Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Assays voor het valideren van Histon Acetyltransferase Inhibitors

6.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61289

⸱

6 augustus 2020

 , 
1Department of Anatomy and Cell Biology, and UF Health Cancer Center, University of Florida College of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Remmers van histonacetyltransferases (HAT's, ook bekend als lysine acetyltransferasen), zoals CBP/p300, zijn potentiële therapieën voor de behandeling van kanker. Er zijn echter rigoureuze methoden nodig om deze remmers te valideren. Drie in vitro methoden voor validatie omvatten HAT-tests met recombinant acetyltransferases, immunoblotting voor histonacetylatie in de celcultuur en ChIP-qPCR.

Samenvatting

Lysine acetyltransferases (KATs) katalyseren acetylatie van lysineresiduen op histonen en andere eiwitten om chromatinedynamica en genexpressie te reguleren. KATs, zoals CBP/p300, worden intensief onderzocht als therapeutische doelstellingen toe te schrijven aan hun kritieke rol in tumorigenese van diverse kankers. De ontwikkeling van nieuwe kleine molecuulremmers gericht op de histon acetyltransferase (HAT) functie van KATs is uitdagend en vereist robuuste tests die de specificiteit en potentie van potentiële remmers kunnen valideren.

Dit artikel schetst een pijplijn van drie methoden die rigoureuze in vitro validatie voor nieuwe HAT-remmers (HATi) bieden. Deze methoden omvatten een reageerbuis HAT-test, Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) test, en Chromatine Immunoprecipitatie-kwantitatieve PCR (ChIP-qPCR). In de HAT-test worden recombinant HAT's geïncubeerd met histonen in een reageerbuisreactie, waardoor specifieke lysineresiduen op de histonstaarten kunnen worden geaced. Deze reactie kan worden geblokkeerd door een HATi en de relatieve niveaus van site-specifieke histonacetylatie kunnen worden gemeten via immunoblotting. Remmers geïdentificeerd in de HAT-test moeten worden bevestigd in de cellulaire omgeving.

De ChHAI-test gebruikt immunoblotting om te screenen op nieuwe HATi die de robuuste hyperacetylatie van histonen verzwakt, veroorzaakt door een histone deacetylase inhibitor (HDACi). De toevoeging van een HDACi is nuttig omdat basale niveaus van histonacetylatie moeilijk te detecteren zijn via immunoblotting.

De HAT en ChHAI testen meten wereldwijde veranderingen in histon acetylatie, maar geven geen informatie over acetylatie in specifieke genomische regio's. Daarom wordt ChIP-qPCR gebruikt om de effecten van HATi op histonacetylatieniveaus op genregulerende elementen te onderzoeken. Dit wordt bereikt door selectieve immunoprecipitatie van histon-DNA complexen en analyse van het gezuiverde DNA via qPCR. Samen, deze drie tests zorgen voor de zorgvuldige validatie van de specificiteit, potentie, en werkingsmechanisme van de nieuwe HATi.

Inleiding

Lysine acetyltransferases (KAT's) katalyseren de acetylatie van lysineresiduen op zowel histon- als niet-histoneiwitten1,2,3,4. Recent onderzoek toont aan dat DE's en hun acetyltransferase functie kan bevorderen vaste tumorgroei4,5,6,7,8,9. Creb-bindend eiwit (CBP)/p300 zijn bijvoorbeeld twee paralogeuze KAT's die talrijke signaleringstrajecten bij kanker2,3reguleren . CBP/p300 hebben een goed gekarakteriseerde histon acetyltransferase (HAT) functie en katalyseren Histone 3 Lysine 27 acetylatie (H3K27ac)2,4,5,10,11, een belangrijke marker voor actieve versterkers, promotor regio's en actieve gen transcriptie12,13,14. CBP/p300 dienen als kritische co-activators voor pro-groeisignaleringstrajecten in vaste tumoren door transcriptie van oncogenen te activeren door acetylatie van histonen en andere transcriptiefactoren4,9,15,16,17,18.9 Vanwege hun rol in tumorprogressie worden CBP/p300 en andere KAT's onderzocht op de ontwikkeling van nieuwe remmers die hun oncogene functie4,5,6,7,,8,9,18,19,20blokkeren . A-485 en GNE-049 vertegenwoordigen twee succesvolle pogingen om krachtige en specifieke remmers te ontwikkelen voor CBP/p3004,9. Aanvullende remmers worden momenteel onderzocht voor CBP/p300 en andere KAT's.

De kwaliteit van eerder beschreven KAT-remmers (KATi) wordt in twijfel getrokken, waarbij veel remmers met doeleffecten en slechte karakterisering21pronken. Daarom is rigoureuze karakterisering en validatie van nieuwe kandidaat-geneesmiddelen essentieel voor de ontwikkeling van hoogwaardige chemische sondes. Hier beschreven zijn drie protocollen die een pijplijn vormen voor screening en rigoureus valideren van de potentie en specificiteit van nieuwe KATi, met een specifieke focus op het remmen van de HAT-functie (HATi) van KATs. CBP/p300 en hun remmers worden gebruikt als voorbeelden, maar deze protocollen kunnen worden aangepast voor andere KAT's die een HAT-functiehebben 7.

Het eerste protocol is een in vitro histon acetyltransferase (HAT) test die gezuiverde recombinant p300 en histonen gebruikt in een gecontroleerde reageerbuisreactie. Deze test is eenvoudig uit te voeren, is kosteneffectief, kan worden gebruikt om verbindingen te screenen in een lage doorvoerinstelling en vereist geen radioactieve materialen. In dit protocol wordt recombinant p300 lysineacetylatie op histonstaarten tijdens een korte incubatieperiode en de niveaus van histonacetylatie gemeten met behulp van standaard immunoblottingsprocedures. De enzymatische reactie kan worden uitgevoerd in de aanwezigheid of afwezigheid van CBP/p300-remmers om te screenen op verbindingen die histonacetylatie verminderen. Bovendien kan de HAT-test worden gebruikt om na te gaan of nieuwe verbindingen selectief zijn voor cbp/p300 door hun activiteit te beoordelen op andere gezuiverde KAT's, zoals PCAF. De HAT-test is een uitstekend uitgangspunt voor het onderzoeken van nieuwe remmers vanwege de eenvoud, lage kosten en de mogelijkheid om de potentie/selectiviteit van een remmer te bepalen. Inderdaad, dit protocol wordt vaak gebruikt in de literatuur als een in vitro scherm5,10. Echter, remmers geïdentificeerd in de HAT-test zijn niet altijd effectief in de celcultuur, omdat een reageerbuis reactie is veel eenvoudiger dan een levend celsysteem. Daarom is het essentieel om remmers verder te karakteriseren in celkweekexperimenten22,23.

