Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Geleide differentiatie van rijpe nierpodocyten uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen onder chemisch gedefinieerde omstandigheden

4.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61299

⸱

2 juli 2020

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Duke University, 2Department of Medicine, Division of Nephrology, Duke University School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Hier wordt een chemisch gedefinieerd protocol gepresenteerd voor de afleiding van menselijke nierpodocyten uit geïnduceerde pluripotente stamcellen met een hoge efficiëntie (>90%) en onafhankelijk van genetische manipulaties of subpopulatieselectie. Dit protocol produceert het gewenste celtype binnen 26 dagen en kan nuttig zijn voor nefrotoxiciteitstests en ziektemodellering.

Samenvatting

Nierziekte treft meer dan 10% van de wereldbevolking en kost miljarden dollars aan federale uitgaven. De meest ernstige vormen van nierziekte en uiteindelijk eindstadium nierfalen worden vaak veroorzaakt door de schade aan de glomerulaire podocyten, de zeer gespecialiseerde epitheelcellen die samen met endotheelcellen en het glomerulaire keldermembraan functioneren om de filtratiebarrière van de nier te vormen. Vooruitgang in de niergeneeskunde is gehinderd door de beperkte beschikbaarheid van primaire weefsels en het gebrek aan robuuste methoden voor de afleiding van functionele menselijke niercellen, zoals podocyten. Het vermogen om podocyten af te leiden uit hernieuwbare bronnen, zoals stamcellen, kan helpen het huidige begrip van de mechanismen van menselijke nierontwikkeling en -ziekte te bevorderen, en nieuwe hulpmiddelen bieden voor therapeutische ontdekking. Het doel van dit protocol was om een methode te ontwikkelen om volwassen, post-mitotische podocyten af te leiden uit door de mens geïnduceerde pluripotente stam (hiPS) cellen met een hoge efficiëntie en specificiteit, en onder chemisch gedefinieerde omstandigheden. De van hiPS-cellen afgeleide podocyten die door deze methode worden geproduceerd, drukken afstammingsspecifieke markers uit (waaronder nefrine, podocine en Wilm's Tumor 1) en vertonen de gespecialiseerde morfologische kenmerken (inclusief primaire en secundaire voetprocessen) geassocieerd met volwassen en functionele podocyten. Intrigerend genoeg zijn deze gespecialiseerde kenmerken met name afwezig in de onsterfelijke podocytencellijn die veel in het veld wordt gebruikt, wat suggereert dat het hierin beschreven protocol menselijke nierpodocyten produceert die een ontwikkelingsrijp fenotype hebben dan de bestaande podocytcellijnen die meestal worden gebruikt om de menselijke nierbiologie te bestuderen.

Inleiding

Vooruitgang in menselijke pluripotente stamcelcultuur staat klaar om een revolutie teweeg te brengen in regeneratieve geneeskunde, ziektemodellering en medicijnscreening door onderzoekers een hernieuwbare, schaalbare bron van biologisch materiaal te bieden die kan worden ontworpen om bijna elk celtype in het menselijk lichaam te verkrijgen1. Deze strategie is vooral nuttig voor het afleiden van gespecialiseerde en functionele celtypen die anders moeilijk te verkrijgen zouden zijn. Door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPS)2,3,4,5 zijn bijzonder aantrekkelijk vanwege hun somatische celoorsprong en het potentieel dat ze vertegenwoordigen voor gepersonaliseerde geneeskunde. Het ontwikkelen van methoden om andere cellijningen af te leiden uit hiPS-cellen blijft echter een uitdaging vanwege het frequente gebruik van slecht gedefinieerde kweekomstandigheden die leiden tot een lage efficiëntie en niet-specifieke generatie van heterogene celpopulaties6,7.

