Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Beeldvorming Intranucleaire Actin Staven in Live Heat Stressed Drosophila Embryo's

3.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61297

⸱

15 mei 2020

 ,  , 
1Integrative Molecular and Biomedical Sciences, Baylor College of Medicine, 2Department of Cell and Molecular Biology, School of Molecular and Cellular Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Verna and Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Biology, Baylor College of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Het doel van dit protocol is om Rhodamine-geconjugeerde bolvormige actine te injecteren in Drosophila embryo's en beeld intranucleaire actine staaf assemblage na hitte stress.

Samenvatting

Het doel van dit protocol is om intranucleaire actinestaven te visualiseren die zich verzamelen in levende Drosophila melanogaster embryo's na hittestress. Actin staven zijn een kenmerk van een geconserveerde, induceerbare Actin Stress Response (ASR) die gepaard gaat met menselijke pathologieën, waaronder neurodegeneratieve ziekte. Eerder toonden we aan dat de ASR bijdraagt aan morfogenesefalen en verminderde levensvatbaarheid van het ontwikkelen van embryo's. Dit protocol maakt de voortdurende studie mogelijk van mechanismen die ten grondslag liggen aan actine staafassemblage en de ASR in een modelsysteem dat zeer vatbaar is voor beeldvorming, genetica en biochemie. Embryo's worden verzameld en op een afdeklip gemonteerd om ze voor te bereiden op injectie. Rhodamine-geconjugeerde bolvormige actine (G-actineRed) wordt verdund en in een microneedle geladen. Een enkele injectie wordt gemaakt in het midden van elk embryo. Na injectie worden embryo's geïncubeerd bij verhoogde temperatuur en intranucleaire actinestaven worden vervolgens gevisualiseerd door confocale microscopie. Fluorescentieherstel na fotobleaching (FRAP) experimenten kunnen worden uitgevoerd op de actinestaven; en andere actinerijke structuren in het cytoplasma kunnen ook in beeld worden We vinden dat G-actineRed polymeriseert als endogene G-actine en op zichzelf de normale embryoontwikkeling niet verstoort. Een beperking van dit protocol is dat er tijdens de injectie op moet worden gelet om ernstig letsel aan het embryo te voorkomen. Echter, met de praktijk, het injecteren van G-actineRood in Drosophila embryo's is een snelle en betrouwbare manier om actine staven te visualiseren en kan gemakkelijk worden gebruikt met vliegen van elk genotype of met de introductie van andere cellulaire spanningen, waaronder hypoxie en oxidatieve stress.

Inleiding

Dit protocol beschrijft hoe G-actineRood te injecteren om de assemblage van intranucleaire actine staven in hitte-gestresste embryo's die een induceerbare Actin Stress Response (ASR)ondergaan visualiseren 1. We ontwikkelden dit protocol ter ondersteuning van studies van de ASR, die in embryo's leidt tot verstoorde morfogenese en verminderde levensvatbaarheid, en bij volwassen menselijke celtypen wordt geassocieerd met pathologieën zoals nierfalen2, spier myopathieën3, en Alzheimer en De Ziekte van Huntington4,5,6,7,8. Deze ASR wordt veroorzaakt door talrijke cellulaire spanningen, waaronder hitteschok9,10,11,oxidatieve stress4,6, verminderde ATP-synthese12, en abnormale Huntingtine of β-amyloïde oligomerisatie4,5,6,7,9,13,14,15,16. Een kenmerk van de ASR is de assemblage van afwijkende actinestaven in het cytoplasma of de kern van aangetaste cellen, die wordt aangedreven door stress-geïnduceerde hyperactivatie van een actine interacterend eiwit, Cofilin1,5,6,10. Helaas blijven er belangrijke kennislacunes bestaan met betrekking tot de ASR. De functie van de actinestaven is bijvoorbeeld niet bekend. We begrijpen niet waarom staven zich vormen in het cytoplasma van sommige celtypen, maar de kern van anderen. Het is ook niet duidelijk of de ASR beschermend of onaantastelijk is voor cellen of embryo's die stress ervaren. Tot slot kennen we nog steeds niet de gedetailleerde mechanismen die ten grondslag liggen aan Cofilin hyperactivatie of actine staafassemblage. Dit protocol biedt dus een snelle en veelzijdige test om de ASR te onderzoeken door actine staafvorming en dynamiek in het zeer tracteerbare experimentele systeem van het levende fruitvliegembryo te visualiseren.