Het tweede protocol in de pijplijn is de Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) test. Deze cel gebaseerde test maakt gebruik van histone deacetylase remmers (HDACi) als een instrument om histonen hyperacetylate in chromatine voor co-incubatie met een HATi24. Basale histonacetylatie kan laag zijn in de celcultuur, waardoor het moeilijk is om via immunoblotting te sonde zonder de toevoeging van een HDACi om acetylatie te verhogen. Het doel van de ChHAI-test is het identificeren van nieuwe HATi die de toename van histonacetylatie veroorzaakt door HDAC-remming kan verzachten. De voordelen van deze test zijn de lage kosten, relatieve gemak uit te voeren, en het gebruik van cellen in de cultuur, die meer fysiologische relevantie dan de reageerbuis HAT test biedt. Net als bij de HAT-test maakt dit protocol gebruik van standaard immunoblotting voor het verzamelen van gegevens.

De HAT en ChHAI testen geven gegevens over de potentie van nieuwe verbindingen voor het remmen van wereldwijde histonacetylatie, maar geven geen inzicht in hoe deze verbindingen wijzigingen in specifieke genomische regio's beïnvloeden. Daarom is het uiteindelijke protocol, Chromatin Immunoprecipitation-quantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR) een celkweekexperiment dat DNA-eiwitinteracties onderzoekt in specifieke gebieden van het genoom. In het ChIP-protocol wordt chromatine gekoppeld om DNA-eiwitinteracties te behouden. De chromatine wordt vervolgens uit cellen geëxtraheerd en het DNA-eiwitcomplex ondergaat selectieve immunoprecipitatie voor het eiwit van belang (bijvoorbeeld met behulp van een antilichaam specifiek voor H3K27ac). Het DNA wordt vervolgens gezuiverd en geanalyseerd met behulp van qPCR. ChIP-qPCR kan bijvoorbeeld worden gebruikt om te bepalen of een nieuwe HATi histonacetylatie downreguleert bij individuele oncogenen, zoals Cyclin D125. Hoewel ChIP-qPCR een veelgebruikte techniek is die in het veld wordt gebruikt, kan het moeilijk zijn om4,10,,26te optimaliseren . Dit protocol biedt tips voor het vermijden van mogelijke valkuilen die kunnen optreden tijdens het uitvoeren van de ChIP-qPCR-procedure en bevat kwaliteitscontroles die op de gegevens moeten worden uitgevoerd.

Wanneer ze samen worden gebruikt, maken deze drie protocollen het mogelijk om nieuwe HATi rigoureus te karakteriseren en valideren. Bovendien bieden deze methoden veel voordelen omdat ze gemakkelijk uit te voeren zijn, relatief goedkoop en gegevens te verstrekken over zowel wereldwijde als regionale histonacetylatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. In vitro HAT-test

