Methodenartikel

Op papier gebaseerde preconcentratie en isolatie van microvesicles en exosomen

DOI:

10.3791/61292

⸱

29 april 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Electrical Engineering, Kwangwoon University, 2Korea Institute of Science and Technology (KIST), 3School of Biomedical Engineering, Korea University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gepresenteerd is een protocol om een op papier gebaseerd apparaat te fabriceren voor de effectieve verrijking en isolatie van microvesicles en exosomen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microvesicles en exosomen zijn kleine membranous vesicles vrijgegeven aan de extracellulaire omgeving en verspreid door het hele lichaam. Omdat ze verschillende door ouderlijke cellen afgeleide biomoleculen bevatten, zoals DNA, mRNA, miRNA, eiwitten en lipiden, zijn hun verrijking en isolatie cruciale stappen voor hun exploitatie als potentiële biomarkers voor klinische toepassingen. Conventionele isolatiemethoden (bijvoorbeeld ultracentrifugatie) veroorzaken echter aanzienlijk verlies en schade aan microvesicles en exosomen. Deze methoden vereisen ook meerdere repetitieve stappen van ultracentrifugatie, laden en verspillen van reagentia. Dit artikel beschrijft een gedetailleerde methode om een op origamipapier gebaseerd apparaat (Exo-PAD) te fabriceren dat is ontworpen voor de effectieve verrijking en isolatie van microvesicles en exosomen op een eenvoudige manier. Het unieke ontwerp van de Exo-PAD, bestaande uit accordeonachtige multifolded lagen met convergente monstergebieden, is geïntegreerd met de ionconcentratiepolarisatietechniek, waardoor de microvesicles en exosomen op specifieke lagen vervijfvoudigd kunnen worden. Bovendien worden de verrijkte microvesicles en exosomen geïsoleerd door simpelweg de Exo-PAD uit te vouwen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microvesicles en exosomen zijn kleine membraanvezelpen van respectievelijk 0,2−1 μm en 30−200 nm. Ze worden afgescheiden in de extracellulaire omgeving door verschillende celtypen1,2,3,4,5. Ze bevatten ouderlijke cel informatie in de vorm van subsets van DNA, mRNA, miRNA, eiwitten, en lipiden, en circuleren door het hele lichaam via verschillende lichaamsvloeistoffen zoals serum, plasma, urine, hersenvocht, vruchtwater, en speeksel6,7,8,9. Zo kunnen technieken voor een efficiënte isolatie van microvesicles en exosomen van biologische vloeistoffen uitgebreide mogelijkheden bieden op het gebied van de diagnose, prognose en real-time monitoring van de ziekte, evenals in de ontwikkeling van nieuwe therapieën.

De conventionele isolatiemethode voor microvesicles en exosomen op basis van ultracentrifugatie is echter uiterst tijdrovend en veroorzaakt aanzienlijk verlies en verontreiniging van het monster. Dit komt omdat het gaat om verschillende omslachtige pipetting en laadstappen en het weggooien van verschillende reagentia met herhaalde ultracentrifugatie5,6,10,11,12. Bovendien kan de hoge afschuifspanning veroorzaakt door ultracentrifugatie (~100.000 x g) de fysieke lyse van microvesicles en exosomen veroorzaken , wat een slechte herstelsnelheid oplevert (5−23%)6,13,14. Daarom moet een zeer efficiënte, onopvallende isolatietechniek voor microvesicles en exosomen worden ontwikkeld om schade en verlies te verminderen, waardoor hogere herstelsnelheden worden bereikt.