Het protocol om G-actineRed te micro-injecteren in levende Drosophila-embryo's werd aanvankelijk ontwikkeld om de dynamiek van normale cytoplasmatische actinestructuren17 te bestuderen tijdens weefselopbouwgebeurtenissen. In die studies ontdekten we dat G-actineRode injectie geen negatieve invloed had op vroege ontwikkelingsprocessen in het embryo, waaronder cytokinese of gastrulatie17,18. Vervolgens hebben we het protocol gewijzigd, waarbij we de embryobehandeling en G-actineRed-injectie hebben aangepast om beeldvorming van actinestaven in hittebelaste embryo's die de ASR1ondergaan mogelijk te maken. Andere methoden naast G-actineRode injectie kunnen worden gebruikt om actine in embryo's te visualiseren. Deze methoden zijn gebaseerd op het uitdrukken van fluorescerende eiwitten (FPs) die zijn getagd op actine of op domeinen van actinebindende eiwitten, zoals Utrophin-mCherry, Lifeact, F-tractin-GFP en Moesin-GFP (herzien in19). Het gebruik van deze FP-sondes vereist echter voorzichtigheid, omdat ze sommige actinestructuren kunnen stabiliseren of verstoren, niet alle actinestructuren gelijk labelen20, en in het geval van actin-GFP, zeer overexpressie hebben – problematisch voor de analyse van staafassemblage die niet alleen stressafhankelijk is, maar ook actineconcentratieafhankelijk1. Zo is G-actinRed de voorkeursonde voor staafstudies in vliegenembryo's, en de grote omvang van het embryo maakt de eenvoudige injectie mogelijk.

De workflow van dit protocol is vergelijkbaar met andere gevestigde micro-injectietechnieken die zijn gebruikt voor het injecteren van eiwitten, nucleïnezuren, geneesmiddelen en fluorescerende indicatoren in Drosophila-embryo 's21,22,23,24,25,26,27. Echter, na de micro-injectie van G-actineRood hier, embryo's worden blootgesteld aan milde hitte stress om de ASR en intranucleaire actine staaf assemblage te induceren. Voor laboratoria met toegang tot vliegen en een injectieplatform moet deze methode gemakkelijk uitvoerbaar en aanpasbaar zijn voor specifieke studielijnen met betrekking tot de ASR, met inbegrip van de inductie ervan door verschillende spanningen of modulatie in verschillende genetische achtergronden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Bereid embryoverzamelingsbekers en appelsap-agarplaten voor

  1. Bouw vijf dagen voor het injectie-experiment28 of koop ten minste twee kleine embryoverzamelingsbekers. Maak verse 60 mm appelsap agar borden te gebruiken met kleine collectie kopjes28. Bewaar platen in plastic dozen bedekt met vochtige papieren handdoeken op 4 °C.
    OPMERKING: Kleine embryoverzamelingsbekers, gevuld met vliegnummers zoals beschreven in stap 1.3, zullen per experiment voldoende embryonummers opleveren, terwijl ze er ook voor zorgen dat embryobehandeling en -injectie in korte tijd kunnen worden gedaan om beeldvorming van vroege ontwikkelingsstadia mogelijk te maken.
  2. Verwarm appelsapplaten tot 18 °C en voeg een schar gistpasta toe aan het midden van de plaat. Gistpasta is een eenvoudige pasta van actieve gist en gedestilleerd water.
  3. Om het meest royale leggen van eieren te bevorderen, zet je 2 dagen voorafgaand aan het experiment verzamelbekers met vliegen op. Voeg ten minste 100 vrouwtjes en 50 mannelijke vliegen toe aan de verzamelbekers en bedek met een voorbereide appelsapplaat(figuur 1,stap 1). Vervang op de dagen voorafgaand aan het injectie-experiment de appelsapplaten minstens twee keer per dag, eenmaal 's ochtends en eenmaal 's avonds.
    OPMERKING: De beste injectie- en beeldvormingsresultaten worden verkregen wanneer embryoverzamelingsbekers op 18 °C worden bewaard met een aan/licht uit-cyclus van 12 uur.

2. Bereid een werkvoorraadoplossing van G-actinRed voor micro-injectie

OPMERKING: Dit preparaat maakt slechts 2 μL van een 5 mg/ml werkvoorraad G-actineRood, dus als gebruikers niet gewend zijn aan de micro-injectietechniek, is het voordelig om naar stap 3 te gaan en de micro-injections te oefenen met een neutrale pH-buffer om kostbare werkvoorraad te behouden. De 10 μg voorraad G-actinRed van de leverancier kan worden bewaard in de originele verpakking in een 16 oz schroef top pot met ~ 500 g droogmiddel bij 4 °C gedurende maximaal 6 maanden.

