Methodenartikel

Native Cell Membrane Nanodeeltjes Systeem voor Membraan Eiwit-Eiwit Interactie Analyse

DOI:

10.3791/61298

⸱

16 juli 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicinal Chemistry, School of Pharmacy, Virginia Commonwealth University, 2Institute for Structural Biology, Drug Discovery and Development, School of Pharmacy, Virginia Commonwealth University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de bepaling van oligomere toestand van membraaneiwitten dat gebruik maakt van een inheems celmembraan nanodeeltjessysteem in combinatie met elektronenmicroscopie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eiwit-eiwitinteracties in celmembraansystemen spelen een cruciale rol in een breed scala aan biologische processen, van cel-tot-celinteracties tot signaaltransductie; van het detecteren van omgevingssignalen tot biologische respons; van metabole regulatie tot ontwikkelingscontrole. Nauwkeurige structurele informatie over eiwit-eiwitinteracties is cruciaal voor het begrijpen van de moleculaire mechanismen van membraaneiwitcomplexen en voor het ontwerp van zeer specifieke moleculen om deze eiwitten te moduleren. Er zijn veel in vivo en in vitro benaderingen ontwikkeld voor de detectie en analyse van eiwit-eiwit interacties. Onder hen is de structurele biologiebenadering uniek omdat het directe structurele informatie kan geven over eiwit-eiwitinteracties op atomair niveau. De huidige structurele biologie van membraaneiwitten is echter nog steeds grotendeels beperkt tot methoden op basis van detergentia. Het grote nadeel van methoden op basis van detergentia is dat ze vaak membraaneiwitcomplexen dissocieren of denatureren zodra hun inheemse lipide-bilayeromgeving wordt verwijderd door wasmiddelmoleculen. We hebben een native cell membrane nanodeeltjes systeem ontwikkeld voor membraan eiwit structurele biologie. Hier demonstreren we het gebruik van dit systeem bij de analyse van eiwit-eiwitinteracties op het celmembraan met een case study van de oligomere toestand van AcrB.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eiwit-eiwit interacties (PPI) spelen een cruciale rol in de biologie, van het behoud van de structuur en functie van eiwitten tot de regulering van hele systemen. PPR's zijn er in veel verschillende vormen en kunnen worden gecategoriseerd op basis van welke soorten interacties ze vormen. Een dergelijke categorisatie is homooligomerisch of heterooligomerisch, gebaseerd op de vraag of de interacties tussen identieke subeenheden of verschillende eiwitten zijn die als subeenheden werken. Een andere categorisatie is gebaseerd op de kracht van de interactie als de interacties leiden tot de vorming van stabiele complexen of voorbijgaande complexe toestanden. Structurele informatie over de PPR's tussen eiwitten is cruciaal om het mechanisme te begrijpen waarmee eiwitten hun functie uitvoeren. Geschat wordt dat meer dan 80% van de eiwitten afhankelijk is van complexe vorming om hun functionele rol uit te voeren1. Gezien het percentage waargenomen eiwitten dat afhankelijk is van PPR's voor een goede aangeboren werking, is hun betekenis in de biologie duidelijk, maar het goed kunnen onderzoeken van de eiwitten die deelnemen aan deze interacties is een uitdaging gebleven vanwege beperkingen in de technieken die beschikbaar zijn om experimenteel te observeren wanneer eiwitten PPR's vormen.

Er is een grote mate van onenigheid tussen de resultaten voor veel experimenteel bepaalde PPR's vanwege de hoge hoeveelheid ruis, valse positieven en valse negatieven die zijn afgeleid van veel van de momenteel beschikbare PPI-bepalingstechnieken. Dit geldt met name voor het gist tweehybride (Y2H)-systeem, tandemaffiniteitzuiveringsmassaspectrometrie (TAP-MS) en fluorescentieresonantie-energieoverdracht (FRET), die drie van de meest gebruikte methoden voor PPI-bepaling2,3,4,5,6,7vertegenwoordigen . Ter vergelijking: eiwitstructuurbiologietechnieken, zoals nucleaire magnetische resonantie (NMR), röntgenkristallografie en elektronenmicroscopie (EM), kunnen worden gebruikt om structurele informatie in hoge resolutie over eiwit-eiwitinteracties tot op atomair niveau te verkrijgen en de directe visuele bevestiging mogelijk te maken van de interacties die optreden voor een doeleiwit van belang. Alle momenteel beschikbare niet-structuurgebaseerde PPI-bepalende onderzoekstechnieken (bijv. Y2H, TAP-MS en FRET) missen dit vermogen en hebben bovendien moeite met het identificeren van zwakke en voorbijgaande interacties tussen eiwitten5. Deze tekortkomingen worden verder versterkt bij het bestuderen van membraaneiwitten vanwege de extra complexiteit veroorzaakt door de extra variabele van de lipideomgeving die de vorming van de juiste quaternaire structuur en heteromere complexe assemblage beïnvloedt.