Hier gepresenteerd is een methode voor de afleiding van volwassen nierpodocyten uit hiPS-cellen met specificiteit en hoge efficiëntie onder chemisch gedefinieerde omstandigheden. Door rekening te houden met de rol van meerdere factoren binnen de cellulaire micro-omgeving, werd een stamceldifferentiatiestrategie ontwikkeld die de optimalisatie van oplosbare factoren in het celkweekmedium omvatte, evenals onoplosbare factoren, zoals extracellulaire matrixcomponenten of kleefsubstraten. Gezien het belang van integrinesignalering in de ontwikkeling en functie van podocyten, werd de expressie van integrinereceptoren op het celoppervlak aanvankelijk onderzocht. β1-integrinen kwamen niet alleen sterk tot expressie in hiPS-cellen, maar ook in hun derivaten, waaronder mesoderm- en intermediaire mesodermcellen8,9,10. Latere experimenten bevestigden dat liganden die binden aan β1-integrinen (inclusief laminine 511 of laminine 511-E8-fragment) de hechting en differentiatie van hiPS-cellen in podocyten ondersteunen bij gebruik in combinatie met de oplosbare inductieve media die hieronder worden beschreven.

Inductie van cellijn commitment werd geïnitieerd door eerst te bevestigen dat hiPS-cellen gekweekt op de laminine-gecoate oppervlakken gedurende twee dagen in aanwezigheid van een medium met Activine A, CHIR99021 en Y27632 Rock-remmer kunnen differentiëren in cellen die de vroege mesodermmarkers HAND1, goosecoid en brachyury tot expressie brengen8,11. Behandeling van de mesodermcellen gedurende 14 dagen met een medium aangevuld met botmorfogenetisch eiwit 7 (BMP-7) en CHIR99021 maakte de afleiding mogelijk van intermediaire mesodermcellen die de nefron-voorlopercelmarkers Wilm's Tumor 1 (WT1), oneven overgeslagen gerelateerd eiwit 1 (OSR1)8,11en gepaard box gen 2-eiwit (PAX2)12tot expressie riepen. Om de rijpe nierglomerulaire podocyten af te leiden, werden de intermediaire mesodermcellen gedurende 4-5 dagen behandeld met een nieuw medium bestaande uit BMP-7, Activine A, vasculaire endotheelgroeifactor (VEGF), transtrans-retinoïnezuur en CHIR99021. Flowcytometrie en immunostaining werden gebruikt om te bevestigen dat >90% van de resulterende cellen de moleculaire, morfologische en functionele kenmerken van de volwassen nierpodocyt8,11,13vertoonden. Deze kenmerken omvatten de ontwikkeling van primaire en secundaire voetprocessen; de expressie van podocytenlijnspecifieke genen, waaronder SYNPO, PODXL, MAF, EFNB28 en de expressie van eiwitten waaronder podocine, nefrine en WT114,15,16. Bovendien bleek dat de van hiPS-cellen afgeleide podocyten tot vier weken in vitro in cultuur kunnen worden gehouden door een commercieel beschikbaar medium8,11 te gebruiken dat een extra flexibiliteit biedt in de timing van downstream-experimenten. Voor meer informatie over de flowcytometriepanelen die worden gebruikt voor het bepalen van de zuiverheid van de hiPS-podocyten, verwijzen wij u naar onze vorige publicatie11.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Bereiding van reagentia