  1. Bereid van tevoren een G-buffer voorraadoplossing voor: 5 mM Tris-HCl, 0,2 mM CaCl2, pH 8,0. Filteren en bewaren bij kamertemperatuur.
  2. Bereid op de dag van injecties 1 ml van een G-bufferwerkoplossing in een verse snap cap microcentrifugebuis op ijs met behulp van de G-buffervoorraad uit stap 2.1, aangevuld met het volgende bij de aangegeven eindconcentraties: 1 mM dithiothreitol (DTT) en 0,2 mM ATP, pH 8,0.
    OPMERKING: Het 1 ml volume G-buffer werkoplossing is meer dan wat nodig is voor een experiment, maar vereenvoudigt de voorbereiding. Overtollige kan worden weggegooid na het experiment of gebruikers kunnen afschalen op basis van hun voorkeur.
    1. Houd de 10 μg G-actineRode bouillon op ijs en voeg eerst 1 μL gefilterd, gedestilleerd water toe aan de bovenkant van de roze druppel G-actineRood in de buis.
    2. Voeg vervolgens 1 μL van de koude, vers bereide G-buffer werkoplossing uit stap 2.2 toe. Pipet op en neer ~ 20 keer om goed te mengen met het pipetvolume ingesteld op 1 μL. De G-actinRed voorraad zal nu bij de definitieve verdunning van 5 mg/ml zijn.
  3. Incubeer de voorbereide G-actinRed gedurende 30 minuten ongestoord op ijs.
  4. Centrifugeer de geprepareerde G-actineRood bij 16.000 x g gedurende 20 min bij 4 °C in een microcentrifuge om neerslag te verwijderen.
  5. Pipet voorzichtig 1,5 μL van het supernatant in een verse snap cap microcentrifuge tube op ijs, waarbij de donkerroze pellet wordt vermeden.
  6. Bewaar de voorbereide G-actineRode supernatant tot 6 uur op het ijs tot het klaar is om in een microneedle te worden geladen.
    OPMERKING: Microneedles kunnen van tevoren uit capillaire buizen worden getrokken op een micropipettetrekker en vervolgens bij kamertemperatuur worden bewaard op een strook modelleerklei in een Petrischaal van 100 x 20 mm. Voorgestelde parameters voor microneedle pulling zijn te vinden in het Pipette Cookbook29.

3. Verzamel embryo's en mount voor injectie

  1. Laat vliegen 30 minuten embryo's leggen op appelsapplaten met gistpasta bij 18 °C.
  2. Terwijl vliegen leggen, verwarm je een appelsap agar plaat zonder gistpasta voor op kamertemperatuur, knip je een rechthoekige wig van 4 cm x 1 cm appelsap agar uit met een scheermesje en plaats je op een glazen glijbaan van 25 mm x 75 mm.
    1. Oogstplaat uit de 30 minuten durende verzameling en dechorioneer embryo's door vers bleekmiddel, verdund 1:1 met gedestilleerd water, op de plaat te gieten en de plaat gedurende 1 minuut te wervelen, zoals beschreven in28 (figuur 1,stap 2).
      OPMERKING: Verschillende merken bleekmiddel worden in verschillende concentraties verkocht. Het hier gebruikte bleekmiddel is 6% natriumhypochloriet uit de fles en wordt verdund tot een uiteindelijke concentratie van 3% natriumhypochloriet. Andere bleekmerken met iets lagere concentraties zullen even goed werken.
    2. Giet het bleekmiddel en de gedechorioneerde embryo's in een opvangmand (een celzeef van 70 μm) en spoel de plaat twee keer af met gedestilleerd water uit een spuitfles, voeg deze wasbeurten toe aan de opvangmand.
    3. Spoel de gedechorioneerde embryo's in de opvangmand krachtig af met gedestilleerd water totdat er geen gistklompen zichtbaar zijn en de mand geen roze vlekken van overtollig bleekmiddel achterlaat wanneer ze op een keukenpapier worden opgeblazen.
  3. Breng met behulp van een penseel met borstelharen bevochtigd met gedestilleerd water ontchorioneerde en gewassen embryo's uit de opvangmand over op de bereide appelsap agarwig op de glazen glijbaan.
  4. Gebruik een pincet met fijne punt of een ontleednaald om tien embryo's in een rechte lijn langs de lange as van de rechthoekige agarwig te rangschikken (figuur 1, stap 3). Rangschik de embryo's van kop tot staart, zodat hun voorste pool naar rechts gericht is en de dorsale kant naar de onderzoeker gericht (figuur 1,stap 3, vergroot).
  5. Snijd 0,5 cm van het uiteinde van een P200 pipetpunt af met een scheermesje en dompel in de "embryolijm" (beschreven in28). Bedek een gebied royaal met een breedte van 5 mm (figuur 1, stap 4) langs de lange rand van een rechthoekige afdeklip van 24 mm x 50 mm en laat de zijkant naar boven drogen, lijmen. Drogen duurt ~ 30 s en is voltooid zodra het hele met lijm bedekte gebied mat lijkt in plaats van nat of glanzend.
    OPMERKING: Bereid "embryolijm" minstens 48 uur van tevoren voor. Voeg n-Heptane toe aan stroken dubbelzijdige tape in een scintillatieflacon zoals beschreven in28.
  6. Zodra de "embryolijm" is opgedroogd, plaatst u de coversliplijmzijde voorzichtig naar beneden op de rij uitgelijnde embryo's op de agar, waardoor er 2-3 mm ruimte overblijft tussen de rand van de coverslip en de rij embryo's.
    OPMERKING: Als u de embryo's te dicht bij de rand van de deklip plakt, kunnen de embryo's tijdens het experiment te veel uitdrogen.
  7. Draai de hoezenlip om zodat de embryo's nu naar boven gericht zijn. Ze moeten worden geplakt in een lijn langs een lange rand van de afdeklip en hun ventrale gebied tegenover de dichtstbijzijnde rand van de afdeklip (figuur 1,stap 4, vergroot).
  8. Desiccateer de embryo's door de coverslip met embryo's voorzichtig bovenop 150 g vers blauw droogmiddel te plaatsen dat is opgeslagen in een 16 oz schroeftoppot. Schroef het deksel stevig vast en incubeer gedurende 8-10 minuten(figuur 1,stap 5).
  9. Verwijder na uitdroging de dekenslip uit de droogmiddelpot en plak elke korte kant van de afdeklip vast aan een microscoopschuif, embryozijde naar boven,met twee4 cm 2 stukken dubbelzijdige tape, zodat de embryo-coverslip op de injectiefase past(figuur 1,stap 6).
  10. Voeg 2-3 druppels Halocarbon 27 olie toe met een Pasteur pipet om de uitgelijnde embryo's te bedekken en te beschermen tegen verdere uitdroging (Figuur 1,stap 6).