  1. Buffervoorbereiding
    LET OP: Zie tabel 1 voor bufferrecepten.
    1. Bereid 5x testbuffer en 6x Natrium Dodecyl Sulfaat (SDS) en bewaar bij -20 °C. Aliquot SDS in 1 mL aliquots.
    2. Bereid 10x SDS gel running buffer en 10x TBST en op te slaan op kamertemperatuur.
    3. Bereid 1x transferbuffer voor en bewaar bij 4 °C.
      LET OP: Controleer het veiligheidsinformatieblad voor alle chemische stoffen die in dit protocol worden gebruikt. SDS, DTT en bromofenolblauw zijn giftig en mogen niet worden ingenomen, ingeademd of blootgesteld aan de huid of ogen. Zie veiligheidsgegevens voor de juiste afhandelingsprocedures. Gebruik een chemische rookkap voor het hanteren van gevaarlijke chemicaliën.
  2. HAT reactie
    OPMERKING: Anacardzuur is een bekende p300-remmer3 en wordt gebruikt als voorbeeld om aan te tonen hoe de HAT-test nieuwe p300-remmers kan identificeren. Zie Aanvullend Protocol (Schematisch 1) voor een schema van stap 1.2.1.
    1. Bereid de volgende enzymatische reactie voor in een 0,2 mL PCR-buis: 2 μL 5x testbuffer, 1 μL gezuiverde p300 (0,19 μg/μL), 1 μL anacardzuur (HATi) of DMSO-regeling verdund in 1x testbuffer en 2 μL autogeklaved ddH2O. Pre-incubeer dit mengsel gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 3 μL van 100 μM Acetyl-CoA en 1 μL gezuiverde H3.1 (0,2 μg/μL) aan de reactie toe.
    2. Het volledige reactiemengsel incubeer bij 30 °C gedurende 1 uur in een PCR thermische cycler.
    3. Voeg 2-mercaptoethanol toe met een verhouding van 1:10 aan de 6x SDS-monsterbuffer.
    4. Verwijder monsters uit de PCR thermal cycler en voeg 2 μL 6x SDS (met 2-mercaptoethanol toegevoegd) toe aan het reactiemengsel.
      LET OP: 2-mercaptoethanol is giftig en moet worden gebruikt in een chemische rookkap. Zie veiligheidsgegevens voor een goede behandeling.
    5. Verwarm monsters bij 95 °C gedurende 5 minuten op een warmteblok en koel af op ijs. Bewaar de monsters op -20 of -80 °C of voer gelelektroforese en immunoblotting uit zoals hieronder beschreven.
  3. Gel elektroforese en immunoblotting
    OPMERKING: Als u niet bekend bent met gelelektroforese en immunoblotting, raadpleegt u deze standaardprocedure27 voor meer informatie over het uitvoeren van stappen 1.3.1-1.3.17. Aanvullende informatie is hier te vinden28,29,30,31,32,33.
    1. Pipette 10 μL monsters (vanaf stap 1.2.5.) in de putten van een 4-20% gradiënt polyacrylamide gel. Pipette 5 μL eiwitladder in één van de putten als moleculaire gewichtsverwijzing. Voer de gel op 120 V voor 90 min met behulp van een gel tank.
    2. Breng de gel met behulp van een transfertank 70 minuten over op een polyvinylideen difluoride (PVDF) membraan bij 100 V gedurende 70 minuten.
    3. Haal het membraan uit het transferapparaat en plaats het in een plastic container. Blokkeer het membraan door 1x TBST (met 5% melk) aan de container toe te voegen en schud voorzichtig 1 uur bij kamertemperatuur.
    4. Verwijder de 1x TBST uit stap 1.3.3. Incubeer het membraan 's nachts met geselecteerde locatiespecifieke acetylantilichamen (bijvoorbeeld H3K18ac of H3K27ac primaire antilichamen bij een 1:5.000 verdunning in 1x TBST met 5% melk) bij 4 °C met zacht schudden.
    5. Verwijder de primaire antilichaamoplossing. Was het membraan 2x met 1x TBST (geen melk) bij kamertemperatuur met zacht schudden gedurende 15 min per wasbeurt.
    6. Verdun het secundaire antilichaam bij 1:20.000 in 1x TBST (met 5% melk) en incubbateren het membraan gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met zacht schudden.
    7. Verwijder de secundaire antilichaamoplossing. Was het membraan 2x met 1x TBST (geen melk) bij kamertemperatuur met zacht schudden gedurende 15 min per wasbeurt.
    8. Giet de 1x TBST uit het membraan. Meng hrp-substraatperoxideoplossing en HRP-substraat luminoloplossing in een 1:1-verhouding (1 mL van elk) en pipet 2 mL van de gecombineerde oplossing met het membraanoppervlak.
    9. Broed de oplossing met het membraan gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    10. Giet overtollig chemiluminescent substraat van het membraan af op een papieren handdoek en plaats het membraan in plastic folie in een röntgencassettehouder.
    11. Ga naar een donkere kamer gewijd aan x-ray film verwerking. Stel het membraan bloot aan een röntgenfilm door de film bovenop het membraan te plaatsen en de cassette voor 30 s te sluiten.
      OPMERKING: Het contacttijd tussen de film en het membraan moet experimenteel worden bepaald. Sterke signalen hebben korte belichtingen (seconden) nodig en zwakkere signalen kunnen langere belichtingen nodig hebben.
    12. Verwijder de röntgenfilm uit de cassette en verwerk de film door deze door een röntgenfilmprocessor te laten lopen. Raadpleeg de handleidingen van de fabrikant voor specifieke instructies voor het verwerken van de röntgenfilm.
    13. Haal het membraan uit de plastic folie en was het met ddH2O gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur met zacht schudden.
    14. Incubeer het membraan met 0,2 M NaOH gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur met zacht schudden.
    15. Was het membraan met ddH2O gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur met zacht schudden.
    16. Blokkeer het membraan door 1x TBST (met 5% melk) aan de container toe te voegen en schud voorzichtig 1 uur bij kamertemperatuur.
    17. Voeg de volgende primaire antilichaamverdunning toe (bijvoorbeeld sonde voor H3K27ac als het eerste gebruikte antilichaam H3K18ac was) en schud 's nachts bij 4 °C. Herhaal stap 1.3.4-1.3.17 totdat alle antilichaamsondes zijn voltooid.