  1. Verdun ontdooide 5x hiPS celkweek media (CCM) supplement in hiPS cel cultuur basaal medium om een 1x oplossing van hiPS CCM te verkrijgen.
    OPMERKING: Bevroren 5x hiPS CCM supplement vereist een langzaam ontdooiproces, idealiter in 4 °C voor een nacht. Aliquots van de 1x hiPS CCM kunnen tot 6 maanden bewaard worden bij -20 °C.
  2. Bereiding van keldermembraan (BM) matrix 1-gecoate platen voor hiPS-celkweek: Ontdooi BM matrix 1 's nachts op ijs bij 4 °C. Na ontdooiing bereidt u aliquots met geschikte verdunningsfactoren zoals voorgesteld door de fabrikant.
    OPMERKING: Doorgaans worden aliquots bereid voor daaropvolgende verdunning in 25 ml koude DMEM / F12 in een conische buis van 50 ml, gevolgd door grondig mengen om de BM-matrix 1 volledig op te lossen en de vorming van resterende kristallen te voorkomen.
  3. Breng 1 ml van de BM matrix 1-oplossing over in elke put van een plaat met 6 putten en incubeer bij 37 °C gedurende 1-2 uur of bij 4 °C gedurende ten minste 24 uur, gewikkeld in paraffinefolie. De BM matrix 1 -gecoate platen kunnen maximaal 2 weken bij 4 °C worden bewaard.
  4. Bereiding van keldermembraan (BM) matrix 2 - gecoate platen: Verdun de juiste hoeveelheden BM-matrix 2 in 9 ml steriel gedestilleerd water om een eindconcentratie van 5 μg / ml te bereiden. Voeg 700 μL van de BM matrix 2-oplossing toe aan elke put van een 12-putplaat en incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende 2 uur of 's nachts bij 4 °C.
  5. Bereid 100 μg/ml stamoplossingen elk van BMP7, Activine A en VEGF als volgt: reconstitueer BMP7 in steriel gedestilleerd water met 0,1% (wt/vol) BSA en reconstitueer Activine A en VEGF afzonderlijk in steriel PBS met 0,1% (wt/vol) BSA. Om frequente vries-dooicycli te voorkomen, bereidt u 100 μL aliquots uit elke stamoplossing en bewaart u deze gedurende maximaal 6 maanden bij -20 °C.
  6. Bereid een 10 mM stamoplossing van Y27632 door 10 mg Y27632 op te lossen in 3,079 ml steriel gedestilleerd water. Aliquot 100 μL uit de voorraad en bewaar bij -20 °C gedurende maximaal 6 maanden.
  7. Los 2 mg CHIR99021 op in 143,4 μL steriel DMSO om een 30 mM stamoplossing te bereiden. Bereid 5 μL aliquots en bewaar bij -20 °C gedurende maximaal 1 maand (of volgens de aanbeveling van de fabrikant).
  8. Los 10 mgtrans-trans retinoïnezuur op in 3,33 ml steriel DMSO. Bereid 500 μL aliquots en bewaar bij -20 °C gedurende maximaal 6 maanden.

2. Voorbereiding van cultuurmedia

  1. Bereid het mesodermdifferentiatiemedium door overeenkomstige stamoplossingen te reconstitueren tot een eindconcentratie van 100 ng / ml Activine A, 3 μM CHIR99021, 10 μM Y27632 en 1x B27 serumvrij supplement in een geschikt volume DMEM / 12 met glutaminesupplement.
    OPMERKING: Het mesodermdifferentiatiemedium moet vers worden bereid vóór differentiatiestappen en op een volume dat geschikt is voor de schaal van het experiment (doorgaans is 50 ml medium voldoende voor twee 12 putplaten).
  2. Bereid intermediair mesoderm differentiatiemedium voor door overeenkomstige stamoplossingen te reconstitueren tot een eindconcentratie van 100 ng / ml BMP7, 3 μM CHIR99021 en 1x B27 serumvrij supplement in DMEM / F12 met een glutaminesupplement.
    OPMERKING: Indien nodig kan het medium worden aangevuld met 1% (vol / vol) Penicilline-Streptomycine. Pas het volume van het medium aan met DMEM / F12 met glutaminesupplement. Dit medium kan in grote partijen worden bereid; het wordt echter aanbevolen om te bewaren in kleinere aliquots (bijv. 45 ml in conische buizen van 50 ml) om herhaalde vries-dooicycli te voorkomen. Dit medium kan tot 3 maanden bij -20 °C worden bewaard en kan voor gebruik een nacht bij 4 °C worden ontdooid.
  3. Bereid het podocyteninductiemedium door reconstitutie tot een eindconcentratie van 100 ng / ml BMP7, 100 ng / ml activine A, 50 ng / ml VEGF, 3 μM CHIR99021, 1x B27 serumvrij supplement en 0,1 μM all-trans retinoïnezuur in DMEM / F12 met glutaminesupplement. Bescherm het medium tegen licht (bijv. door de verpakking in te pakken met foliepapier).
    OPMERKING: Dit medium kan in grote hoeveelheden worden bereid en in het donker bij -20 °C gedurende maximaal 3 maanden worden bewaard. Bevroren aliquots moeten vóór gebruik een nacht bij 4 °C worden ontdooid.
  4. Bereid 25 ml trypsineneutraliserende oplossing door toevoeging van 10% (vol/vol) warmte-geïnactiveerde FBS in DMEM/F12 en filter onder steriele omstandigheden.
  5. Voor postdifferentiatieonderhoud van de van stamcellen afgeleide podocyten, bereidt u Complete Medium met podocytenonderhoudsmedia door het supplement toe te voegen aan het basale medium volgens de richtlijnen van de fabrikant en bewaart u het bij 4 °C gedurende maximaal twee weken.