4. Injecteer en verwarm stressembryo's om actine staafvorming te bevorderen

OPMERKING: Alle injecties worden uitgevoerd in een temperatuurgecontroleerde ruimte bij 18 °C.

  1. Bereid vochtige incubatiekamers van een glazen Petrischaal van ten minste 100 mm x 20 mm groot en bekleed de kamer met draaien van laboratoriumweefselwissers bevochtigd met gedestilleerd water (figuur 1,stap 8). Verwarm de incubatiekamers voor op 32 °C of de gewenste incubatietemperatuur voordat u embryo's injecteert.
  2. Open de luchtstroomklep voor de micro-injector en schakel de micro-injector in (perslucht of huislucht met een druk van ten minste 90 psi is geschikt).
  3. Terwijl embryo's aan het ontdooien zijn, laadt u de eerder bereide G-actineRed supernatant terug in de microneedle met behulp van een microladertip. Stel de pipet in op 1-1,5 μL.
    OPMERKING: Vanwege de viscositeit van de actine zijn de laadvolumes mogelijk niet nauwkeurig en kan er voldoende actine overblijven om nog minstens één tot twee microneedles te laden. Tot 60 embryo's kunnen per geladen microneedle worden geïnjecteerd als de microneedle goed is gekalibreerd en tijdens het experiment niet verstopt raakt.
  4. Bevestig de microneedle aan de naaldhouder en draai de schroef vast. Sluit de luchtbuis aan op de micro-injector en zorg ervoor dat de terugstroomdruk op de microneedle tot 30 hPa in evenwicht is.
  5. Kalibreer de instellingen van de micro-injector om een bel met een diameter van 100 μm van G-actinRed (~ 500 pL) op een diamicrometer te verwijderen. Draai de drukknop (500-1500 hPa) en de injectiepulstijdknop (0,1-0,5 s) op de micro-injector om de juiste belgrootte te krijgen. Pas deze instellingen aan telkens wanneer een nieuwe microneedle wordt geladen om rekening te houden met variabiliteit in actineviscositeit en microneedle tipgrootte.
    OPMERKING: De bereide G-actineRed is stroperig en er kan lucht in de punt van de microneedle zitten die moet worden verdreven voordat embryo's worden ingejeceerd. Als de G-actineRed niet gemakkelijk uit de punt van de microneedle wordt verwijderd, breek dan voorzichtig de microneedle-punt tegen de rand van de diamicrometer.
  6. Plaats de dia met gemonteerde embryo's op de microscoopfase.
    OPMERKING: Elke injectie die wordt ingesteld, zal anders zijn, dus onderzoekers zullen hun injectiemethode dienovereenkomstig moeten aanpassen. Hier worden de embryo's verplaatst ten opzichte van een stationaire microneedle, waarbij elk embryo wordt geïnjecteerd door het embryo in de microneedle te laten lopen.
  7. Pas het micromanipulatorstadium en de focus van de 10x doelstelling op de lichtmicroscoop aan zodat de embryo's zichtbaar zijn. De embryo's bevinden zich in het juiste brandpuntsvlak wanneer de contouren van het vitellinemembraan het scherpst zijn en het embryo het grootst lijkt. Kies embryo's om te injecteren die zich in de juiste ontwikkelingsfase bevinden, zodat tegen de tijd dat de incubatie na injectie is voltooid, het grootste deel van de koppeling het gewenste ontwikkelingsstadium bereikt (bijvoorbeeld embryo's injecteren in Bownes' stadium 2-330 om staven te observeren bij cellularisatie na hittestress bij 32 °C).
  8. Gebruik de microneedle controls om de naald in hetzelfde brandpuntsvlak te brengen als de embryo's.
    OPMERKING: Als de microneedle tijdens het verplaatsen van het podium of de microneedle op de afdeklip vangt, bevindt de microneedle zich te dicht bij de dia en bevindt deze zich niet in het juiste brandpuntsvlak. De microneedle moet evenwijdig zijn aan de afdeklip en niet onder een significante hoek (figuur 1, stap 7).
  9. Steek de microneedle in het embryo zodat het het embryo raakt in het midden van zijn ventrale gebied, op het embryo "evenaar". Activeer de injectie met het voetpedaal of de knop "injecteren" wanneer de microneedlepunt zichtbaar is in het midden van het embryo (figuur 1,stap 7).
  10. Injecteer de G-actinRed één keer en verwijder langzaam de microneedle. Verplaats het stadium en herhaal dit voor elk embryo van de juiste ontwikkelingsfase.
    OPMERKING: Uitbreiding van het embryo is normaal omdat de G-actineRed wordt geïnjecteerd en een beetje cytoplasma uit het embryo kan lekken.
  11. Nadat alle embryo's zijn geïnjecteerd, plaatst u de dia met de embryo's in de voorbereide vochtige incubatiekamer en sluit u het deksel (figuur 1,stap 8). Als u embryo's probeert te verkrijgen die cellularisatie bereiken, belast u de embryo's gedurende 60-75 minuten bij 32 °C in de vochtige incubatiekamer.
    OPMERKING: Incubatietijden worden opgemerkt die visualisatie van staven in cellulariserende warmtestressed embryo's mogelijk maken. De incubatietijd zal langer zijn voor niet-hittestresscontrole embryo's omdat de ontwikkeling langzamer zal zijn bij een lagere temperatuur31. Deze controleembryo's kunnen worden geïncubeerd in vochtige kamers bij temperaturen zoals 18 °C of 25 °C, afhankelijk van het ontwerp van het specifieke experiment en de te stellen vraag. De minimale incubatietijd die nodig is om de G-actinRed door het hele embryo te verspreiden, is 30 minuten.