2. ChHAI-test

  1. In vitro medicamenteuze behandelingen en analyse van geacetyleerde histonen
    LET OP: A-485 is een krachtige en goed gekarakteriseerde p300 HATi2,4 . Deze remmer zal worden gebruikt in de resterende tests als gevolg van de werkzaamheid en specificiteit in de celcultuur. MS-275 (Entinostat)24 is een HDACi die de histonacetylatieniveaus aanzienlijk verhoogt en wordt gebruikt om de detectie van acetylatiesondes met standaard immunoblotting gemakkelijker te detecteren. Zie Aanvullend protocol (Schematisch 2) voor een schema van de verdunningen van geneesmiddelen die in stap 2.1 worden gebruikt.
    1. Zaad 100.000 MCF-7 cellen in een 12 putplaat en laat cellen groeien tot 80-90% samenvloeiing in 1 mL celkweekmedium. Markeer de putten voor het volgende experimentele ontwerp: goed 1: DMSO-besturingselement (referentiepunt); goed 2: A-485 (3 μM); goed 3: A-485 (10 μM); goed 4: MS-275 (3 μM); goed 5: MS-275 (3 μM) + A-485 (3 μM); goed 6: MS-275 (3 μM) + A-485 (10 μM).
      OPMERKING: Voor het kweken van MCF-7 cellen gebruikt u complete DMEM-media en laat u cellen groeien bij 37 °C met 5% CO2. Zie Tabel 1 voor het volledige DMEM recept.
    2. Om 24 uur na het zaaien, pipette 4 mL van volledige DMEM media naar een steriele 15 mL conische buis. Pipet 2 μL MS-275 (6 mM in DMSO) tot 4 mL medium voor een uiteindelijke concentratie van 3 μM MS-275.
    3. Pipette 2 μL DMSO tot 4 mL medium in een aparte steriele 15 mL conische buis.
      LET OP: Controleer het veiligheidsinformatieblad voor een goede behandeling van DMSO. Sommige soorten handschoenen zijn niet geschikt voor het hanteren van DMSO.
    4. Aspirate de cel cultuur medium van putten 4-6 en pipet 1 mL van 3 μM MS-275 in medium (stap 2.1.2) om elke put. Gooi ongebruikte verdunde MS-275 weg.
    5. Aspirate de cel cultuur medium van putten 1-3 en pipet 1 mL van verdunde DMSO (stap 2.1.3) om elke put. Gooi ongebruikte verdunde DMSO weg.
    6. Breng de cellen terug naar de couveuse en broed gedurende 4 uur om ophoping van geacetyleerde histonen mogelijk te maken in cellen die zijn blootgesteld aan MS-275 (putten 4-6).
      OPMERKING: MS-275 is een HDACi en zal histon hyperacetylatie24veroorzaken. Deze 4 uur pre-incubatie is nodig om MS-275 hyperacetylatie te laten induceren vóór de toevoeging van A-485, wat histonacetylatie2,4vermindert .
    7. Bereid na 4 uur incubatie met MS-275 de volgende verdunningen in afzonderlijke steriele 1,5 mL-buizen door pipetteren: 1,0 μL DMSO tot 1 mL DMEM-media; 0,5 μL DMSO en 0,5 μL A-485 (6 mM) tot 1 mL DMEM-media; 0,5 μL DMSO en 0,5 μL A-485 (20 mM) tot 1 mL DMEM-media; 0,5 μL DMSO en 0,5 μL MS-275 (6 mM) tot 1 mL DMEM-media; 0,5 μL A-485 (6 mM) en 0,5 μL MS-275 (6 mM) tot 1 mL DMEM-media; 0,5 μL A-485 (20 mM) en 0,5 μL MS-275 (6 mM) tot 1 mL DMEM-media.
    8. Aspirate de cel cultuur medium van putten 1-6 en pipet 1 mL van verdunning 1 tot goed 1, verdunning 2 tot goed 2, verdunning 3 tot goed 3, verdunning 4 tot goed 4, verdunning 5 tot goed 5, en verdunning 6 tot goed 6.
      OPMERKING: Een algemene regel is om DMSO (solvent) gehalte in evenwicht te brengen tussen experimentele groepen en niet meer dan 0,1% DMSO-gehalte in celcultuur te overschrijden om cellulaire toxiciteit en veranderingen in proliferatie te voorkomen.
    9. Breng de cellen terug naar de couveuse en cultuur voor 20 uur.
    10. Na 20 uur, aspirate de cel cultuur medium van putten 1-6.
    11. Was de cellen door 1 mL PBS te pipetten naar putten 1-6. De PBS aanzuigen.
    12. Voeg 100 μL 1x passieve lysebuffer (zie tabel 1)toe aan putten 1-6. Bewaar celkweekplaat (met monsters in passieve lysebuffer) bij −80 °C 's nachts voor vriesdooi en lyse van cellen.
      LET OP: Controleer het veiligheidsinformatieblad voor alle chemische stoffen voordat u buffers maakt. CDTA kan ernstig oogletsel en irritatie veroorzaken.
    13. Dooi monsters bij kamertemperatuur met zachte schudden gedurende 10 min. Breng monsters over om buizen van 1,5 mL te scheiden en plaats onmiddellijk op ijs.
    14. Meet de eiwitconcentratie van elk monster. De eiwitconcentratie kan worden bepaald aan de hand van verschillende gevestigde protocollen34.
    15. Equilibrate eiwitconcentratie tussen monsters 1-6 (in een gelijk volume) met behulp van 1x passieve lyse buffer te verdunnen, indien nodig.
    16. Voeg 2-mercaptoethanol toe met een verhouding van 1:10 tot 6x SDS-monsterbuffer.
    17. Voeg 6x SDS-monsterbuffer met 2-mercaptoethanol toe aan monsters 1-6 aan een uiteindelijke concentratie van 1x SDS-monsterbuffer.
    18. Verwarm monsters bij 95 °C gedurende 5 minuten op een warmteblok en koel af op ijs. Monsters kunnen tot stap 2.1.19 worden opgeslagen bij -20 °C of -80 °C.
    19. Pipette een volume met 30 μg eiwit voor monsters 1-6 aan de putten in een 4-20% gradiënt polyacrylamide gel. Immunoblotting procedure uitvoeren volgens protocol beschreven in Protocol 1.

3. ChIP-qPCR

OPMERKING: Het onderstaande protocol wordt beschreven voor remmers van p300 als voorbeeld.