Membraaneiwitten vormen een groot deel van het proteoom en staan erom bekend dat ze veel cruciale rollen spelen bij het goed functioneren van cellen in alle levende organismen. Ondanks het feit dat membraaneiwitten naar schatting 27% van het menselijk genoom uitmaken en ~ 60% van alle huidige medicijndoelenvormen,is er een grote anomalie in het aantal opgeloste modellen voor membraaneiwitten die slechts ~ 2,2% van alle gepubliceerde eiwitstructurenuitmaken 8,9,10. De belangrijkste oorzaak van de discrepantie in de beschikbaarheid van structurele informatie ligt in de intrinsieke eigenschappen van membraaneiwitten zelf. Vanwege hun slechte oplosbaarheid, afhankelijkheid van interacties met een lipideomgeving voor het behoud van de inheemse structuur en functie, en verschillende fysisch-chemische eigenschappen van het lipidemembraan zelf, blijven membraaneiwitten een aanzienlijk probleem vormen bij het implementeren van structurele biologietechnieken om ze te bestuderen. Van deze intrinsieke eigenschappen is de belangrijkste voor het verkrijgen van nauwkeurige structurele informatie de vereiste van interacties met hun natuurlijke lipideomgeving om hun oorspronkelijke structuur en functie te behouden. De lipideomgeving is zo'n integraal onderdeel van de structuur en functie van membraaneiwitten dat het concept memteïne (een combinatie van de woorden membraan en eiwit) is voorgesteld als de fundamentele eenheid van membraan-eiwitstructuur en functie11. Ondanks het belang van lipide-eiwitinteracties vereisen de momenteel beschikbare structuurgebaseerde PPI-bepalingstechnieken vaak dat de bestudeerde eiwitten oplosbaar zijn of worden opgelost met detergentia. Blootstelling aan agressieve detergentia kan de eiwitten denatureren of valse positieven en negatieven veroorzaken als gevolg van delipidatie, wat aggregatie, denaturatie van eiwitten, dissociatie van niet-covalente interacties en vorming van kunstmatige oligomere toestanden kan veroorzaken. Vanwege de noodzaak van het handhaven van een natuurlijke lipideomgeving voor nauwkeurige bepaling van de inheemse oligomere toestand van membraaneiwitten hebben we een Native Cell Membrane Nanoparticles system (NCMNs)12 ontwikkeld op basis van de eerder gerapporteerde Styreen Maleic Acid Lipid Particles (SMALP)13-methode.

SMALP gebruikt styreen maleïnezuurcopolymeer als een membraan actief polymeer om membraaneiwitten te extraheren en op te slubiliseren. Poly (Styreen-co-Maleic Acid) (SMA) is een uniek amfifiel polymeer vanwege zijn hydrofobe styreen moiety en diametraal tegengestelde hydrofiele maleïnezuur moiety. Het vormt nanodeeltjes door het celmembraan te adsorberen, destabiliseren en verstoren in een pH-afhankelijk mechanisme14. Deze functionele activiteit van SMA maakt het mogelijk om het te gebruiken als een wasmiddelvrij systeem voor membraaneiwitextractie en oplosbaarheid. Het NCMN-systeem onderscheidt zich in verschillende aspecten van het SMALP-systeem. Het meest unieke kenmerk van het NCMN-systeem is dat het een membraan actieve polymeerbibliotheek heeft met een veelheid aan polymeren die unieke eigenschappen hebben die ze geschikt maken voor de isolatie van veel verschillende membraaneiwitten die verschillende omstandigheden voor stabiliteit en native werking vereisen. Het NCMN-systeem heeft ook verschillende protocollen in vergelijking met de SMALP-methode als het gaat om het voorbereiden van de nanodeeltjes. Een voorbeeld hiervan is dat NCMN's een kolomzuivering met nikkelaffiniteit in één stap gebruiken voor de bepaling van de structuur met hoge resolutie; het effect van deze verschillende protocollen kan worden waargenomen bij het vergelijken van het NCMNs-protocol, dat 3,2 en 3,0 Å cryo-EM AcrB-structuren genereerde, met een vergelijkbare studie met behulp van de SMALP-methode, wat resulteerde in een cryo-EM AcrB-structuur met een resolutie van 8,8 Å12,15. Deze unieke kenmerken van het NCMN-systeem zijn de verbeteringen die zijn aangebracht op de eerder vastgestelde SMALP-methode en maken het een ideale kandidaat voor de studie van PPR's.