5. Beeld actine staven in warmte gestresste embryo's door confocale microscopie

  1. Terwijl de embryo's warmtestress krijgen, schakelt u de confocale microscoop in en selecteert u het laserkanaal van 561 nm.
  2. Verplaats de objectieve lens (25x, 40x of 63x aanbevolen) naar de werkpositie.
  3. Als beeldvorming warmte stresseerde embryo's, stel dan de verwarmde stadium incubator om een interne temperatuur van 32 °C te bereiken. Een point-and-shoot of infrarood thermometer kan worden gebruikt om de temperatuur op of in de buurt van het doel te controleren.
  4. Verwijder de dia met geïnjecteerde embryo's uit de vochtige incubatiekamer nadat de incubatie is voltooid (figuur 1,stap 9).
  5. Snel werkend, wring je voorzichtig de dubbelzijdige tapestukken af die werden gebruikt om de coverslip met gemonteerde embryo's aan de dia te hechten(figuur 1,stap 9).
    LET OP: Wees voorzichtig tijdens deze stappen, want coverslips kunnen gemakkelijk verbrijzelen als er te veel kracht wordt uitgeoefend.
  6. Plak twee 2,5 cm lange stukken dubbelzijdige tape aan elkaar en snijd de tape in de lengte doormidden om twee stroken te maken, 2,5 x 0,5 cm lang (figuur 1,stap 10).
  7. Plak tweederde van de lengte van elke tapestrip op de eerste coverslip en flankeer elke kant van de embryo's in Halocarbon 27-olie(figuur 1,stap 10, oranje),waardoor een derde van de tapestroken aan de rand van de eerste dekzeilen hangt waar de embryo's vastzitten. Gebruik gehandschoende handen en zorg ervoor dat u de embryo's niet aanraakt tijdens deze stap.
  8. Plaats voorzichtig een tweede rechthoekige coverslip op de tapestrips om de embryo's tussen de coverslips te sandwichen (figuur 1,stap 10, blauw). Lijn de randen van 25 mm uit, maar houd de randen van 50 mm 1 cm breed van elkaar.
    OPMERKING: Het volledige oppervlak van deze tweede coverslip wordt het nieuwe beeldoppervlak dat naar de objectieve lens zal worden geconfronteerd, dus zorg ervoor dat u geen vingerafdrukken of Halocarbon 27-olie op dit tweede coverslipoppervlak krijgt. De offset is nodig zodat extra Halocarbon 27 olie kan worden toegevoegd om de embryo's gelijkmatig onder te dompelen. Voeg indien nodig Halocarbon 27-olie toe aan de naad waar de twee coverslips elkaar aan de bovenkant van de sandwich ontmoeten en het zal de embryo's bedekken met capillaire werking (zie stippellijnen in figuur 1,stap 10).
  9. Tik voorzichtig op de delen van de hoeslip die direct bovenop de tapestrips liggen met de stompe kant van een scheermesje om de hoeslip aan de tape te laten hechten.
  10. Draai de coverlip sandwich om en plaats op een lab tissue wisser om het beeldvormingsoppervlak schoon te houden en naar de confocale microscoop te dragen(figuur 1,stap 11). Zorg ervoor dat de tape volledig aan beide coverslips is geplakt voordat u beeld geeft.
  11. Controleer of het verwarmde stadium op temperatuur is en voeg, als u een omgekeerde microscoop gebruikt, dompelvloeistof toe aan de geselecteerde objectieve lens.
  12. Plaats de coverlip sandwich voorzichtig op het podium om er zeker van te zijn dat het nieuwe beeldoppervlak (2e coverslip) degene is die de dompelvloeistof aanraakt (Figuur 1, stap 11).
    OPMERKING: Plak indien nodig de coverslip sandwich met twee kleine stukjes dubbelzijdige tape op het podium om onnodige beweging tijdens de beeldvorming te voorkomen als de coverslips niet goed passen in het verwarmde stadium.
  13. Focus op een embryo dat in cellularisatie is (Bownes stadium 4a30) of het gewenste ontwikkelingsstadium met behulp van overgedragen licht of fluorescentie.
  14. Zodra een embryo in beeld is gebracht, schakelt u over naar de laserverwervingsmodus op de confocale microscoop en past u de laserkracht en versterking, framegrootte, tegels en projectie-instellingen naar wens aan.
  15. Maak beelden van de oppervlakteweergave door de brandpuntsvlakken van de kernen van het embryo om intranucleaire actinestaven te vinden. Staven moeten in meerdere richtingen verschijnen als heldere strepen of stippen in de relatief donkere kernen (figuur 2A, 2C).