Een op origami-papier gebaseerd apparaat (Exo-PAD) is ontwikkeld voor een eenvoudigere, zachtere en zeer efficiënte isolatie van microvesicles en exosomen6. Het ontwerp van de Exo-PAD is een meervoudig papier met serieel verbonden monstergebieden die geleidelijk in diameter afnemen. De ionconcentratiepolarisatie (ICP) techniek, een nano-elektro-elektro-elektrokinetisch fenomeen dat geladen biomoleculen preconcentraeert, werd geïntegreerd met dit unieke ontwerp. Het gebruik van de Exo-PAD resulteerde in een vijfvoudige verrijking van de microvesicles en exosomen in specifieke lagen en hun isolatie door simpelweg het apparaat te ontvouwen. Dit artikel beschrijft de Exo-PAD in detail, van de algehele fabricage en werking van het apparaat tot de analyse van het gebruik ervan, om de methode te illustreren en representatieve resultaten weer te geven6.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Fabricage van het apparaat

  1. Definieer de regio die op papier moet worden afgedrukt met behulp van printersoftware(Tabel met materialen).
    OPMERKING: Het ontwerp heeft 12 lagen met waspatroon waarin de diameters van de ronde monstergebieden geleidelijk worden verkleind van 5 mm tot 2 mm (figuur 1A).
  2. Druk hydrofobe was op de aangewezen gebieden aan beide zijden van het cellulosepapier(Tabel van materialen) af met behulp van een commerciële wasprinter (Tabel van materialen) ( figuur1B).
  3. Plaats het met was bedrukte papier in een laboratoriumoven voor 80 s bij 120 °C.
    LET OP: Met deze stap kan de was de binnenkant van het papier bereiken door een thermische reflow van de bedrukte was te bereiken. Met dit incubatieprotocol is de resolutie van het patroon ~2 mm. Dus, wees voorzichtig niet om patronen van minder dan 2 mm af te drukken. Anders worden de patronen geblokkeerd door de was.
  4. Snijd het met was bedrukte papier met een frees om afzonderlijke apparaten te maken (figuur 1C).
  5. Drop 5 μL en 2 μL permselective membraan (bijvoorbeeld Nafion; Materiaaltafel) op de monstergebieden in respectievelijk de meest linkse en meest rechtse lagen(figuur 1D).
  6. Plaats de lagen bedekt met het permselectieve membraan op een hete plaat op 70 °C gedurende 30 minuten om het permselectieve membraan oplosmiddel te verdampen.
  7. Verzegel het buitenste oppervlak van de gecoate laag naar de bufferoplossing met drukgevoelige tape, waardoor een klein gaatje overblijft.
  8. Vouw het geprinte individuele apparaat (d.w.z. Exo-PAD) heen en weer langs de witte lijnen.
    OPMERKING: Door het apparaat op te vouwen, worden alle monstergebieden convergent verbonden(figuur 1E). Dit convergente ontwerp richt zich op de elektrische veldlijnen wanneer de spanning wordt toegepast voor ICP, het bereiken van een intensievere preconcentratie van de microvesicles en exosomen.

2. Verrijking en ruimtelijke scherpstelling van microvesicles en exosomen door polarisatie van de ionenconcentratie

  1. Laad 15 μL van de microvesicle en exosoommonster (~3 x 1011 deeltjes/mL in 0,1x fosfaatgebufferde zoutoplossing [PBS] met 0,05% Tween 20) in de convergente monstergebieden door leiding te geven en wacht een paar seconden om volledige bevochtiging van alle monstergebieden te garanderen (figuur 1F).
  2. Plaats twee acrylkamers aan beide uiteinden van de Exo-PAD en klem de Exo-PAD stevig met kleine bindmiddelclips om ontvouwen te voorkomen(figuur 1G).
  3. Vul de kamers met 110 μL van 0,1x PBS en steek twee Ag/AgCl-elektroden in (figuur 1H).
  4. Breng 30 V gedurende 20 minuten aan op de elektroden met behulp van een stroom-voltagebronmeetsysteem(Tabel van materialen).
    OPMERKING: De toegepaste spanning genereert het ICP-fenomeen en concentreert daarom de microvesicles en exosomen op de lagen 8 en 9 van de Exo-PAD.