3. Feeder-vrije hiPS-celcultuur met behulp van hiPS-celkweekmedium

  1. Adem de restoplossing van BM matrix 1 uit de voorgecoate platen en was de putten 3 keer met 1 tot 2 ml verwarmd DMEM/F12.
  2. Aspiraat besteed hiPS CCM uit de hiPS-cellen en spoel de cellen 3 keer met opgewarmde DMEM / F12. Voeg 1 ml loslatingsoplossing voor warme cellen toe en incubeer gedurende 1 minuut bij 37 °C om de cellen te helpen dissociëren. Voer visuele inspectie van cellen uit onder een weefselkweekmicroscoop en zorg ervoor dat de randen van de celkolonies afgerond lijken, en adem vervolgens snel de celonthechtingsoplossing uit de cellen (zorg ervoor dat de celkolonies nog steeds aan de plaat vastzitten, zij het losjes). Spoel de cellen eenmaal voorzichtig met DMEM/F12 om de celdetachementoplossing te verwijderen.
  3. Voeg 3 ml hiPS CCM toe aan de hiPS-cellen (in elke put van een 6-putplaat) die zijn behandeld met de celdetachementoplossing. Schraap kolonies met behulp van een cellifter en pipetteer voorzichtig celsuspensie op en neer om de losjes gehechte cellen los te maken. Was de plaat grondig om ervoor te zorgen dat alle cellen worden geoogst.
    OPMERKING: Het gebruik van een pipet van 5 ml wordt aanbevolen om overmatige afschschuif op de cellen te voorkomen.
  4. Breng 0,5 ml van de celsuspensie over in elke put van een nieuwe BM-matrix 1-gecoate 6-putplaat met 2 ml hiPS CCM per put. Beweeg de plaat in figuur acht om celkolonies in putten te verdelen en incubateer bij 37 °C in een 5 % CO2-incubator. Ververs het medium dagelijks totdat de cellen klaar zijn om te worden doorgenomen of gebruikt voor het differentiatie-experiment (ongeveer 70 % confluentie).
    OPMERKING: De ideale koloniegrootte voor routinematige passaging van iPSC's ligt tussen 200-500 μm onder feedervrije omstandigheden met hiPS CCM (zonder ROCK-remmer). Als cellen tijdens de behandeling worden geïndividualiseerd met dissociatie-enzymen of buffers, kan de hiPS CCM worden aangevuld met ROCK-remmer (bijv. 10 μM Y27632) om de levensvatbaarheid van de cel te verbeteren.