6. Alternatieve beeldvormingsexperimenten

  1. Voer FRAP uit om actineomzet te onderzoeken over de lengte van intranucleaire actinestaven of in cytoplasmatische actinestructuren, zoals de uiteinden van de plasmamembraangroeven tijdens cellularisatie.
  2. Kies in de imaging software een rechthoekig gebied rond furrow tips of actin rods om het experiment aan te schaffen.
  3. Kies een klein vierkant gebied in het midden van een actin-staaf binnen het rechthoekige verwervingsgebied om te bleken. Zorg ervoor dat de uiteinden van de actinestaaf zichtbaar zijn en laat u tijdens het experiment niet bleken om een nauwkeurige tracking van de staaf in de kern mogelijk te maken.
  4. Stel de bleeklaser 50x in op itereren en stel het bleekmiddellaservermogen in op maximaal.
  5. Kies een tijdcursus om elke seconde afbeeldingen te verkrijgen voor een totaal tot 120 s bij maximale pixelbewoningssnelheid en stel de laser in op bleken na de eerste twee seconden van het verkrijgen van afbeeldingen.
  6. Kwantificeer de gegevens om de halftijdse fluorescentieherstel te bepalen1.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een schematische workflow van embryoverwerking wordt weergegeven in figuur 1en een tijdschema voor een typisch experiment wordt gepresenteerd in tabel 1. Een schatting voor een goed experimenteel resultaat is dat voor elke 10 geïnjecteerde embryo's ten minste de helft van de bekeken embryo's zich in de juiste ontwikkelingsfase bevindt, onbeschadigd, en een robuuste ASR vertoont met hittestress bij 32 °C. Deze ASR zal worden aangetoond door de assemblage van intranucleaire a...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het belang van deze methode is dat het gebruik maakt van het gevestigde protocol van micro-injectie in Drosophila embryo's21,22,23,24,25,26,27 om nieuw onderzoek met betrekking tot de ASR en de bijbehorende actin staaf assemblage mogelijk te maken. Een groot voordeel van het injecte...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen belangenconflicten aangegeven.