  1. Buffervoorbereiding
    LET OP: Zie tabel 1 voor bufferrecepten. De algemene stappen van het ChIP-protocol (bijv. bufferrecepten, wastijden en centrifugatietijden) hieronder worden aangepast en aangepast aan de aanbevelingen van de fabrikant van een commercieel verkrijgbaar kit (zie Tabel van materialen)en uit de literatuur35,36.
    1. Bereid de ChIP verdunningsbuffer, de zwellingbuffer van de kernen, een lage zoutwasbuffer, een hoge zoutwasbuffer, licl-wasbuffer en TE-buffer voor. Bewaar bij 4 °C.
    2. Bereid de SDS lyse buffer, 10x glycine buffer en ChIP elution buffer voor. Bewaar op kamertemperatuur.
      LET OP: Controleer het veiligheidsinformatieblad voor alle chemische stoffen voordat u buffers maakt om een goede behandeling te garanderen.
  2. Medicamenteuze behandeling
    OPMERKING: Zie Aanvullend Protocol (Schematisch 3) voor een schema van de verdunningen van geneesmiddelen die in stap 3.2 worden gebruikt.
    1. Zaad MCF-7 cellen in twee 15 cm kweekschotels en kweekcellen tot 90% samenvloeiing in 12 mL van het volledige DMEM-medium. Markeer de gerechten voor het volgende experimentele ontwerp: Gerecht 1: DMSO-controle (referentiepunt); Schotel 2: A-485 (3 μM).
      OPMERKING: Voor het kweken van MCF-7 cellen, gebruik maken van complete DMEM media en groeien bij 37 °C met 5% CO2. Zie Tabel 1 voor het volledige DMEM recept.
    2. In een steriele conische buis van 15 mL, pipet 12 mL DMEM-media en pipet 6 μL DMSO. Meng goed.
    3. In een aparte steriele conische buis van 15 mL, pipet 12 mL DMEM-media en pipet 6 μL A-485 (6 mM in DMSO) om een uiteindelijke concentratie van 3 μM A-485 te krijgen. Meng goed.
    4. De media van schotel 1 en 2 aanzuigen.
    5. Voeg de 12 mL verdunde DMSO in DMEM (stap 3.2.2.) toe aan schotel 1.
    6. Voeg de 12 mL van 3 μM A-485 in DMEM (stap 3.2.3.) toe aan schotel 2.
    7. Breng de celkweekgerechten terug naar de couveuse en broed je 24 uur.
  3. Celfixatie
    1. Pipette 330 μL (27,5 μL per mL) van 37% formaldehyde naar de volledige media en draai de plaat voorzichtig om te mengen.
      LET OP: Formaldehyde is giftig. Zie veiligheidsgegevens voor de juiste afhandelingsprocedures.
    2. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Pipette 2 mL van 10x glycine aan de plaat en wervelen om te mengen.
    4. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    5. Na incubatie, plaats gerechten op ijs en ontdooien een aliquot van protease remmer cocktail.
    6. Bereid de volgende oplossingen voor zowel de DMSO- als de A-485-monsters voor met behulp van de buffers die in stap 3.1 zijn opgesteld.
      1. 2 mL PBS met een verdunning van 1:1.000 van de proteaseremmercocktail
      2. 1 mL van kernen zwelling buffer met een 1:1,000 verdunning van de proteaseremmer cocktail
      3. 0,5 mL SDS lyse buffer met een verdunning van 1:1.000 van de proteaseremmercocktail
    7. Aspirate de media uit de celkweek gerechten en was de cellen twee keer met 15 mL koude PBS.
    8. Pipette 2 mL PBS met de proteaseremmercocktail (stap 3.3.6.1) naar de celkweekgerechten. Til de cellen in oplossing met behulp van een cel schraper.
    9. Breng de celsuspensie over naar een microcentrifugebuis. Verzamel indien nodig de resterende cellen met extra PBS.
    10. Draai buizen met 800 x g bij 4 °C gedurende 5 minuten om de cellen te pelleteren.
    11. Aspirate de supernatant en pipet 1 mL van kernen zwelling buffer met de protease remmer cocktail (stap 3.3.6.2) naar de pellet. Resuspend de pellet en incubeer op ijs voor 10 min.
    12. Centrifugeren de buizen op 2.700 x g bij 4 °C gedurende 5 minuten tot pelletkernen.
    13. Aspirate de supernatant en pipet 0,5 mL SDS lyse buffer met de protease remmer cocktail (stap 3.3.6.3) naar de pellet. Resuspend de pellet en incubeer op ijs voor 10 min.
    14. Bewaar de chromatinemonsters bij -80 °C tot stap 3.4.1 of ga onmiddellijk door naar stap 3.4.
  4. DNA-sonatie
    1. Breng 130 μL chromatine uit DMSO-monster (stap 3.3.14) over naar twee DNA-sonische buizen met behulp van een pipet (elk 130 μL).
    2. Breng 130 μL chromatine over van het A-485 monster (stap 3.3.14) naar twee DNA-sonische buizen met behulp van een pipet (elk 130 μL).
    3. Soniceer het DNA tot ongeveer 150-200 basispaarfragmenten met behulp van de volgende sonicator-instellingen: Peak Incident Power (W) van 175, Duty Factor van 10%, 200 cycli per burst en 430 s behandelingstijd.
      OPMERKING: De instellingen voor sonicatie kunnen verschillen tussen modellen en de instellingen moeten mogelijk worden aangepast om de juiste fragmentgrootte voor verschillende cellijnen te bereiken.
    4. Houd monsters op ijs na sonicatie.
    5. Breng de gesonische chromatine met behulp van een pipet en centrifuge bij 10.000 x g bij 4 °C gedurende 10 minuten over op een buis van 10 mL.
    6. Pipette de supernatant (bevat gesonische chromatine) naar een nieuwe buis en gooi het puin. Sonicated chromatine kan worden opgeslagen bij -80 °C.
  5. Chromatine immunoprecipitatie (ChIP)