4. Differentiatie van hiPS-cellen in mesodermcellen (dag 0-2)

  1. Terwijl de hiPS-celculturen zich in de exponentiële groeifase bevinden (ongeveer binnen 4 dagen na het verstrijken van de cultuur en ongeveer 70% confluentie), visueel inspecteren op de aanwezigheid van spontaan gedifferentieerde cellen in en rond de randen van de kolonies. Indien nodig, aseptisch afschrapen van differentiatiegebieden.
  2. Aspirateer hiPS CCM uit hiPS cellen en spoel de cellen 3 keer met warme DMEM/F12. Incubeer de cellen met 1 ml enzymvrije celdissociatiebuffer gedurende 10 minuten bij 37 °C en controleer op de dissociatie onder een microscoop. Vanwege inherente verschillen tussen verschillende hiPS-cellijnen moet de werkelijke incubatietijd voor de celdissociatiebuffer voor een bepaalde cellijn worden bepaald.
  3. Schraap de put voorzichtig met een cellifter om losjes gehechte cellen losjes los te maken en breng de celsuspensie over naar een conische buis van 15 ml, gevolgd door meerdere keren op en neer te pipetteren om de hiPS-cellen te individualiseren.
    1. Breng de celsuspensie op het volume van 15 ml met warme DMEM/F12 en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 290 x g bij kamertemperatuur.
    2. Adem het supernatant voorzichtig op en resuspend de cellen met warme DMEM /F12 voor nog een ronde van centrifugatie om resterende BM-matrix 1 en dissociatiebuffercomponenten te verwijderen.
  4. Aspirateer de supernatant- en resuspendcellen in 1 ml mesoderm-inductiemedium zoals hierboven beschreven. Tel het totale aantal cellen met behulp van een hemocytometer of coulterteller om het juiste volume mesodermdifferentiatiemedium te bepalen dat nodig is om een concentratie van 1 x 105 cellen / ml te bereiken.
  5. Aspirateer ECM-oplossing uit de BM matrix 2-gecoate platen en spoel de platen tweemaal met warme DMEM/F12. Meng de hiPS-celsuspensie voorzichtig door een paar keer te pipetteren. Breng 1 ml van de celsuspensie over naar elke put van de BM matrix 2-gecoate 12-well platen en schud vervolgens voorzichtig de platen om de cellen gelijkmatiger te verdelen.
  6. Incubeer de plaat bij 37 °C in een 5% CO2 incubator. Ververs het mesoderm inductiemedium de volgende dag.
    OPMERKING: Na 2 dagen zouden hiPS-cel-afgeleide mesodermcellen klaar zijn voor intermediaire mesoderm-inductie.

5. Differentiatie van hiPS-cel-afgeleide mesodermcellen in intermediair mesoderm (dag 2-16)

  1. Op dag 2 van het differentiatieprotocol, aspirate mesoderm inductie medium en vul aan met 1 ml per put intermediair mesoderm inductie medium.
  2. Ververs het medium elke dag om een nauwkeurige drempel van groeifactoren en kleine moleculen voor de metabolisch actieve cellen te behouden. Als er sprake is van aanzienlijke celgroei en snelle uitputting van medianutriënten (aangegeven door de vergeling van de media), kan het volume van het intermediaire mesodermdifferentiatiemedium worden verhoogd tot 1,3 ml per put van de 12 putplaten.
  3. Kweekcellen gedurende nog eens 14 dagen om intermediaire mesodermcellen te verkrijgen. Op dag 16 kunnen deze cellen worden gecryopreserveerd voor later gebruik.