Dankbetuigingen

De auteurs erkennen dankbaar het werk van Liuliu Zheng en Zenghui Xue, die deze techniek hielpen pionieren in het Sokac-lab, evenals Hasan Seede die hielp met de analyse. Het werk voor deze studie wordt gefinancierd door een subsidie van NIH (R01 GM115111).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Adenosine trifosfaat (ATP)Millipore-SigmaA23835GComponent van G-buffer
Appelsap, Mott's, 64 fl ozMott's014800000344Component van appelsapplaten
Bacto AgarBD214010Component van appelsapplaten
Bleach, PureBright Germicidal, 6,0% natriumhypochlorietKIK International059647210020Voor het ontdopnen van embryo's
CalciumchlorideMillipore-SigmaC1016500GComponent van G-buffer
Celzevener, 70 µmFalcon352350Voor het verzamelen van ontdopte embryo's
Confocale microscoop, LSM 880 34-kanaals met AiryscanZeiss0000001994956Voor het beeldvormen van intranucleaire actinestaven
DroogmiddelDrierite24001Voor het drogen van embryo's
Dissectiemicroscoop, Stemi 508 Stereoscope met 8:1 zoomZeiss4350649000000Voor het rangschikken van embryo's op een agarwig
Dissectie-naald, 5 inchFisher Scientific08965AVoor het rangschikken van embryo's op een agarwig
Dithiothreitol (DTT)Fisher ScientificBP1725Component van G-buffer
Dubbelzijdig plakband, Scotch Permanent, 0,5 inch x 250 inch3M021200010323Voor het maken van embryolijm
EmbryocollectiekooiGenessee Scientific59100Voor het huisvesten van volwassen vliegen en het verzamelen van embryo's
Fijne pincet, Dumont Pincet, Stijl 5Electron Microscopy Sciences72701DVoor het rangschikken van embryo's op een agarwig
Glascapillairen, Borosilicaatglas, dun 1 mm x 0,75 mmWorld Precision Instruments, Inc.TW1004Voor micronaalden
Halocarbon olie 27Millipore-SigmaH8773100MLVoor de hydratatie van embryo's
Verwarmde stageschomeZeiss4118579020000, 4118609020000, 4118609010000Voor confocale beeldvorming
Labdoekjes, KimWipesKimberly-Clark34155Labdoekjes
Lichtmicroscoop, Invertoskop 40C Inverted Phase contrast microscoop, gereviseerdZeissNiet meer verkrijgbaarInjectiemicroscoop
Methyl-4-hydroxybenzoaatMillipore-SigmaH36471KGComponent van appelsapplaten
Microinjector, FemtoJet4xEppendorf5253000025Microinjector
Micro loader tips, epT.I.P.S. 20 µLEppendorf5242956003Voor het laden van micronaalden
Micromanipulator en injectiestandaard met x,y,z-draaiknoppen voor naaldinstellingBernard Instruments, Inc (Houston, TX)AangepastVoor het uitvoeren van microinjecties
Micropipet aantrekker, Model P-97, Flaming/BrownSutter InstrumentsP97Voor het trekken van capillaire buisjes om micronaalden te maken
Microscoopglaasje 24x50-1,5Fisher Scientific12544EVoor het monteren van embryo's
Microscoopglazen, Lilac Colorfrost, Voorgereinigd, 25 x 75 x 1mmFisher Scientific22037081Voor het monteren van embryo's voor injectie
n-HeptaanFisher ScientificH3601Component van embryolijm
Objectief, 10xZeissNiet meer verkrijgbaar10x objectief voor injectiemicroscoop
Objectief, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCSZeiss421767997171140x waterobjectief voor confocale
Objectief, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0,8 Imm Cor DIC M27 voor olie, water, siliconenolië of glycerine drenken (D=0-0,17mm) (WD=0,57mm bij D=0,17mm)Zeiss420852987100025x gemengd drenkobjectief voor confocale
Objectief, Plan-Apocrhomat 63x/1,40 Olie DIC f/ELYRAZeiss420782990079963x oliëobjectief voor confocale
Verfkwast, Robert Simmons Expression E85 Puntige Ronde maat 2Daler-Rowney038372016954Voor het overbrengen van embryo's
Papierhanddoeken, Kleenex C-vouw papierhanddoeken, witKimberly-Clark884266344845Voor het afdrogen van de celzevener
Pasteurpijp, 5 3/4 inchFisher Scientific1367820AVoor het bedekken van embryo's met olie
Petrischaal, glas, 100 x 20 mmCorning3160102Voor vochtige incubatiekamer
Petrischaal, kunststof, 60 x 15 mmVWR25384092Voor appelsapplaten
Pipet, Eppendorf Referentie 0,5-10 µLEppendorf2231000604Voor het laden van de micronaald
Pipettip, xTIP4 250 µLBiotix63300006Voor het toevoegen van embryolijm aan de dekplaat
ScheermesjeVWR55411050Voor het snijden van agarwig, plakband, pipettips
Rhodamine-geconjugeerd globulair actine, menselijke bloedplaatjes (niet-spier; 4x10 µg)Cytoskeleton, Inc.APHR-AG-