De multidrug efflux transporter AcrB bestaat als functionele homotrimeer in E. coli12. Een mutagene analyse suggereerde dat een enkele P223G-puntmutatie, gelegen op een lus die verantwoordelijk is voor de stabiliteit van de AcrB-trimer, de trimertoestand destabiliseert en een AcrB-monomeer oplevert wanneer deze wordt bereid met het wasmiddel DDM, dat kan worden gedetecteerd met native blue gel electrophoresis16. De FRET-analyse van de AcrB-P223G-mutant suggereerde echter dat in de oorspronkelijke celmembraanlipide-bilayeromgeving de meerderheid van mutant AcrB-P223G nog steeds als trimer bestond en dat de expressieniveaus voor zowel wild type AcrB als AcrB-P223G vergelijkbaar zijn. Maar ondanks de resultaten van de FRET-analyse toonde een activiteitstest voor de mutante transporter aan dat de activiteit drastisch daalde in vergelijking met het wilde type16. Hoewel FRET-technologie in de volksmond is gebruikt voor de analyse van eiwit-eiwitinteracties, heeft onderzoek aangetoond dat het vaak valse positieven kan geven17,18,19,20.

Onlangs werden cryo-EM-structuren met hoge resolutie van de AcrB-trimer bepaald die de interactie van AcrB met de bijbehorende inheemse celmembraanlipide-bilayer lieten zien door het gebruik van de NCMNs12. In principe kunnen de NCMN's gemakkelijk worden gebruikt voor de analyse van eiwit-eiwitinteracties op het inheemse celmembraan. In een test van dit systeem werden experimenten uitgevoerd om de oligomere toestand van AcrB-P223G direct te observeren met behulp van native cell membrane nanodeeltjes en negatieve vlekkende elektronenmicroscopie. Om te vergelijken met het wilde type AcrB nanodeeltjes, gebruikten we hetzelfde membraan actieve polymeer (SMA2000 gemaakt in ons laboratorium, dat is geïndexeerd als NCMNP1-1 in de NCMN-bibliotheek) gebruikt voor hoge resolutie cryo-EM structuurbepaling van AcrB en alternatieve polymeren gevonden in de NCMN's bibliotheek12. Op basis van de eerder gerapporteerde resultaten werd verwacht dat de meerderheid van de AcrB-P223G-mutant zou bestaan in de vorm van trimerische inheemse celmembraan nanodeeltjes21. Er werden echter geen AcrB-trimers in het monster gevonden, zoals die welke werden waargenomen met het wilde type AcrB. Dit suggereert dat de meerderheid van AcrB-P223G geen trimers vormt op het oorspronkelijke celmembraan zoals eerder gesuggereerd.

Hier rapporteren we een gedetailleerde analyse van de mutant E. coli AcrB-P223G in een vergelijking met het wilde type E. coli AcrB met behulp van de NCMNs. Deze case study van AcrB suggereert dat NCMNs een goed systeem is voor eiwit-eiwit interactie analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Eiwitexpressie

  1. Ent 15 ml Terrific Bouillon (TB) media met antibiotica specifiek voor plasmiden met BL21(DE3) pLysS cellen die de AcrB uitdrukken plasmiden in 50 ml buizen 's nachts bij 37 °C met schudden bij 250 tpm.
  2. Controleer de optische dichtheid van de nachtcultuur bij 600 nm (OD600) en zorg ervoor dat deze meer dan 2,0 is.
  3. Verdun 5 ml celkweek tot 1 L tbc-media die antibiotica bevatten die specifiek zijn voor plasmiden en incubeer bij 37 °C met schudden tot OD600=0,8 en induceer vervolgens met IPTG met een uiteindelijke concentratie van 1 mM.
  4. Voer inductie uit bij 20 °C met schudden gedurende 20 uur.
  5. Pellet door de cellen met behulp van centrifugatie gedurende 15 minuten bij 4 °C en 4.000 x g.

2. Cellyse en membraanisolatie

  1. Resuspend de celpellet in Buffer A(tabel 1, gebruik DDM Buffer A of NCMNs Buffer A afhankelijk van het te volgen zuiveringsschema) met 80 ml voor elke 20 g van de celpellet.
  2. Homogeniseer de geresuspendeerde celkorrels met behulp van een glazen Dounce-homogenisator bij 4 °C of als u bij kamertemperatuur onmiddellijk daarna op het ijs zet.
  3. Breng het monster over in een metalen bekerglas op ijs en lyseer de cellen door ze te laden in een hogedrukhomogenisator bij 4 °C en 1.500 bar.
    1. Herhaal het proces van het laden van de cellen in de homogenisator en laat ze gedurende 3-4 cycli door de homogenisator gaan of totdat het lysaat begint te verduidelijken.
  4. Centrifugeer het lysaat bij 15.000 x g gedurende 30 min bij 4 °C.
  5. Verzamel de supernatant en laad in ultracentrifugebuizen en centrifugeer bij 215.000 x g gedurende 1 uur bij 4 °C.
  6. Gooi de supernatant weg en verzamel de membraankorrels uit de ultracentrifugebuizen. Bewaar overtollige membraankorrels bij -80 °C.