    OPMERKING: Zie Aanvullend Protocol (Schematic 3) voor een schema van de IP-groepen in stap 3.5.
    1. Meet het eiwitgehalte van de gesonische chromatine voor de DMSO- en A-485-monsters van stap 3.4.6. Eiwitgehalte kan worden gemeten met behulp van gevestigde protocollen34.
      OPMERKING: Voor de eenvoud gaat dit protocol ervan uit dat het eiwitgehalte gelijk is en 100 μL sonisch chromatine wordt gebruikt. Anders moet het eiwitgehalte in gelijke mate tussen alle monsters worden geëquilibreerd.
    2. Pipette 100 μL dmso-gesononiceerde chromatine tot twee 1,5 mL-buizen (elk 100 μL). Pipette 400 μL chip verdunningsbuffer (met een verdunning van 1:1.000 van de proteaseremmercocktail) naar elke buis om het totale volume tot 500 μL te brengen. Verwijder 5 μL van de oplossing uit een van de buizen en bewaar bij -20 °C als DMSO-invoer.
    3. Pipette 100 μL a-485 gesononiceerde chromatine tot twee 1,5 mL buizen (elk 100 μL). Pipette 400 μL chip verdunningsbuffer (met een verdunning van 1:1000 van de proteaseremmercocktail) naar elke buis om het totale volume tot 500 μL te brengen. Verwijder 5 μL van de oplossing uit een van de buizen en bewaar bij -20 °C als A-485 Input.
    4. Voeg met behulp van een pipet het antilichaam (IMMUNOprecipitatie) (bijvoorbeeld niet-specifieke IgG-controle of H3K27ac-specifiek antilichaam) toe aan de overeenkomstige buizen voor de DMSO- en A-485-monsters: IP-#1 DMSO-chromatine met IgG-antilichamen (5-10 μg); IP-#2 DMSO-chromatine met H3K27ac-antilichaam (5-10 μg); IP-#3 A-485 chromatine met IgG-antilichaam (5-10 μg); IP-#4 A-485 chromatine met H3K27ac-antilichaam (5-10 μg).
    5. Voeg 20 μL eiwit toe Aan elke buis een magnetische kralen. Zorg ervoor dat de kralen zijn goed geresuspended.
    6. Draai de monsters 's nachts op 4 °C.
    7. Pellet het eiwit Een magnetische kralen met behulp van een magnetische afscheider en verwijder de supernatant. Stoor de kralen niet.
    8. Was de kralen met 500 μL tot 1 mL van de lage zoutwasbuffer en draai 5 min bij 4 °C. Voer een snelle spin down, pellet de kralen met behulp van een magnetische afscheider, en verwijder de supernatant.
    9. Was de kralen met 500 μL tot 1 mL van de hoge zoutwasbuffer en draai 5 min bij 4 °C. Voer een snelle spin down, pellet de kralen met behulp van een magnetische afscheider, en verwijder de supernatant.
    10. Was de kralen met 500 μL tot 1 mL van de LiCl wasbuffer en draai gedurende 5 minuten bij 4 °C. Voer een snelle spin down, pellet de kralen met behulp van een magnetische afscheider, en verwijder de supernatant.
    11. Was de kralen met 500 μL tot 1 mL TE-buffer en draai gedurende 5 minuten bij 4 °C. Voer een snelle spin down uit. Bewaar de kralen in de TE-buffer tot stap 3.5.14.
    12. Verwijder inputmonsters (vanaf stap 3.5.2 en 3.5.3) uit de vriezer en houd ze op ijs.
    13. Ontdooi een aliquot van Proteinase K.
    14. Pellet de kralen met behulp van een magnetische afscheider en verwijder de TE buffer uit de kralen (vanaf stap 3.5.11).
    15. Voeg 100 μL ChIP elutiebuffer + 1 μL Proteinase K toe aan elk monster, inclusief de inputmonsters. Incubeermonsters met schudden op 62 °C gedurende 2 uur met behulp van een thermocycler.
    16. Na 2 uur worden de monsters gedurende 10 minuten met behulp van een thermocycler op 95 °C geplaatst.
    17. Koel de monsters af op kamertemperatuur.
    18. Pellet magnetische kralen met behulp van een magnetische afscheider en overdracht supernatant (bevat het DNA van belang) naar een nieuwe 1,5 mL buis.
    19. Zuiver het DNA met behulp van een standaard PCR cleanup kit.
    20. Het gezuiverde DNA kan worden opgeslagen bij -20 °C en kan worden gebruikt als sjablonen in standaard qPCR-protocollen. Volg de protocollen van de fabrikant voor het uitvoeren van qPCR.
  6. ChIP-qPCR-gegevensanalyse
    OPMERKING: Twee veelvoorkomende methoden om ChIP-qPCR-resultaten te analyseren zijn vouwverrijking ten opzichte van het IgG-antilichaam en de 1% invoermethode. Een uitstekende sjabloon voor beide analysemethoden wordt geleverd door een commerciële bron kan worden gebruikt om snel te berekenen vouwverrijking voor elk IP-antilichaam / doel van belang37.
    1. Om vouwverrijking en % invoer te berekenen, worden de ΔCt-waarden van de qPCR-gegevens die voor elk antilichaam zijn verkregen (niet-specifieke IgG, het IP H3K27ac-antilichaam en het invoer van 1%) automatisch in het overeenkomstige gebied in de analysesjabloon en de fold enrichment en opbrengst % invoer automatisch ingevuld.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De in vitro histon acetyltransferase (HAT) test kan worden gebruikt om te sonde voor verbindingen die p300 HAT activiteit remmen in de richting van een histon substraat. Figuur 1A biedt een experimenteel schema voor de HAT-test. Anacardzuur, een bekende HATi3,38, werd gebruikt in deze test in een concentratiebereik van 12,5-100 μM. Bij 100 μM, anacardzuur downreguleert p300 gekatalyseerd histon acetylatie op Histone 3, Lysines 9 en 1...