Referenties

  1. Figard, L., et al. Cofilin-mediated Actin Stress Response is maladaptive in heat-stressed embryos. Cell Reports. 26 (49), 3493-3501 (2019).
  2. Ashworth, S. L., et al. ADF/cofilin mediates actin cytoskeletal alterations in LLC-PK cells during ATP depletion. American Journal of Physiology Renal Physiology. 284 (4), 852-862 (2003).
  3. Vandebrouck, A., et al. In vitro analysis of rod composition and actin dynamics in inherited myopathies. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (5), 429-441 (2010).
  4. Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function. Nature Cell Biology. 2 (9), 628-636 (2000).
  5. Bamburg, J. R., et al. ADF/Cofilin-actin rods in neurodegenerative diseases. Current Alzheimer Research. 7 (3), 241-250 (2010).
  6. Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in alzheimer disease. Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).
  7. Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons. AJP: Cell Physiology. 291 (5), 828-839 (2006).
  8. Munsie, L. N., Desmond, C. R., Truant, R. Cofilin nuclear-cytoplasmic shuttling affects cofilin-actin rod formation during stress. Journal of Cell Science. 125 (17), 3977-3988 (2012).
  9. Iida, K., Iida, H., Yahara, I. Heat shock induction of intranuclear actin rods in cultured mammalian cells. Experimental Cell Research. 165, 207-215 (1986).
  10. Ohta, Y., Nishida, E., Sakai, H., Miyamoto, E. Dephosphorylation of cofilin accompanies heat shock-induced nuclear accumulation of cofilin. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16143-16148 (1989).
  11. Iida, K., Matsumoto, S., Yahara, I. The KKRKK sequence is involved in heat shock-induced nuclear translocation of the 18-kDa actin-binding protein, cofilin. Cell Structure and Function. 17 (1), 39-46 (1992).
  12. Minamide, L. S., et al. Isolation and characterization of cytoplasmic cofilin-actin rods. Journal of Biological Chemistry. 285 (8), 5450-5460 (2010).
  13. Masurovsky, E. B., Benitez, H. H., Kim, S. U., Murray, M. R. Origin, development, and nature of intranuclear rodlets and associated bodies in chicken sympathetic neurons. The Journal of Cell Biology. 44 (7), 172-191 (1970).
  14. Feldman, M. L., Peters, A. Intranuclear rods and sheets in rat cochlear nucleus. Journal of Neurocytology. 1 (2), 109-127 (1972).
  15. Nishida, E., et al. Cofilin is a component of intranuclear and cytoplasmic actin rods induced in cultured cells. Cell Biology. 84 (8), 5262-5266 (1987).
  16. Ono, S., Abe, H., Nagaoka, R., Obinata, T. Colocalization of ADF and cofilin in intranuclear actin rods of cultured muscle cells. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (2), 195-204 (1993).
  17. Xue, Z., Sokac, A. M. Back-to-back mechanisms drive actomyosin ring closure during Drosophila embryo cleavage. The Journal of Cell Biology. 215 (3), 335-344 (2016).
  18. Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. Nuf, a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization. Journal of Cell Biology. 182 (2), 301-313 (2008).
  19. Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental Biology. 393 (2), 209-226 (2014).
  20. Chen, Q., Nag, S., Pollard, T. D. Formins filter modified actin subunits during processive elongation. Journal of Structural Biology. 177 (1), 32-39 (2012).
  21. Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. (50), 2477(2011).
  22. Juarez, M. T., Patterson, R. A., Li, W., McGinnis, W. Microinjection wound assay and in vivo localization of epidermal wound response reporters in Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 81, 50750(2013).
  23. Carreira-Rosario, A., et al. Recombineering homologous recombination constructs in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (77), 50346(2013).
  24. Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. Microinjection techniques for studying mitosis in the Drosophila melanogaster syncytial embryo. Journal of Visualized Experiments. (31), 1382(2009).
  25. Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P. Visualizing and tracking endogenous mRNAs in live Drosophila melanogaster egg chambers. Journal of Visualized Experiments. (148), 58545(2019).
  26. Wessel, A. D., Gumalla, M., Grosshans, J., Schmidt, C. F. The mechanical properties of early Drosophila embryos measured by high-speed video microrheology. Biophysical Journal. 108 (8), 1899-1907 (2015).
  27. Mollinari, C., González, Microinjection and transgenesis. Microinjection and Transgenesis: Strategies and Protocols. Cid-Arregui, A., García-Carrancá, A. , Springer. Berlin. 587-603 (1998).
  28. Figard, L., Sokac, A. M. Imaging cell shape change in living Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. (49), 2503(2011).
  29. Oesterle, A. Pipette Cookbook 2018: P-97 and P-1000 Micropipette Pullers. , Sutter Instruments. Novato, CA. (2018).
  30. Bownes, M. A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 33 (3), 789-801 (1975).
  31. Powsner, L. The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster. Physiological Zoology. 8 (4), 474-520 (1935).
  32. Hunter, M. V., Willoughby, P. M., Bruce, A. E. E., Fernandez-Gonzalez, R. Oxidative Stress Orchestrates Cell Polarity to Promote Embryonic Wound Healing. Developmental Cell. 47 (3), 377-387 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Hittestressmicro-injectietechniekconfocale microscopieFRAP-experimentenG-actine roodactinestressresponsembryo-montagefluorescentieherstel
Beeldvorming Intranucleaire Actin Staven in Live Heat Stressed Drosophila Embryo's
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.