3. Voorbereiding van inheemse celmembraan nanodeeltjes

  1. Resuspend 1 g membraankorrel in 10 ml NCMNs Buffer A (tabel 1).
  2. Homogeniseer het geresuspendeerde celmembraanmonster met een glazen Dounce-homogenisator bij 20 °C.
  3. Breng het gesuspendeerde membraanmonster over in een polypropyleenbuis van 50 ml en voeg membraan actieve polymerenvoorraadoplossing en extra NCMNs Buffer A toe om het monster naar een uiteindelijke concentratie van 2,5% (w/v) membraan actief polymeer (NCMNP1-1 of NCMNP5-2) te brengen.
    OPMERKING: Voorraadoplossingen van membraanactieve polymeren moeten worden gemaakt in dubbel gedestilleerd water en kunnen in verschillende concentraties worden bewaard, maar meestal 10% (w/v).
  4. Schud het monster gedurende 2 uur bij 20 °C.
  5. Laad het monster in een ultracentrifuge en draai bij 150.000 x g gedurende 1 uur bij 20 °C.
  6. Terwijl het monster ultracentrifugeert, begint het een Ni-NTA-kolom van 5 ml in evenwicht te gebracht met 25 ml NCMNs-buffer A.
  7. Verzamel de supernatant nadat de ultracentrifugatie is voltooid en laad deze op 5 ml Ni-NTA-kolom bij kamertemperatuur met een debiet van 0,5 ml/min met behulp van een spuitpomp.
  8. Was snelle eiwitvloeistofchromatografielijnen (FPLC) met voldoende NCMNs Buffer B (tabel 1) om het systeem volledig door te spoelen en sluit de kolom vervolgens aan op de FPLC-machine.
  9. Was de kolom met 30 ml NCMNs Buffer B met een debiet van 1 ml/min en verzamel de stroom door.
  10. Was de kolom met 30 ml NCMNs Buffer C (tabel 1) met een debiet van 1 ml/min en verzamel de stroom door.
  11. Eluteer het eiwit met 20 ml NCMNs Buffer D (tabel 1) bij een debiet van 0,5 ml/min en verzamel het monster met behulp van een fractiecollector en de fracties die elk op 1,0 ml worden ingesteld.
  12. Bewaar de eiwitmonsters op 4 °C.
  13. Voer een SDS-PAGE gelelektroforesetest uit om de monsters te controleren die overeenkomen met pieken die in de FPLC-elutiegrafiek worden waargenomen.

4. SDS-PAGE gel elektroforese

  1. Bereid de gietkamer voor door het glas aan het gietapparaat te klemmen.
  2. Bereid de 12% scheidingsgel volgens het recept in tabel 1.
    OPMERKING: Zodra TEMED is toegevoegd, zal de gel snel polymeriseren, dus voeg dit pas toe zodra u klaar bent om de gel te gieten.
  3. Giet de gel, laat 2 cm onder de bodem van de kam voor de stapelgel.
  4. Verwijder eventuele bubbels door de bovenkant van de gel te gelaagd met 100% isopropanol en wacht tot de scheidingsgel polymeriseert.
  5. Verwijder de isopropanol en was eventuele sporen van de isopropanol met gedestilleerd water.
  6. Bereid de stapelgel volgens het recept in tabel 1.
    OPMERKING: Zodra TEMED is toegevoegd, zal de gel snel polymeriseren, dus voeg dit pas toe zodra u klaar bent om de gel te gieten.
  7. Giet de stapelgel bovenop de scheidingsgel.
  8. Voeg een kam toe aan de kamer om de putten te vormen en wacht tot de stapelgel volledig polymeriseert.
  9. Plaats 1 μL van 1 M DTT in een microcentrifugebuis voor elk fractiemonster dat op de gel moet worden uitgevoerd.
  10. Voeg ook 7 μL 4x laadbuffer toe aan elke buis.
  11. Voeg 20 μL monster van de fracties die op de gel moeten worden uitgevoerd toe aan elke microcentrifugebuis.
  12. Vortex de buizen met de monsters.
  13. Draai de monsterbuizen af met een tabletop microcentrifuge gedurende 3 s en zorg ervoor dat al het monster is teruggekeerd naar de bodem van de buizen.
  14. Bereid de gel-elektroforesecel voor door een gelcassette van 12% polyacrylamide op zijn plaats te zetten en de binnen- en buitenkamers van de cel te vullen met Tris-acetaat-EDTA (TAE) Buffer (tabel 1).
  15. Plaats de markering van het molecuulgewicht in de eerste rijstrook van de gel met het juiste volume dat vereist is door de instructies.
  16. Laad 28 μL van het monster van elke buis gemengd met DTT en laadbuffer.
  17. Plaats het deksel van de elektroforesecel op de doos en sluit het deksel aan op de voeding.
  18. Schakel de voeding in en stel deze in op 100 V en laat deze 20 minuten draaien.
  19. Verhoog na 20 minuten de voedingsstroom tot 140 V en blijf deze nog 30-40 minuten draaien of totdat de ladingsbufferkleurstof de bodem van de gelcassette bereikt.
  20. Na het voltooien van elektroforesevlek en het ontsmetten van de gel om de eiwitbanden in de gel te visualiseren.