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Lysine acetyltransferases (KATs) acetylaat verschillende lysine residuen op histon staarten en transcriptie factoren om gen transcriptie te reguleren2,3. Uit onderzoek in de afgelopen twee decennia is gebleken dat KAT's, zoals CBP/p300, PCAF en GCN5, interageren met oncogene transcriptiefactoren en tumorgroei stimuleren in verschillende vaste tumortypen4,5,9,<...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten of onthullingen te maken.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door subsidies van James en Esther King Biomedical Research Program (6JK03 en 20K07), en Bankhead-Coley Cancer Research Program (4BF02 en 6BC03), Florida Department of Health, Florida Breast Cancer Foundation, en UF Health Cancer Center. Daarnaast willen we Dr. Zachary Osking en Dr. Andrea Lin bedanken voor hun steun tijdens het publicatieproces.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 ml tubeFisher Scientific05-408-129Voor alle methoden
10 cm dishSarstedt AG & Co.83.3902Voor celcultuur van MCF-7 cellen
10 ul tipsFisher Scientific02-707-454Voor alle methoden
1000 ul tipsCorning4846Voor alle methoden
10X Glycine bufferVoor methode 3. Zie tabel 1 voor recept.
10X Running BufferVoor methoden 1 en 2. Zie tabel 1 voor recept.
10X TBSTVoor methoden 1 en 2. Zie tabel 1 voor recept.
12 well plateCorning3513Voor methode 2
15 cm dishSarstedt AG & Co.83.3903Voor methode 3
15 ml conical tubeSanta Cruz Biotechnologysc-200249Voor methoden 2 en 3
1X TBST met 5% melk en 0.02% Sodium AzideVoor methoden 1 en 2. Kan worden gebruikt om primaire antilichamen te verdunnen die meer dan één keer zullen worden gebruikt. Maakt kortetermijnopslag van primaire antilichaamverdunningen mogelijk. Niet gebruiken voor secundaire antilichaamdilutie. LET OP: Sodium Azide is giftig.
1X TBST met 5% melkVoor methoden 1 en 2. Gebruikt om PVDF-membraan te blokkeren en voor antilichaamverdunningen. Zie tabel 1 voor recept.
200 ul tipsCorning4844Voor alle methoden
2-mercaptoethanolSigma-AldrichM3148voor SDS-monsterbuffervoorbereiding
4-20% polyacrylamide gelThermo Fisher: InvitrogenXP04205BOXVoor methoden 1 en 2
5X Assay bufferVoor methode 1. Zie tabel 1 voor recept.
5X Passive lysis bufferVoor methode 2. Zie tabel 1 voor recept.
6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)Voor methoden 1 en 2. Zie tabel 1 voor recept.
A-485MedChemExpressHY-107455CBP/p300-remmer voor gebruik in methoden 2 en 3. Opgelost in DMSO.
Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antilichaamCell Signaling Technology4771Voor methode 1
Acetyl-CoASigma-AldrichA2056voor gebruik in methode 1
Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antilichaam (H3K27ac)Cell Signaling TechnologyCST 8173antilichamen voor H3K27ac voor immunoblots en ChIP
Acetyl-Histone H3 (Lys18) antilichaam (H3K18ac)Cell Signaling TechnologyCST 9675antilichamen voor H3K18ac voor immunoblots en ChIP
alpha tubulin antilichaamMillipore SigmaT5168Voor methode 2. Verdun 1:20.000
Anacardic acidCayman Chemical13144Voor methode 1
anti-muis IgG HRP-gekoppeld secundair antilichaamCell Signaling Technology7076Voor methoden 1 en 2. Verdun 1:10.000
anti-konijn IgG secundair antilichaamJackson ImmunoResearch711-035-152Voor methoden 1 en 2. Verdun 1:10.000 tot 1:20.000
AutoradiografiefilmMIDSCIBX810Voor methoden 1 en 2
Belly Dancer draaiend platformStovall Life Science Incorporatedniet beschikbaarVoor methoden 1 en 2
Bovine Calf Serum (BCS)HyCloneSH30072.03celcultuurmedium
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA2153voor buffervoorbereiding
BromofenolblauwSigma-AldrichB0126voor SDS-monsterbuffervoorbereiding
CDTASpectrum Chemical125572-95-4Voor buffervoorbereiding
celschraperMillipore SigmaCLS3010Voor methode 3
ChIP-dilutiebufferVoor methode 3. Zie tabel 1 voor recept.
ChIP Elutie BufferVoor methode 3. Zie tabel 1 voor recept.
Complete DMEM voor MCF-7 cellenVoor methoden 2 en 3. Zie tabel 1 voor recept.
Covaris 130 & microl microTUBECovaris520045Sonicatiebuis voor gebruik met Covaris S220 in methode 3
Covaris S220 Focused-ultrasonicatorCovarisS220DNA-sonicator voor gebruik in methode 3
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich41639voor medicijnverdunning en voertuigcontrolebehandeling
DL-Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich43815voor SDS-monsterbuffervoorbereiding
DMEMCorning10-013-CVcelcultuurmedium
EDTAFisher ScientificBP120-1voor buffervoorbereiding
Voorbeeld overdrachtstank en overdrachtsapparaatBio-rad1704070Voor methoden 1 en 2
EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation KitMillipore Sigma17-10086Voor methode 3
FK228 (Romidepsin)Cayman Chemical128517-07-7HDAC-remmer voor gebruik in methode 2
Formaldehyde-oplossingSigma-AldrichF8775voor celfixatie
glycerolFisher ScientificBP229-1Voor buffervoorbereiding
glycineSigma-AldrichG7126voor buffervoorbereiding
HEPESSigma-Aldrich54457voor buffervoorbereiding
Hoge zoutwasbufferVoor methode 3
IGEPAL (NP-40)Sigma-AldrichI3021voor buffer