6. Differentiatie van hiPS-cel-afgeleide intermediaire mesodermcellen in podocyten (dag 16 tot 21)

  1. Spoel de tussenliggende mesodermcellen met warme DMEM/F12 gevolgd door incubatie van de cellen met 0,5 ml per put van 0,05 % trypsine-EDTA gedurende 3 minuten bij 37 °C. Voer visuele inspectie uit om ervoor te zorgen dat de cellen beginnen te dissociëren.
  2. Schraap cellen met behulp van een cellifter en pipetteer de celsuspensie meerdere keren met behulp van een pipetpunt van 1.000 μL om geïndividualiseerde (of kleine klonten) cellen te verkrijgen.
    OPMERKING: Zorg er in dit stadium voor dat de cellen volledig zijn gedissocieerd, omdat geaggregeerde cellen mogelijk geen terminaal gedifferentieerd fenotype verkrijgen binnen de tijdlijn van het protocol.
  3. Voeg ongeveer 2 ml per put trypsine-neutraliserende oplossing toe om de activiteit van trypsine te stoppen.
  4. Breng cellen over naar een conische buis van 50 ml en breng het volume tot 50 ml met DMEM / F12 en centrifugeer de celsuspensie vervolgens gedurende 5 minuten bij 201 x g bij kamertemperatuur.
  5. Aspirateer de supernatant- en resuspendcellen in het podocyteninductiemedium. Zorg voor een optimaal resultaat voor een uiteindelijke zaaidichtheid van ongeveer 100.000 cellen/put van een 12 putplaat. Voeg de celsuspensie toe aan de BM matrix 2-gecoate platen en schud de plaat voorzichtig om de cellen gelijkmatiger te verdelen.
  6. Incubeer cellen bij 37 °C en 5% CO2 en ververs het medium dagelijks gedurende maximaal 5 dagen om podocyten te verkrijgen op dag 21.
    OPMERKING: De resulterende van hiPS-cellen afgeleide podocyten kunnen gedurende 2-4 extra weken in cultuur worden gehouden door gebruik te maken van een volledig medium met podocytenonderhoudsmedia. Eenmaal in de onderhoudsmedia van podocyten kunnen de cellen om de dag worden gevoed en kunnen ze worden gebruikt voor latere onderzoeken of downstream-analyses.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het doel van dit protocol was om aan te tonen dat volwassen menselijke podocyten kunnen worden afgeleid van hiPS-cellen onder chemisch gedefinieerde omstandigheden. De gegevens die in dit manuscript worden gepresenteerd, werden gegenereerd met behulp van de DU11 hiPS-cellijn17, die eerst werden getest op en vrij bleken te zijn van mycoplasma. Chromosomale analyse werd ook uitgevoerd en de cellen bleken karyotypisch normaal te zijn. Beginnend met de ongedifferentieerde DU11 hiPS-cellen, werd de dif...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In dit rapport beschrijven we een protocol voor het genereren van nierglomerulaire podocyten uit hiPS-cellen. De van hiPS-cellen afgeleide podocyten vertonen morfologische en moleculaire kenmerken geassocieerd met het volwassen nierpodocytenfenotype13. In eerdere publicaties toonden we aan dat de van hiPS-cellen afgeleide podocyten de structuur en selectieve filtratiefunctie van de nierglomerulus kunnen nabootsen wanneer ze worden gekweekt met glomerulaire microvasculaire endotheelcellen in een pe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