5. Eiwitzuivering met DDM

OPMERKING: Het doel van het uitvoeren van dit zuiveringsproces is om te dienen als een controle voor de experimenten met behulp van de membraan actieve polymeren.

  1. Resuspend 6-10 g membraanpellet, vanaf stap 2.6, in DDM Buffer A (tabel 1) met 5 ml/g membraanpellet.
  2. Homogeniseer het geresuspendeerde monster met een glazen Dounce-homogenisator bij 4 °C of zorg ervoor dat u bij kamertemperatuur onmiddellijk daarna op het ijs zet.
  3. Breng het monster over naar een polypropyleenbuis van 50 ml en voeg DDM en extra DDM Buffer A toe om het monster tot een uiteindelijke concentratie van 2% DDM te brengen.
  4. Schud het monster gedurende 2 uur bij 4 °C.
  5. Plaats het monster in ultracentrifugebuizen en centrifugeer gedurende 1 uur bij 4 °C en 150.000 x g.
  6. Terwijl het monster ultracentrifugeert, begint u de 5 ml Ni-NTA-kolom voor te bereiden door te wassen met 25 ml DDM-buffer A (tabel 1).
  7. Nadat de ultracentrifugatie is voltooid, verzamelt u het supernatant en laadt u het op de 5 ml Ni-NTA-kolom bij 4 °C met een debiet van 0,5 ml/min met behulp van een spuitpomp.
  8. Was FPLC-lijnen met voldoende DDM Buffer B + 0,05% DDM(tabel 1)om het systeem volledig door te spoelen en bevestig vervolgens de kolom aan de FPLC-machine.
  9. Was de kolom met 30 ml DDM Buffer B + 0,05% DDM met een debiet van 1 ml/min en verzamel de stroom door.
  10. Was de kolom met 30 ml DDM Buffer C + 0,05% DDM (tabel 1) met een debiet van 1 ml/min en verzamel de stroom door.
  11. Eluteer het eiwit met 20 ml DDM Buffer D + 0,05% DDM (tabel 1) met een debiet van 0,5 ml/min en verzamel de stroom door met behulp van een fractiecollector en de fracties die elk worden ingesteld op 1,0 ml.
  12. Selecteer de breuken die de elutiepiek bevatten voor het poolen en concentreren met behulp van een centrifugaalconcentrator en centrifugeren bij 4.000 x g en 4 °C tot 500 μL.
  13. Met behulp van een lus van 500 μL laadt u het monster in de FPLC-machine en vervolgens op de uitsluitingskolom van 25 ml bij 4 °C. Elute met 30 ml DDM Buffer E + 0,05% DDM (tabel 1) met een debiet van 0,5 ml/min en verzamel als breuken met de fractiegroottes ingesteld op 0,5 ml per fractie.
  14. Neem de fracties en meet de eiwitconcentratie met behulp van 280 nm absorptie om de UV-Vis-curve uit de FPLC-elutiegrafiek te bevestigen.
  15. Verzamel 20 μL van elke monsterfractie die overeenkomt met pieken die in de FPLC-elutiegrafiek worden waargenomen en die met de absorptietest nauwkeurig zijn bevestigd.
  16. Vries de rest van die monsterfracties in met vloeibare stikstof of droogijs in de gewenste aliquots en bewaar eiwitmonsters bij -80 °C.
  17. Voer een SDS-PAGE gel elektroforesetest uit zoals eerder beschreven om de monsters te controleren die overeenkomen met pieken die zijn waargenomen in de FPLC-elutiegrafiek.