Referenties

  1. Simon, R. P., Robaa, D., Alhalabi, Z., Sippl, W., Jung, M. KATching-Up on Small Molecule Modulators of Lysine Acetyltransferases. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (4), 1249-1270 (2016).
  2. Weinert, B. T., et al. Time-Resolved Analysis Reveals Rapid Dynamics and Broad Scope of the CBP/p300 Acetylome. Cell. 174 (1), 231-244 (2018).
  3. Dancy, B. M., Cole, P. A. Protein lysine acetylation by p300/CBP. Chemical Reviews. 115 (6), 2419-2452 (2015).
  4. Lasko, L. M., et al. Discovery of a selective catalytic p300/CBP inhibitor that targets lineage-specific tumours. Nature. 550 (7674), 128-132 (2017).
  5. Yang, H., et al. Small-molecule inhibitors of acetyltransferase p300 identified by high-throughput screening are potent anticancer agents. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (5), 610-620 (2013).
  6. Baell, J. B., et al. Inhibitors of histone acetyltransferases KAT6A/B induce senescence and arrest tumour growth. Nature. 560 (7717), 253-257 (2018).
  7. Coffey, K., et al. Characterisation of a Tip60 specific inhibitor, NU9056, in prostate cancer. Plos One. 7 (10), 45539(2012).
  8. Majaz, S., et al. Histone acetyl transferase GCN5 promotes human hepatocellular carcinoma progression by enhancing AIB1 expression. Cell & Bioscience. 6, 47(2016).
  9. Jin, L., et al. Therapeutic Targeting of the CBP/p300 Bromodomain Blocks the Growth of Castration-Resistant Prostate Cancer. Cancer Research. 77 (20), 5564-5575 (2017).
  10. Raisner, R., et al. Enhancer Activity Requires CBP/P300 Bromodomain-Dependent Histone H3K27 Acetylation. Cell Reports. 24 (7), 1722-1729 (2018).
  11. Jin, Q., et al. Distinct roles of GCN5/PCAF-mediated H3K9ac and CBP/p300-mediated H3K18/27ac in nuclear receptor transactivation. The EMBO Journal. 30 (2), 249-262 (2011).
  12. Pradeepa, M. M. Causal role of histone acetylations in enhancer function. Transcription. 8 (1), 40-47 (2017).
  13. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  14. Wang, Z., et al. Combinatorial patterns of histone acetylations and methylations in the human genome. Nature Genetics. 40 (7), 897-903 (2008).
  15. Ianculescu, I., Wu, D. Y., Siegmund, K. D., Stallcup, M. R. Selective roles for cAMP response element-binding protein binding protein and p300 protein as coregulators for androgen-regulated gene expression in advanced prostate cancer cells. The Journal of Biological Chemistry. 287 (6), 4000-4013 (2012).
  16. Zhong, J., et al. p300 acetyltransferase regulates androgen receptor degradation and PTEN-deficient prostate tumorigenesis. Cancer Research. 74 (6), 1870-1880 (2014).
  17. Fu, M., et al. p300 and p300/cAMP-response element-binding protein-associated factor acetylate the androgen receptor at sites governing hormone-dependent transactivation. The Journal of Biological Chemistry. 275 (27), 20853-20860 (2000).
  18. Emami, K. H., et al. A small molecule inhibitor of beta-catenin/CREB-binding protein transcription [corrected]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12682-12687 (2004).
  19. Stimson, L., et al. Isothiazolones as inhibitors of PCAF and p300 histone acetyltransferase activity. Molecular Cancer Therapeutics. 4 (10), 1521-1532 (2005).
  20. Modak, R., et al. Probing p300/CBP associated factor (PCAF)-dependent pathways with a small molecule inhibitor. ACS Chemical Biology. 8 (6), 1311-1323 (2013).
  21. Dahlin, J. L., et al. Assay interference and off-target liabilities of reported histone acetyltransferase inhibitors. Nature Communications. 8 (1), 1527(2017).
  22. Liao, D. Identification and characterization of small-molecule inhibitors of lysine acetyltransferases. Methods in Molecular Biology. 1238, 539-548 (2015).
  23. Gardberg, A. S., et al. Make the right measurement: Discovery of an allosteric inhibition site for p300-HAT. Structural dynamics. 6 (5), Melville, N.Y. 054702(2019).
  24. Ceccacci, E., Minucci, S. Inhibition of histone deacetylases in cancer therapy: lessons from leukaemia. British Journal of Cancer. 114 (6), 605-611 (2016).
  25. Tashiro, E., Tsuchiya, A., Imoto, M. Functions of cyclin D1 as an oncogene and regulation of cyclin D1 expression. Cancer Science. 98 (5), 629-635 (2007).
  26. Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Molecular Biotechnology. 45 (1), 87-100 (2010).
  27. JoVE. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. JoVE. , Cambridge, MA. (2020).
  28. Gooderham, K. Transfer techniques in protein blotting. Methods in Molecular Biology. 1, 165-178 (1984).
  29. Westermeier, R. Electrophoresis in practice: A guide to methods and applications of DNA and protein separations. , Wiley. (2004).
  30. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  31. Kurien, B. T., Scofield, R. H. Nonelectrophoretic bidirectional transfer of a single SDS-PAGE gel with multiple antigens to obtain 12 immunoblots. Methods in Molecular Biology. 536, 55-65 (2009).
  32. Kyhse-Andersen, J. Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from polyacrylamide to nitrocellulose. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 10 (3-4), 203-209 (1984).
  33. Tovey, E. R., Baldo, B. A. Comparison of semi-dry and conventional tank-buffer electrotransfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose membranes. Electrophoresis. 8 (9), 384-387 (1987).
  34. Greenfield, E. A. Protein Quantitation. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
  35. Barrow, J. J., Masannat, J., Bungert, J. Neutralizing the function of a β-globin-associated cis-regulatory DNA element using an artificial zinc finger DNA-binding domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), 17948-17953 (2012).
  36. Leach, K. M., et al. Characterization of the human beta-globin downstream promoter region. Nucleic Acids Research. 31 (4), 1292-1301 (2003).
  37. ChIP-qPCR and Data Analysis. Sigma-Aldrich. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/chip-qpcr-data-analysis.html (2020).
  38. Balasubramanyam, K., Swaminathan, V., Ranganathan, A., Kundu, T. K. Small molecule modulators of histone acetyltransferase p300. The Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19134-19140 (2003).
  39. Using ImageJ to quantify blots. Diamantina Institute - University of Queensland. , Available from: https://di.uq.edu.au/community-and-alumni/sparq-ed-services/using-imagej-quantify-blots (2020).
  40. Kalkhoven, E., et al. Loss of CBP acetyltransferase activity by PHD finger mutations in Rubinstein-Taybi syndrome. Human Molecular Genetics. 12 (4), 441-450 (2003).
  41. Ortega, E., et al. Transcription factor dimerization activates the p300 acetyltransferase. Nature. 562 (7728), 538-544 (2018).
  42. Koutelou, E., Hirsch, C. L., Dent, S. Y. R. Multiple faces of the SAGA complex. Current Opinion in Cell Biology. 22 (3), 374-382 (2010).
  43. Wang, Y., et al. Identification of histone deacetylase inhibitors with benzoylhydrazide scaffold that selectively inhibit class I histone deacetylases. Chemistry & Biology. 22 (2), 273-284 (2015).
  44. Hu, E., et al. Identification of novel isoform-selective inhibitors within class I histone deacetylases. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 307 (2), 720-728 (2003).
  45. Lee, B. I., et al. MS-275, a histone deacetylase inhibitor, selectively induces transforming growth factor beta type II receptor expression in human breast cancer cells. Cancer Research. 61 (3), 931-934 (2001).
  46. Leus, N. G. J., et al. HDAC1-3 inhibitor MS-275 enhances IL10 expression in RAW264.7 macrophages and reduces cigarette smoke-induced airway inflammation in mice. Scientific Reports. 7, 45047(2017).
  47. Rossi, L., et al. HDAC1 inhibition by MS-275 in mesothelial cells limits cellular invasion and promotes MMT reversal. Scientific Reports. 8 (1), 8492(2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

HAT-assayChHAI-assayChIP-qPCRhistonacetyleringimmunoblottingProteïnase Kmagnetische beadsqPCR-analyseepigenetische regulatie
Assays voor het valideren van Histon Acetyltransferase Inhibitors
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.