3. Isolatie van de verrijkte microvesicles en exosomen

  1. Scheid de gevouwen Exo-PAD van de acrylkamers en vouw het apparaat open om de verrijkte microvesicles en exosomen van de andere lagen te isoleren (figuur 1I).
  2. Punch uit de steekproef gebieden in de lagen 8 en 9, waar de microvesicles en exosomen zijn verrijkt, voor downstream-analyse (Figuur 1J).

4. Scanning elektronenmicroscopie analyse

  1. Bevestig de verrijkte microvesicles en exosomen door de geponste gebieden in 2,5% glutaraldehyde onder te dompelen in 0,1 M natriumcaanoodylaatbuffer voor 1 h en in 1% osmiumteroxide in 0,1 M natriumcaanolaat gedurende 1 uur.
    LET OP: Osmium tetroxide is zeer giftig en gevaarlijk chemisch. Omdat osmiumteroxide kunststoffen kan binnendringen, moet het in glas worden opgeslagen. Elke behandeling van osmium tetroxide moet worden uitgevoerd in een chemische rookkap met dubbele nitrilhandschoenen.
  2. Dehydrateren van de vaste microvesicles en exosomen met oplopende kwaliteiten van 200 bewijs ethanol (d.w.z. 50%, 70%, 90% en 100%) voor 30 min per stuk.
  3. Droog het monster chemisch door het 30 minuten in hexamethyldisilazane in een desiccator onder te dompelen.
    LET OP: Hexamethyldisilazane is een brandbare en vochtgevoelige chemische stof. Het moet worden opgeslagen in een droge en goed geventileerde ruimte uit de buurt van ontstekingsbronnen.
  4. Coat de volledig gedroogde microvesicles en exosomen met goud / palladium (~ 20 nm) via sputteren en vangen scanning elektronenmicroscopie (SEM) beelden.

5. Nanodeelvolganalyse

  1. Punch uit de steekproef gebieden in de lagen 6, 8 en 10 met behulp van een biopsie punch na 20 min van het apparaat operatie.
  2. Dompel elk uitgestakt gebied onder in bufferoplossing (0,1x PBS met 0,01% Tween 20).
  3. Vortex voor 10 min en centrifuge voor 30 s bij 6.000 rpm om de verrijkte microvesicles en exosomen opnieuw op te lichten.
  4. Verwijder de uitgeponst-out gebieden uit de oplossing en meet de concentratie van microvesicles en exosomen door middel van een nanoparticle tracking analysis (NTA) instrument(Table of Materials).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De bedrijfstijd moet worden geoptimaliseerd om de maximale herstelopbrengst van de verrijkte microvesicles en exosomen te bereiken. Onvoldoende tijd maakt onvoldoende migratie van de microvesicles en exosomen mogelijk, waardoor de verrijking afneemt, terwijl overmatige tijd de ruimtelijke scherpstelling verslechtert en dus de microvesicles en exosomen verspreidt. Zo kan door de tijdoptimalisatiestap de maximale preconcentratiefactor van microvesicles en exosomen en de uiteindelijke locatie waar microvesicles en exosomen ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hoewel de Exo-PAD met succes werd gebruikt voor de verrijking en isolatie van microvesicles en exosomen, moeten verschillende kritieke punten zorgvuldig worden overwogen: 1) de incubatietijd en temperatuur van de oven tijdens de bereiding van het apparaat, 2) verwerkingstijd, 3) toepassing van spanning met verschillende laagnummers en diameters van het monstergebied, en 4) toepasselijkheid op klinische monsters.

