Het doel van dit protocol is om Rhodamine-geconjugeerde bolvormige actine te injecteren in Drosophila embryo's en beeld intranucleaire actine staaf assemblage na hitte stress.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Beeldvorming Intranucleaire Actin Staven in Live Heat Stressed Drosophila Embryo's
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het doel van dit protocol is om intranucleaire actinestaven te visualiseren die zich verzamelen in levende Drosophila melanogaster embryo's na hittestress. Actin staven zijn een kenmerk van een geconserveerde, induceerbare Actin Stress Response (ASR) die gepaard gaat met menselijke pathologieën, waaronder neurodegeneratieve ziekte. Eerder toonden we aan dat de ASR bijdraagt aan morfogenesefalen en verminderde levensvatbaarheid van het ontwikkelen van embryo's. Dit protocol maakt de voortdurende studie mogelijk van mechanismen die ten grondslag liggen aan actine staafassemblage en de ASR in een modelsysteem dat zeer vatbaar is voor beeldvorming, genetica en biochemie. Embryo's worden verzameld en op een afdeklip gemonteerd om ze voor te bereiden op injectie. Rhodamine-geconjugeerde bolvormige actine (G-actineRed) wordt verdund en in een microneedle geladen. Een enkele injectie wordt gemaakt in het midden van elk embryo. Na injectie worden embryo's geïncubeerd bij verhoogde temperatuur en intranucleaire actinestaven worden vervolgens gevisualiseerd door confocale microscopie. Fluorescentieherstel na fotobleaching (FRAP) experimenten kunnen worden uitgevoerd op de actinestaven; en andere actinerijke structuren in het cytoplasma kunnen ook in beeld worden We vinden dat G-actineRed polymeriseert als endogene G-actine en op zichzelf de normale embryoontwikkeling niet verstoort. Een beperking van dit protocol is dat er tijdens de injectie op moet worden gelet om ernstig letsel aan het embryo te voorkomen. Echter, met de praktijk, het injecteren van G-actineRood in Drosophila embryo's is een snelle en betrouwbare manier om actine staven te visualiseren en kan gemakkelijk worden gebruikt met vliegen van elk genotype of met de introductie van andere cellulaire spanningen, waaronder hypoxie en oxidatieve stress.
Inleiding
Dit protocol beschrijft hoe G-actineRood te injecteren om de assemblage van intranucleaire actine staven in hitte-gestresste embryo's die een induceerbare Actin Stress Response (ASR)ondergaan visualiseren 1. We ontwikkelden dit protocol ter ondersteuning van studies van de ASR, die in embryo's leidt tot verstoorde morfogenese en verminderde levensvatbaarheid, en bij volwassen menselijke celtypen wordt geassocieerd met pathologieën zoals nierfalen2, spier myopathieën3, en Alzheimer en De Ziekte van Huntington4,5,
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Bereid embryoverzamelingsbekers en appelsap-agarplaten voor
- Bouw vijf dagen voor het injectie-experiment28 of koop ten minste twee kleine embryoverzamelingsbekers. Maak verse 60 mm appelsap agar borden te gebruiken met kleine collectie kopjes28. Bewaar platen in plastic dozen bedekt met vochtige papieren handdoeken op 4 °C.
OPMERKING: Kleine embryoverzamelingsbekers, gevuld met vliegnummers zoals beschreven in stap 1.3, zullen per experiment voldoende embryonummers opleveren, terwijl ze er ook voor zorgen dat embryobehandeling en -injectie in korte tijd kunnen worden gedaan om beeldvorming van vroege ontw....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een schematische workflow van embryoverwerking wordt weergegeven in figuur 1en een tijdschema voor een typisch experiment wordt gepresenteerd in tabel 1. Een schatting voor een goed experimenteel resultaat is dat voor elke 10 geïnjecteerde embryo's ten minste de helft van de bekeken embryo's zich in de juiste ontwikkelingsfase bevindt, onbeschadigd, en een robuuste ASR vertoont met hittestress bij 32 °C. Deze ASR zal worden aangetoond door de assemblage van intranucleaire a.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het belang van deze methode is dat het gebruik maakt van het gevestigde protocol van micro-injectie in Drosophila embryo's21,22,23,24,25,26,27 om nieuw onderzoek met betrekking tot de ASR en de bijbehorende actin staaf assemblage mogelijk te maken. Een groot voordeel van het injecte.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten aangegeven.
