Method Article

Op papier gebaseerde preconcentratie en isolatie van microvesicles en exosomen

DOI:

10.3791/61292

⸱

April 29th, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Electrical Engineering, Kwangwoon University, 2Korea Institute of Science and Technology (KIST), 3School of Biomedical Engineering, Korea University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gepresenteerd is een protocol om een op papier gebaseerd apparaat te fabriceren voor de effectieve verrijking en isolatie van microvesicles en exosomen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microvesicles en exosomen zijn kleine membranous vesicles vrijgegeven aan de extracellulaire omgeving en verspreid door het hele lichaam. Omdat ze verschillende door ouderlijke cellen afgeleide biomoleculen bevatten, zoals DNA, mRNA, miRNA, eiwitten en lipiden, zijn hun verrijking en isolatie cruciale stappen voor hun exploitatie als potentiële biomarkers voor klinische toepassingen. Conventionele isolatiemethoden (bijvoorbeeld ultracentrifugatie) veroorzaken echter aanzienlijk verlies en schade aan microvesicles en exosomen. Deze methoden vereisen ook meerdere repetitieve stappen van ultracentrifugatie, laden en verspillen van reagentia. Dit artikel beschrijft een gedetailleerde methode om een op origamipapier gebaseerd apparaat (Exo-PAD) te fabriceren dat is ontworpen voor de effectieve verrijking en isolatie van microvesicles en exosomen op een eenvoudige manier. Het unieke ontwerp van de Exo-PAD, bestaande uit accordeonachtige multifolded lagen met convergente monstergebieden, is geïntegreerd met de ionconcentratiepolarisatietechniek, waardoor de microvesicles en exosomen op specifieke lagen vervijfvoudigd kunnen worden. Bovendien worden de verrijkte microvesicles en exosomen geïsoleerd door simpelweg de Exo-PAD uit te vouwen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microvesicles en exosomen zijn kleine membraanvezelpen van respectievelijk 0,2−1 μm en 30−200 nm. Ze worden afgescheiden in de extracellulaire omgeving door verschillende celtypen1,2,3,4,5. Ze bevatten ouderlijke cel informatie in de vorm van subsets van DNA, mRNA, miRNA, eiwitten, en lipiden, en circuleren door het hele lichaam via verschillende lichaamsvloeistoffen zoals serum, plasma, urine, hersenvocht, vruchtwater, en speeksel6,7,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Fabricage van het apparaat

  1. Definieer de regio die op papier moet worden afgedrukt met behulp van printersoftware(Tabel met materialen).
    OPMERKING: Het ontwerp heeft 12 lagen met waspatroon waarin de diameters van de ronde monstergebieden geleidelijk worden verkleind van 5 mm tot 2 mm (figuur 1A).
  2. Druk hydrofobe was op de aangewezen gebieden aan beide zijden van het cellulosepapier(Tabel van materialen) af met behulp van een commerciële wasprinter (Tabel van materialen) ( figuur1B).
  3. Plaats het met was bedrukte papier in een ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De bedrijfstijd moet worden geoptimaliseerd om de maximale herstelopbrengst van de verrijkte microvesicles en exosomen te bereiken. Onvoldoende tijd maakt onvoldoende migratie van de microvesicles en exosomen mogelijk, waardoor de verrijking afneemt, terwijl overmatige tijd de ruimtelijke scherpstelling verslechtert en dus de microvesicles en exosomen verspreidt. Zo kan door de tijdoptimalisatiestap de maximale preconcentratiefactor van microvesicles en exosomen en de uiteindelijke locatie waar microvesicles en exosomen .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hoewel de Exo-PAD met succes werd gebruikt voor de verrijking en isolatie van microvesicles en exosomen, moeten verschillende kritieke punten zorgvuldig worden overwogen: 1) de incubatietijd en temperatuur van de oven tijdens de bereiding van het apparaat, 2) verwerkingstijd, 3) toepassing van spanning met verschillende laagnummers en diameters van het monstergebied, en 4) toepasselijkheid op klinische monsters.

De incubatietijd en temperatuur in het protocol zijn geoptimaliseerde omstandighed.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door de National Research Foundation of Korea, Grant NRF-2018R1D1A1A090840444. J. H. Lee werd in 2019 ondersteund door een onderzoeksbeurs van de Universiteit van Kwangwoon. Hyerin Kim werd ondersteund door het "Competency Development Program for Industry Specialists" van het Koreaanse ministerie van Handel, Industrie en Energie (MOTIE), beheerd door het Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT) (nr. P0002397, HRD programma voor industriële convergentie van draagbare slimme apparaten).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ag/AgCl electrodesA-M Systems, Inc.5315000.15" diameter
Albumin from Bovine Serum (BSA), Alexa Fluor 594 conjugateThermo Fisher ScientificA13101BSA conjugated with Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm)
Carbonate-Bicarbonate BufferSigma-AldrichC3041-50CAPCarbonate buffer
CorelDraw software (Coral Co., Canada)Corel CorporationPrinter software to define wax printing region
ColorQube 8870Xerox CorporationWax printer
Chromatography paper grade 1Whatman3001-861Cellulose paper, dimension: 20 * 20 cm
Fluorescent-labeled exosome standardsHansaBioMed Life Sciences, Ltd.HBM-F-PEP-100Exosome labeled with FITC (Ex/Em: 490/520 nm)
Keithley 2410 current/voltage source-meterKeithley Instruments, Inc.Current–voltage source measurement system
Nafion perfluorinated resin solutionSigma-Aldrich31175-20-9Permselective membrane, 20 wt.% in the mixture of lower aliphatic alcohols and water; contains 34% water
NanoSight LM10NanoSight TechnologyNanoparticle tracking analysis (NTA) machine
Phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4)Thermo Fisher Scientific10010001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Edgar, J. R. Q & A: What are exosomes, exactly. BMC Biology. 14 (1), 1-7 (2016).
  2. Contreras-Naranjo, J. C., Wu, H. J., Ugaz, V. M. Microfluidics for exosome isolation and analysis: Enabling liquid biopsy for personalized medicine. Lab on a Chip. 17 ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Paper Based DeviceMicrovesicle IsolationExosome EnrichmentIon Concentration PolarizationWax Patterned LayersPerm Selective MembraneElectrokinetic PreconcentrationFluorescence QuantificationSEM AnalysisProtein Rich Samples

Related Articles