6. Negatieve vlek raster voorbereiding

  1. Plaats de roosters die voor de monstervoorbereiding zullen worden gebruikt op een glazen glijbaan gewikkeld in filterpapier met de koolstofkant naar boven gericht.
  2. Plaats de glazen schuif met de elektronenmicroscooproosters in de kamer van een gloeiontladingsregelaar tussen de twee elektroden en vervang het glazen deksel om ervoor te zorgen dat het gecentreerd en goed afgedicht is.
  3. Voer de gloeiontladingsmachine uit en zorg ervoor dat het paarse licht dat door het plasma wordt gegenereerd zichtbaar is.
  4. Wanneer de machine klaar is met draaien, wacht u tot de kamer atmosferische druk heeft bereikt om het glazen deksel te verwijderen en breng u de schuif met de roosters terug naar de bank waar monsters op worden geladen.
  5. Pas de concentratie van de gezuiverde eiwitmonsters aan tot ongeveer 0,1 mg/ml door het monster te verdunnen met de juiste buffer of te concentreren met behulp van een centrifugaalconcentrator.
  6. Laad 3,5 μL eiwitmonster op het 10 nm dikke koolstofraster en wacht 1 minuut.
  7. Verwijder de vloeistof met een filterpapier van het oppervlak van het EM-rooster.
  8. Was het roosteroppervlak 3x door 3 μL waterdruppels met het rooster op te pakken en het water uit het rooster te verwijderen met filterpapier ertussen om elke druppel op te pakken.
  9. Was het roosteroppervlak 2x door 3 μL druppeltjes vers, gefilterd 2% uraniumacetaat op te pakken en verwijder de wasoplossingen op het rooster met filterpapier ertussen om elke druppel op te pakken.
  10. Bevlek het rooster met een druppel verse, gefilterde 2% uraniumacetaat gedurende 1 minuut.
  11. Verwijder de uraniumacetaatoplossing op het oppervlak van het EM-rooster met filterpapier en droog het rooster minstens 1 minuut aan de lucht.
  12. Bewaar het raster in een rastervak voor later gebruik.