De incubatietijd en temperatuur in het protocol zijn geoptimaliseerde omstandighed...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door de National Research Foundation of Korea, Grant NRF-2018R1D1A1A090840444. J. H. Lee werd in 2019 ondersteund door een onderzoeksbeurs van de Universiteit van Kwangwoon. Hyerin Kim werd ondersteund door het "Competency Development Program for Industry Specialists" van het Koreaanse ministerie van Handel, Industrie en Energie (MOTIE), beheerd door het Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT) (nr. P0002397, HRD programma voor industriële convergentie van draagbare slimme apparaten).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Ag/AgCl-elektrodenA-M Systems, Inc.5315000,15" diameter
Albumine uit runderserum (BSA), Alexa Fluor 594-conjugaatThermo Fisher ScientificA13101BSA geconjugeerd met Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm)
Carbonaat-bicarbonaatbufferSigma-AldrichC3041-50CAPCarbonaatbuffer
CorelDraw-software (Coral Co., Canada)Corel CorporationPrintersoftware om het wasafdrukgebied te definiëren
ColorQube 8870Xerox CorporationWasprinter
Chromatografiepapier graad 1Whatman3001-861Cellulosepapier, afmeting: 20 * 20 cm
Fluorescent gelabelde exosome-standaardenHansaBioMed Life Sciences, Ltd.HBM-F-PEP-100Exosoom gelabeld met FITC (Ex/Em: 490/520 nm)
Keithley 2410 stroom-/spanningsbron-meterKeithley Instruments, Inc.Stroom-spanningsbron meetsysteem
Nafion perfluorineerde harsoplossingSigma-Aldrich31175-20-9Permselectieve membraan, 20 wt.% in het mengsel van lagere alifatische alcoholen en water; bevat 34% water
NanoSight LM10NanoSight TechnologyNanodeeltjetrackinganalyse (NTA) machine
Fosfaatgebufferd serum (PBS, pH7,4)Thermo Fisher Scientific10010001

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Edgar, J. R. Q & A: What are exosomes, exactly. BMC Biology. 14 (1), 1-7 (2016).
  2. Contreras-Naranjo, J. C., Wu, H. J., Ugaz, V. M. Microfluidics for exosome isolation and analysis: Enabling liquid biopsy for personalized medicine. Lab on a Chip. 17 (21), 3558-3577 (2017).
  3. Simons, M., Raposo, G. Exosomes - vesicular carriers for intercellular communication. Current Opinion in Cell Biology. 21 (4), 575-581 (2009).
  4. Ståhl, A. L., Johansson, K., Mossberg, M., Kahn, R., Karpman, D. Exosomes and microvesicles in normal physiology, pathophysiology, and renal diseases. Pediatric Nephrology. 34 (1), 11-30 (2019).
  5. Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. Paper-based devices for isolation and characterization of extracellular vesicles. Journal of Visualized Experiments. (98), e52722(2015).
  6. Kim, H., et al. Origami-paper-based device for microvesicle/exosome preconcentration and isolation. Lab on a Chip. 19 (23), 3917-3921 (2019).
  7. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  8. Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. A. Exosomes and microvesicles: Extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy. Human Molecular Genetics. 21, 125-134 (2012).
  9. Liu, C., et al. Field-Free Isolation of Exosomes from Extracellular Vesicles by Microfluidic Viscoelastic Flows. ACS Nano. 11 (7), 6968-6976 (2017).
  10. Marczak, S., et al. Simultaneous isolation and preconcentration of exosomes by ion concentration polarization. Electrophoresis. 39 (15), 2029-2038 (2018).
  11. Livshts, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).
  12. Chiriacò, M. S., et al. Lab-on-chip for exosomes and microvesicles detection and characterization. Sensors. 18 (10), 3175(2018).
  13. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 1-11 (2015).
  14. Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
  15. Han, S., et al. Electrokinetic size-based spatial separation of micro/nanospheres using paper-based 3d origami preconcentrator. Analytical Chemistry. 91 (16), 10744-10749 (2019).
  16. Yeh, S. H., Chou, K. H., Yang, R. J. Sample pre-concentration with high enrichment factors at a fixed location in paper-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 16 (5), 925-931 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Paper Based DeviceMicrovesicle IsolationExosome EnrichmentIon Concentration PolarizationWax Patterned LayersPerm Selective MembraneElectrokinetic PreconcentrationFluorescence QuantificationSEM AnalysisProtein Rich Samples

Gerelateerde artikelen