Dankbetuigingen
De auteurs erkennen dankbaar het werk van Liuliu Zheng en Zenghui Xue, die deze techniek hielpen pionieren in het Sokac-lab, evenals Hasan Seede die hielp met de analyse. Het werk voor deze studie wordt gefinancierd door een subsidie van NIH (R01 GM115111).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
```html
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Adenosine trifosfaat (ATP) | Millipore-Sigma | A23835G | Component van G-buffer |
| Appelsap, Mott's, 64 fl oz | Mott's | 014800000344 | Component van appelsapplaten |
| Bacto Agar | BD | 214010 | Component van appelsapplaten |
| Bleach, PureBright Germicidal, 6,0% natriumhypochloriet | KIK International | 059647210020 | Voor het ontdopnen van embryo's |
| Calciumchloride | Millipore-Sigma | C1016500G | Component van G-buffer |
| Celzevener, 70 µm | Falcon | 352350 | Voor het verzamelen van ontdopte embryo's |
| Confocale microscoop, LSM 880 34-kanaals met Airyscan | Zeiss | 0000001994956 | Voor het beeldvormen van intranucleaire actinestaven |
| Droogmiddel | Drierite | 24001 | Voor het drogen van embryo's |
| Dissectiemicroscoop, Stemi 508 Stereoscope met 8:1 zoom | Zeiss | 4350649000000 | Voor het rangschikken van embryo's op een agarwig |
| Dissectie-naald, 5 inch | Fisher Scientific | 08965A | Voor het rangschikken van embryo's op een agarwig |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP1725 | Component van G-buffer |
| Dubbelzijdig plakband, Scotch Permanent, 0,5 inch x 250 inch | 3M | 021200010323 | Voor het maken van embryolijm |
| Embryocollectiekooi | Genessee Scientific | 59100 | Voor het huisvesten van volwassen vliegen en het verzamelen van embryo's |
| Fijne pincet, Dumont Pincet, Stijl 5 | Electron Microscopy Sciences | 72701D | Voor het rangschikken van embryo's op een agarwig |
| Glascapillairen, Borosilicaatglas, dun 1 mm x 0,75 mm | World Precision Instruments, Inc. | TW1004 | Voor micronaalden |
| Halocarbon olie 27 | Millipore-Sigma | H8773100ML | Voor de hydratatie van embryo's |
| Verwarmde stageschome | Zeiss | 4118579020000, 4118609020000, 4118609010000 | Voor confocale beeldvorming |
| Labdoekjes, KimWipes | Kimberly-Clark | 34155 | Labdoekjes |
| Lichtmicroscoop, Invertoskop 40C Inverted Phase contrast microscoop, gereviseerd | Zeiss | Niet meer verkrijgbaar | Injectiemicroscoop |
| Methyl-4-hydroxybenzoaat | Millipore-Sigma | H36471KG | Component van appelsapplaten |
| Microinjector, FemtoJet4x | Eppendorf | 5253000025 | Microinjector |
| Micro loader tips, epT.I.P.S. 20 µL | Eppendorf | 5242956003 | Voor het laden van micronaalden |
| Micromanipulator en injectiestandaard met x,y,z-draaiknoppen voor naaldinstelling | Bernard Instruments, Inc (Houston, TX) | Aangepast | Voor het uitvoeren van microinjecties |
| Micropipet aantrekker, Model P-97, Flaming/Brown | Sutter Instruments | P97 | Voor het trekken van capillaire buisjes om micronaalden te maken |
| Microscoopglaasje 24x50-1,5 | Fisher Scientific | 12544E | Voor het monteren van embryo's |
| Microscoopglazen, Lilac Colorfrost, Voorgereinigd, 25 x 75 x 1mm | Fisher Scientific | 22037081 | Voor het monteren van embryo's voor injectie |
| n-Heptaan | Fisher Scientific | H3601 | Component van embryolijm |
| Objectief, 10x | Zeiss | Niet meer verkrijgbaar | 10x objectief voor injectiemicroscoop |
| Objectief, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCS | Zeiss | 4217679971711 | 40x waterobjectief voor confocale |
| Objectief, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0,8 Imm Cor DIC M27 voor olie, water, siliconenolië of glycerine drenken (D=0-0,17mm) (WD=0,57mm bij D=0,17mm) | Zeiss | 4208529871000 | 25x gemengd drenkobjectief voor confocale |
| Objectief, Plan-Apocrhomat 63x/1,40 Olie DIC f/ELYRA | Zeiss | 4207829900799 | 63x oliëobjectief voor confocale |
| Verfkwast, Robert Simmons Expression E85 Puntige Ronde maat 2 | Daler-Rowney | 038372016954 | Voor het overbrengen van embryo's |
| Papierhanddoeken, Kleenex C-vouw papierhanddoeken, wit | Kimberly-Clark | 884266344845 | Voor het afdrogen van de celzevener |
| Pasteurpijp, 5 3/4 inch | Fisher Scientific | 1367820A | Voor het bedekken van embryo's met olie |
| Petrischaal, glas, 100 x 20 mm | Corning | 3160102 | Voor vochtige incubatiekamer |
| Petrischaal, kunststof, 60 x 15 mm | VWR | 25384092 | Voor appelsapplaten |
| Pipet, Eppendorf Referentie 0,5-10 µL | Eppendorf | 2231000604 | Voor het laden van de micronaald |
| Pipettip, xTIP4 250 µL | Biotix | 63300006 | Voor het toevoegen van embryolijm aan de dekplaat |
| Scheermesje | VWR | 55411050 | Voor het snijden van agarwig, plakband, pipettips |
| Rhodamine-geconjugeerd globulair actine, menselijke bloedplaatjes (niet-spier; 4x10 µg) | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | G- |
Referenties
- Figard, L., et al. Cofilin-mediated Actin Stress Response is maladaptive in heat-stressed embryos. Cell Reports. 26 (49), 3493-3501 (2019).
- Ashworth, S. L., et al. ADF/cofilin mediates actin cytos....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