S.M. is auteur van een patent dat is aangevraagd voor methoden voor het genereren van nierpodocyten uit pluripotente stamcellen (Amerikaanse octrooiaanvraag 14/950859). De overige auteurs verklaren dat ze geen tegenstrijdige belangen hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de Pratt School of Engineering aan de Duke University, de afdeling Nefrologie aan de Duke Medical School, A Chair's Research Award van de afdeling Geneeskunde aan de Duke University en een Burroughs Wellcome Fund PDEP Career Transition Ad Hoc Award aan S.M.. M.B werd ondersteund door het Graduate Research Fellowship Program van de National Science Foundation. We bedanken het Bursac Lab voor het genereus verstrekken van de DU11-stamcellijn en het Varghese Lab aan de Duke University voor het tijdelijk delen van hun weefselkweekfaciliteit met onze groep. Deze publicatie is opgedragen aan Prof. Laura L. Kiessling, Novartis Professor of Chemistry aan het Massachusetts Institute of Technology, ter ere van haar 60e verjaardag.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Cellen
DU11 humane iPS-cellenDe DU11(Duke University clone #11) iPS-cellijn werd gegenereerd bij de Duke University iPSC Core Facility en aan ons verstrekt door het Bursac Lab bij Duke University. Deze lijn is getest op mycoplasma en werd voor het laatst gekaryotypeerd in juli 2019 door ons lab, en werd karyotypisch normaal bevonden.
Groeifactoren en Mediasupplementen
All-trans retinoïnezuur (500 mg)72262Stem Cell Technologies
B27 serumvrij supplement17504044Thermo/Life Technologies
CHIR9902104-0004StemgentKan lot-tot-lot variatie vertonen
Complete Medium Kit met CultureBoost-R4Z0-500-RCell SystemsPodocyte-onderhoudsmedia
DMEM/F1212634028Thermo/Life Technologies
DMEM/F12 met GlutaMAX supplement10565042Thermo/Life TechnologiesDMEM/F12 met glutamine supplement
Heat-inactivated FBS10082147Thermo/Life Technologies
Human activin APHC9564Thermo/Life Technologies
Human BMP7PHC9544Thermo/Life Technologies
Human VEGFPHC9394Thermo/Life Technologies
mTeSR1 medium05850Stem Cell TechnologieshiPS-celcultuurmedia (CCM)
Penicilline–streptomycine, vloeibaar (100×)15140-163Thermo/Life Technologies
Y27632 ROCK-remmer1254Tocris
Antilichamen
Alexa Fluor 488– en Alexa Fluor 594–geconjugeerde secundaire antilichamenA32744; A32754; A-11076; A32790Thermo/Life Technologies
Brachyury(T)ab20680Abcam
NephrinGP-N2Progen
OCT4AF1759R&D Systems
PAX271-6000Invitrogen
WT1MAB4234Millipore
ECM-moleculen
iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragmentN-892012Iwai North AmericaBasale membraan (BM) matrix 2
Matrigel hESC-gekwalificeerde matrix, 5-mL vial354277BD BiosciencesBasale membraan (BM) matrix 1. Kan lot-tot-lot variatie vertonen
Enzymen en andere reagentia
AccutaseA1110501Thermo/Life TechnologiesCeldetacheringsoplossing
BSAA9418Sigma-Aldrich
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)D2438Sigma-AldrichDMSO is giftig. Moet in een chemische veiligheidskast worden behandeld
Enzym-vrije celdissociatiebuffer, Hank’s gebalanceerde zout13150016Thermo/Life Technologies
Ethanoloplossing, 70% (vol/vol), biotechnologiekwaliteit97065-058VWREthanol is ontvlambaar en giftig
FBS431097Corning
Paraformaldehyde (PFA)28906Thermo/Life TechnologiesPFA moet worden behandeld in een chemische afzuigkap met de juiste persoonlijke beschermingsuitrusting, inclusief handschoenen, laboratoriumjas en veiligheidsbril. Vermijd inademing en contact met de huid.
Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)14190-250Thermo/Life Technologies
Steriel Gedistilleerd Water15230162Thermo/Life Technologies
Triton X-10097062-208VWR
Trypsine-EDTA, 0,05%25300-120Thermo/Life Technologies
Apparatuur
Aspirerende pipetten, individueel verpakt29442-462Corning
Avanti J-15R CentrifugeB99516Beckman Coulter
Conische centrifugeerbuis, 15 mL352097Corning
Conische centrifugeerbuis, 50 mL352098Corning
Cryoboxen3395465Thermo/Life TechnologiesVoor het opslaan van bevroren aliquots
EVOS M7000AMF7000Thermo/Life TechnologiesFluorescentiemicroscoop gebruikt om beelden te verkrijgen van gefixeerde en gekleurde iPS-cellen en hun derivaten
Hemocytometers100503-092VWR
Heracell VIOS 160i CO2-incubator51030403Thermo/Life TechnologiesVoor de routinematige cultuur en onderhoud van iPS-cellen en hun derivaten
Omgekeerde Zeiss Axio Observer uitgerust met AxioCam 503 camera491916-0001-000(microscoop) ; 426558-0000-000(camera)Carl Zeiss MicroscopyGebruikt om fasecontrastbeelden te verkrijgen van levende iPS-cellen en hun derivaten in elk stadium van podocytdifferentiatie
Kimberly-Clark nitrilhandschoenen40101-346VWR
Kimwipes, groot21905-049VWR
Kimwipes, klein21905-026VWR
P10 precisiebarrière pipettentipsP1096-FRDenville Scientific
P100 barrière pipettentipsP1125Denville Scientific
P1000 barrière pipettentipsP1126Denville Scientific
P20 barrière pipettentipsP1121Denville

