots en ChIP |
| Acetyl-Histone H3 (Lys18) antilichaam (H3K18ac) | Cell Signaling Technology | CST 9675 | antilichamen voor H3K18ac voor immunoblots en ChIP |
| alpha tubulin antilichaam | Millipore Sigma | T5168 | Voor methode 2. Verdun 1:20.000 |
| Anacardic acid | Cayman Chemical | 13144 | Voor methode 1 |
| anti-muis IgG HRP-gekoppeld secundair antilichaam | Cell Signaling Technology | 7076 | Voor methoden 1 en 2. Verdun 1:10.000 |
| anti-konijn IgG secundair antilichaam | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | Voor methoden 1 en 2. Verdun 1:10.000 tot 1:20.000 |
| Autoradiografiefilm | MIDSCI | BX810 | Voor methoden 1 en 2 |
| Belly Dancer draaiend platform | Stovall Life Science Incorporated | niet beschikbaar | Voor methoden 1 en 2 |
| Bovine Calf Serum (BCS) | HyClone | SH30072.03 | celcultuurmedium |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | voor buffervoorbereiding |
| Bromofenolblauw | Sigma-Aldrich | B0126 | voor SDS-monsterbuffervoorbereiding |
| CDTA | Spectrum Chemical | 125572-95-4 | Voor buffervoorbereiding |
| celschraper | Millipore Sigma | CLS3010 | Voor methode 3 |
| ChIP-dilutiebuffer | Voor methode 3. Zie tabel 1 voor recept. | ||
| ChIP Elutie Buffer | Voor methode 3. Zie tabel 1 voor recept. | ||
| Complete DMEM voor MCF-7 cellen | Voor methoden 2 en 3. Zie tabel 1 voor recept. | ||
| Covaris 130 & microl microTUBE | Covaris | 520045 | Sonicatiebuis voor gebruik met Covaris S220 in methode 3 |
| Covaris S220 Focused-ultrasonicator | Covaris | S220 | DNA-sonicator voor gebruik in methode 3 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 41639 | voor medicijnverdunning en voertuigcontrolebehandeling |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | voor SDS-monsterbuffervoorbereiding |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | celcultuurmedium |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | voor buffervoorbereiding |
| Voorbeeld overdrachtstank en overdrachtsapparaat | Bio-rad | 1704070 | Voor methoden 1 en 2 |
| EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit | Millipore Sigma | 17-10086 | Voor methode 3 |
| FK228 (Romidepsin) | Cayman Chemical | 128517-07-7 | HDAC-remmer voor gebruik in methode 2 |
| Formaldehyde-oplossing | Sigma-Aldrich | F8775 | voor celfixatie |
| glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | Voor buffervoorbereiding |
| glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | voor buffervoorbereiding |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 54457 | voor buffervoorbereiding |
| Hoge zoutwasbuffer | Voor methode 3 | ||
| IGEPAL (NP-40) | Sigma-Aldrich | I3021 | voor buffer |
Referenties
- Simon, R. P., Robaa, D., Alhalabi, Z., Sippl, W., Jung, M. KATching-Up on Small Molecule Modulators of Lysine Acetyltransferases. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (4), 1249-1270 (2016).
- Weinert, B. T., et al. Time-Resolved Analysis Reveal....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