7. EM-beeldvorming

  1. Laad het voorbereide rooster op een veilige werkbank in de roosterhouder.
  2. Bereid de microscoop voor door de dewar-microscopen in een polystyreendoos te plaatsen en vul de dewar 3/4e vol vloeibare stikstof.
  3. Bevestig dat de rubberen afdekking van het microscoopvenster het bedekt en laad de dewar vervolgens op de microscoop door de koperen draden in de dewar te plaatsen totdat deze op het platform past.
  4. Vul de rest van de dewar met vloeibare stikstof en plaats een dop bovenop de dewar om deze te bedekken.
  5. Zet de hoge spanning aan, conditioneer de microscoop en wacht tot de microscoop opwarmt en een veilig vacuümniveau vaststelt voor gebruik.
  6. Zodra de microscoop klaar is, opent u de kolomklep en bevestigt u dat de straal aanwezig is door het rubberen deksel op het microscoopvenster te verwijderen.
  7. Controleer de beam stigmation door zich in en uit te spreiden door de intensiteit van de straal aan te passen. Als astigmatisme aanwezig is, zal de balk een elliptische vorm hebben als men weggaat van cross-over en de balk aan beide zijden dezelfde ovale vorm moet hebben.
  8. Stel de verrekijker van de microscoop in op de juiste hoogte en afstand volgens de ogen van de waarnemer.
  9. Controleer de bundelpositionering voor zoek-, focus-en belichtingsmodi door door alle drie de modi te fietsen totdat de balk in elk midden staat.
  10. Sluit de kolomklep en laad de roosterhouder in de elektronenmicroscoop.
  11. Stel de microscoop in op eucentrische hoogte met behulp van de wiebelfunctie van de microscopen en pas de beweging van het podium aan met behulp van de Z-as totdat er geen zijwaartse beweging van het monster in het midden is.
  12. Met behulp van de lage dosis Zoekmodus op de microscoop doorzoek het raster naar een wenselijk gebied van redelijk contrast met aanwezige monstermoleculen om zich op het monster te concentreren.
  13. Focus op het monster in de focusmodus met behulp van een hoge stapgrootte totdat het monster wordt gezien en verlaag vervolgens de stappen om het juiste scherpstelniveau te vinden.
  14. Nul en blank de straal en zorg er dan voor dat het rubberen kussentje het microscoopvenster bedekt.
  15. Neem met behulp van de belichtingsmodus het beeld van het gewenste rastergebied voor een belichting van 1 s bij een vergroting van 62.000x en controleer de verkregen afbeelding.
  16. Als u klaar bent met het in beeld brengen van een raster, sluit u de kolomkleppen en verwijdert u de roosterhouder uit de kolom.
  17. Wanneer klaar met het in beeld brengen van alle aandachtspunten sluit u de microscoop af door de gloeidraadvoeding uit te schakelen en de vloeibare stikstofdewar uit de microscoop te verwijderen.
  18. Plaats iets om vocht op te nemen op de standaard waar de dewar zat om condensatie van de koperspiralen van de microscoop op te vangen.
  19. Activeer de Cryo Cycle-modus en zorg ervoor dat de turbopomp is uitgeschakeld.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van de hier gepresenteerde procedures werden monsters van het wilde type E. coli AcrB en de E. coli mutant AcrB-P223G gezuiverd. De monsters werden vervolgens geadsorbeerd aan koolstofnegatieve vlekkenelektronenmicroscopieroosters en bevlekt met uranylacetaat met de zijvlekkenmethode22. Negatieve vlekkenbeelden werden verzameld met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie. Het negatieve vlekkenbeeld voor het met DDM gezuiverde acrB-wildmonster onthult een homogene ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eiwit-eiwit interacties zijn belangrijk voor de integriteit van de structuur en functie van membraaneiwitten. Er zijn veel benaderingen ontwikkeld om eiwit-eiwitinteracties te onderzoeken. In vergelijking met oplosbare eiwitten zijn membraaneiwitten en hun PPR's moeilijker te bestuderen vanwege de unieke intrinsieke eigenschappen van membraaneiwitten. Deze moeilijkheid komt voornamelijk voort uit de eis van membraaneiwitten om te worden ingebed in een inheemse lipide-bilayeromgeving voor structurele stabiliteit en functi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Y.G wordt vermeld als uitvinder van het membraan actieve polymeer NCMNP5-2 en NCMN systeem.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd ondersteund door het VCU startup fund (aan Y.G.) en het National Institute Of General Medical Sciences van de National Institutes of Health onder Award Number R01GM132329 (to Y.G.) De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health. We danken Montserrat Samso en Kevin McRoberts voor hun gulle steun voor video-opname.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Chemicals
30% Acrylamide/BIS SOL (37.5:1)Bio-Rad161-0158
4x Laemmli Sample Buffer (Loading Buffer)Bio-Rad1610747
Acetic Acid GlacialThermoFisher ScientificA38S-212
Ammonium Persulfate (APS)Bio-Rad161-0700
ChloramphenicolGoldbioC-105-5
Coomassie Brilliant Blue R-250 protein stain powderBio-Rad161-0400
DTT (Dithiothreitol) (> 99% pure) Protease freeGoldbioDTT10
GlycerolThermoFisher ScientificG33-4
HEPESThermoFisher ScientificBP310-1
ImidazoleAffymetrix17525 1 KG
IPTGGoldbioI2481C100
KanamycinGoldbioK-120-25
Magnesium chloride hexahydrateThermoFisher ScientificAA3622636
MethanolThermoFisher ScientificA412-4
N,N-dimethylethylenediamine (EDTA)Merck8.03779.0100
NCMNS-P5-2Not commercially available yetSubmit request for obtaining to corresponding author
Precision Plus Protein Dual Color StandardBio-Rad161-0374
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)Bio-Rad161-0301
SMA2000Cray ValleySubmit request for obtaining to corresponding author
Sodium ChlorideThermoFisher ScientificS271-10
TCEP-HClGoldbioTCEP25
TEMEDBio-Rad161-0800
Terrific Broth MediaAffymetrix75856 1 KG
Tris BaseBio-Rad161-0719
Uranyl AcetateAmbinterAmb22348393
Equipment
Avanti J-26S XPIBeckman CoulterB14538
Avanti JXN-30Beckman CoulterB34193
Carbon Electron Microscope Grids (10 nm)Electron Microscopy SciencesCF300-Cu-TH
Con-Torque Tissue HomogenizerEberbachE7265
Corning LSE Mini MicrocentrifugeThermoFisher Scientific07-203-954
EmulsiFlex-C3Avestin
Fraction Collector F9-RGE Healthcare Life Sciences29003875
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis CellBio-Rad165-8004
NanoDrop 2000 SpectrophotometerThermoFisher ScientificND-2000
Optima L-90K UltracentrifugeBeckman CoulterPN LL-IM-12AB
PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning SystemTed Pella91000S-230
Potter-Elvehjem Safe Grind Tissue GrinderWheaton358013
PowerPac Basic Power SupplyBio-Rad164-5050
Razel R99-E Variable Speed Syringe PumpRazel Scientific Instruments
Superdex 200 Increase 10/300 GLGE Healthcare Life Sciences28990944
Tecnai F20 200kVFEI
Type 70 Ti Fixed-Angle RotorBeckman Coulter
General Materials
1.5 ml Microcentrifuge TubesThermoFisher Scientific05-408-129
4 ml Amicon Ultra-4 30 kDaMillipore SigmaUFC803024
AKTA pure 25 L1 FPLCGE Healthcare Life Sciences29018225
BL21(DE3)pLysS CellsThermoFisher ScientificC606003
Falcon 50 ml Conical Centrifuge TubeThermoFisher Scientific14-959-49A
HisTrap HP 5 ml ColumnGE Healthcare Life Sciences17524802
pET-24aEMD Biosciences69749-3