Referenties

  1. Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in Pluripotent Stem Cells: History, Mechanisms, Technologies, and Applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16, 3-32 (2020).
  2. Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282, 1145(1998).
  4. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  6. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526, 564-568 (2015).
  7. Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33, 1193-1200 (2015).
  8. Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip. Nature Protocols. 13, 1662-1685 (2018).
  9. Pozzi, A., et al. Beta1 integrin expression by podocytes is required to maintain glomerular structural integrity. Developmental Biology. 316, 288-301 (2008).
  10. Kanasaki, K., et al. Integrin beta1-mediated matrix assembly and signaling are critical for the normal development and function of the kidney glomerulus. Developmental Biology. 313, 584-593 (2008).
  11. Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1, 0069(2017).
  12. Torban, E., et al. PAX2 Activates WNT4 Expression during Mammalian Kidney Development. Journal of Biological Chemistry. 281, 12705-12712 (2006).
  13. Reiser, J., Sever, S. Podocyte biology and pathogenesis of kidney disease. Annual Review of Medicine. 64, 357-366 (2013).
  14. Kuusniemi, A. M., et al. Tissue Expression of Nephrin in Human and Pig. Pediatric Research. 55, 774-781 (2004).
  15. Guo, J. K., et al. WT1 is a key regulator of podocyte function: reduced expression levels cause crescentic glomerulonephritis and mesangial sclerosis. Human Molecular Genetics. 11, 651-659 (2002).
  16. Roselli, S., et al. Podocin localizes in the kidney to the slit diaphragm area. American Journal of Pathology. 160, 131-139 (2002).
  17. Shadrin, I. Y., et al. Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues. Nature Communications. 8, 1825(2017).
  18. Satoh, D., et al. aPKCλ maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface. The Journal of Biochemistry. 156, 115-128 (2014).
  19. Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367(2013).
  20. Reya, T., Clevers, H. Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature. 434, 843-850 (2005).
  21. Clevers, H., Nusse, R. Wntβ-Catenin Signaling and Disease. Cell. 149, 1192-1205 (2012).
  22. Ciampi, O., et al. Generation of functional podocytes from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 17, 130-139 (2016).
  23. Fuente Mora, C., et al. Differentiation of Podocyte and Proximal Tubule-Like Cells from a Mouse Kidney-Derived Stem Cell Line. Stem Cells and Development. 21, 296-307 (2011).
  24. Chuah, J. K. C., Zink, D. Stem cell-derived kidney cells and organoids: Recent breakthroughs and emerging applications. Biotechnology Advances. 35, 150-167 (2017).
  25. Becker, G. J., Hewitson, T. D. Animal models of chronic kidney disease: useful but not perfect. Nephrology Dialysis Transplantation. 28, 2432-2438 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Humane iPS cellenPodocyten differentiatieMesoderm inductieintermediair mesodermbasaalmembraanmatrixnefrine expressiepodocine expressieWT1 markervoetuitlopers
Geleide differentiatie van rijpe nierpodocyten uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen onder chemisch gedefinieerde omstandigheden
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.