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Berggard, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
  2. Huang, H., Bader, J. S. Precision and recall estimates for two-hybrid screens. Bioinformatics. 25 (3), 372-378 (2009).
  3. Serebriiskii, I. G., Golemis, E. A. Two-hybrid system and false positives. Approaches to detection and elimination. Methods in Molecular Biology. 177, 123-134 (2001).
  4. Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 8 (8), 645-654 (2007).
  5. Ngounou Wetie, A. G., et al. Investigation of stable and transient protein-protein interactions: Past, present, and future. Proteomics. 13 (3-4), 538-557 (2013).
  6. Schaufele, F. Maximizing the quantitative accuracy and reproducibility of Forster resonance energy transfer measurement for screening by high throughput widefield microscopy. Methods. 66 (2), 188-199 (2014).
  7. Berney, C., Danuser, G. FRET or no FRET: a quantitative comparison. Biophysical Journal. 84 (6), 3992-4010 (2003).
  8. Almen, M. S., Nordstrom, K. J., Fredriksson, R., Schioth, H. B. Mapping the human membrane proteome: a majority of the human membrane proteins can be classified according to function and evolutionary origin. BMC Biology. 7, 50(2009).
  9. Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there. Nature Reviews in Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).
  10. Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).
  11. Overduin, M., Esmaili, M. Memtein: The fundamental unit of membrane-protein structure and function. Chemistry and Physics of Lipids. 218, 73-84 (2019).
  12. Qiu, W., et al. Structure and activity of lipid bilayer within a membrane-protein transporter. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 115 (51), 12985-12990 (2018).
  13. Knowles, T. J., et al. Membrane proteins solubilized intact in lipid containing nanoparticles bounded by styrene maleic acid copolymer. Journal of the American Chemical Society. 131 (22), 7484-7485 (2009).
  14. Xue, M., Cheng, L., Faustino, I., Guo, W., Marrink, S. J. Molecular Mechanism of Lipid Nanodisk Formation by Styrene-Maleic Acid Copolymers. Biophysical Journal. 115 (3), 494-502 (2018).
  15. Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica and Biophysica Acta Biomembrames. 1860 (2), 378-383 (2018).
  16. Yu, L., Lu, W., Wei, Y. AcrB trimer stability and efflux activity, insight from mutagenesis studies. PLoS One. 6 (12), 28390(2011).
  17. Broussard, J. A., Rappaz, B., Webb, D. J., Brown, C. M. Fluorescence resonance energy transfer microscopy as demonstrated by measuring the activation of the serine/threonine kinase Akt. Nature Protocols. 8 (2), 265-281 (2013).
  18. Ma, L., Yang, F., Zheng, J. Application of fluorescence resonance energy transfer in protein studies. Journal of Molecular Structure. 1077, 87-100 (2014).
  19. Sachl, R., Humpolickova, J., Stefl, M., Johansson, L. B., Hof, M. Limitations of electronic energy transfer in the determination of lipid nanodomain sizes. Biophysical Journal. 101 (11), 60-62 (2011).
  20. Woehler, A., Wlodarczyk, J., Neher, E. Signal/noise analysis of FRET-based sensors. Biophysical Journal. 99 (7), 2344-2354 (2010).
  21. Wang, Z., et al. Comparison of in vitro and in vivo oligomeric states of a wild type and mutant trimeric inner membrane multidrug transporter. Biochemical and Biophysical Reports. 16, 122-129 (2018).
  22. Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems. Journal of Visualized Experiments. (132), e57199(2018).
  23. Lu, W., Zhong, M., Wei, Y. Folding of AcrB Subunit Precedes Trimerization. Journal of Molecular Biology. 411 (1), 264-274 (2011).
  24. Lebon, G. Structure and Function of GPCRs. , Springer International Publishing. 229-230 (2019).
  25. Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (90), e51087(2014).
  26. Lee, S. C., et al. A method for detergent-free isolation of membrane proteins in their local lipid environment. Nature Protocols. 11 (7), 1149-1162 (2016).
  27. Hall, S. C. L., et al. An acid-compatible co-polymer for the solubilization of membranes and proteins into lipid bilayer-containing nanoparticles. Nanoscale. 10 (22), 10609-10619 (2018).
  28. Oluwole, A. O., et al. Solubilization of Membrane Proteins into Functional Lipid-Bilayer Nanodiscs Using a Diisobutylene/Maleic Acid Copolymer. Angewandte Chemie International Edition England. 56 (7), 1919-1924 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Interacties van membraaneiwittenelektronenmicroscopische analysebepaling van de oligomere toestandmembraanactief polymeernikkel NTA chromatografienegatief gekleurde gridsgrootte uitsluitingschromatografieSDS PAGE analysecryo elektronenmicroscopie

Gerelateerde artikelen