Automatisering van bio-atoomkrachtmicroscoopmetingen op honderden C. albicans-cellen

Samenvatting

Dit protocol heeft als doel afm-metingen op honderden microbiële cellen te automatiseren. Eerst worden microben geïmmobiliseerd in PDMS-stempelmicrostructuren en vervolgens worden krachtspectroscopiemetingen automatisch uitgevoerd op honderden geïmmobiliseerde cellen.

Samenvatting

De in dit artikel gepresenteerde methode is gericht op het automatiseren van Bio-AFM experimenten en het registreren van krachtcurves. Met deze methode is het mogelijk om krachtencurven op 1000 cellen automatisch in 4 uur vast te leggen. Om een analysetijd van 4 uur te behouden, wordt het aantal krachtcurven per cel teruggebracht tot 9 of 16. De methode combineert een op Jython gebaseerd programma en een strategie voor het assembleren van cellen op gedefinieerde patronen. Het programma, geïmplementeerd op een commerciële Bio-AFM, kan de tip centreren op de eerste cel van de array en vervolgens automatisch van cel naar cel bewegen terwijl krachtcurves op elke cel worden opgenomen. Met behulp van deze methodologie is het mogelijk om toegang te krijgen tot de biofysische parameters van de cellen, zoals hun stijfheid, hun kleefeigenschappen, enz. Met de automatisering en het grote aantal geanalyseerde cellen heeft men toegang tot het gedrag van de celpopulatie. Dit is een doorbraak op het gebied van Bio-AFM, waar tot nu toe slechts enkele tientallen cellen gegevens zijn geregistreerd.

Inleiding

Dit werk biedt een methodiek om met behulp van een atoomkrachtmicroscoop (AFM) automatische krachtmetingen uit te voeren op honderden levende cellen. Het biedt ook een methode om microben te immobiliseren op een PDMS-microgestructureerde stempel die compatibel is met AFM-experimenten die in een vloeibare omgeving worden uitgevoerd.

Bio-AFM is een zeer gespecialiseerde technologie die is ontworpen voor toepassingen in de biologie en vervolgens wordt gebruikt om levende cellen te bestuderen. Het vereist een getrainde ingenieur die één cel tegelijk kan analyseren. In deze omstandigheden is het aantal verschillende cellen dat kan worden geanalyseerd vrij klein, typisch 5 tot 10 cellen in 4-5 uur. De hoeveelheid krachtmetingen die op een enkele cel zijn geregistreerd, is echter meestal erg hoog en kan gemakkelijk 1000 bereiken. Het huidige paradigma van AFM-krachtmetingen op levende cellen is dus het registreren van honderden krachtcurven (FCs) maar op een beperkt aantal cellen.

Statistisch gezien is deze benadering twijfelachtig en roept de kwestie van de representativiteit van de steekproef op. Het is bijvoorbeeld moeilijk om de heterogeniteit van een celpopulatie te evalueren door slechts een paar cellen te meten, zelfs als er honderden metingen op deze paar cellen worden geregistreerd. Het is echter op basis van dit paradigma dat er grote vooruitgang is geboekt op het gebied van biofysica, microbiologie en nanogeneeskunde^1,2,3. Inderdaad, nanometeranalyse op de schaal van enkele cellen heeft nieuwe informatie opgeleverd over cellulaire nanomechanica, over de organisatie van transmembrane-eiwitten of het werkingsmechanisme van antimicrobiële of antikankergeneesmiddelen^4,5,6,7. Onlangs zijn echter verschillende biomechanische tests met hoge doorvoer op cellen naar voren gekomen⁸, waaruit blijkt dat de wetenschappelijke gemeenschap geïnteresseerd is in het veranderen van dit paradigma en toegang tot de heterogeniteit van de celpopulatie. Deze tests zijn allemaal gebaseerd op microfluïdische systemen om cellen te vervormen en optisch hun vervorming onder spanning te meten om een indirecte meting van hun totale oppervlakteelasticiteit te verkrijgen⁸. Een belangrijk probleem met deze methoden is echter dat ze monoparametrisch zijn: alleen celelasticiteit kan worden onderzocht. Bovendien staan ze het meten van de mechanische parameters van aanhangende cellen niet toe, wat beperkend kan zijn voor de studies van niet-circulerende zoogdiercellen of biofilms bijvoorbeeld.

Door de teams van S. Scheuring⁹ en M. Favre¹⁰zijn benaderingen met afm ontwikkeld. Scheuring et al. geïmmobiliseerde cellen op fibronectinepatronen⁹, waardoor individuele cellen de vorm van het patroon moesten aannemen⁹. Vervolgens bracht dit team de mechanische eigenschappen van een paar cellen in kaart om gemiddelde gegevens te definiëren, representatief voor 14 tot 18 cellen. De door Farve c.s. uitgevoerde ontwikkeling was gericht op het multiplexen van de metingen door parallel te lopen met de AFM-vrijdragende¹⁰. Voor zover wij weten heeft dit werk in de multiplexing richting niet geleid tot metingen op levende cellen.

Een interessante aanpak voorgesteld door het team van Dujardin presenteert een geautomatiseerde AFM die cellen kan identificeren en in beeld kan brengen aan de onderkant van op maat gemaakte putten. Hoewel deze methode geen analyse van een grote populatie cellen mogelijk maakt, maakt het het mogelijk om automatisch verschillende omstandigheden in elke put te testen¹¹.

Ons doel in dit werk is ambitieuzer, omdat we ten minste 1000 cellen wilden meten om toegang te krijgen tot geen gemiddelde cel, maar integendeel de heterogeniteit tussen cellen. De strategie die we hier hebben ontwikkeld om toegang te krijgen tot celpopulatie heterogeniteit met behulp van AFM is gebaseerd op de analyse van honderden cellen waarop een beperkt aantal krachtcurves wordt geregistreerd. In vergelijking met de "klassieke" benadering van het registreren van een groot aantal krachtcurven op een beperkt aantal cellen, moet deze benadering als complementair worden beschouwd, aangezien deze niet dezelfde informatie verschaft. Inderdaad, hoewel de typische methode het mogelijk maakt om individuele celoppervlak heterogeniteit te onderzoeken, met behulp van onze aanpak, zijn we in staat om toegang te krijgen tot de volledige celpopulatie heterogeniteit. Om dit doel te bereiken, hebben we een methode gecombineerd die microben (hier de gistsoort Candida albicans) direct immobiliseert in de putten van een PDMS microgestructureerde stempel¹², en ontwikkelt een origineel programma voor het automatisch verplaatsen van de AFM-tip van cel naar cel¹³ en het meten van de mechanische eigenschappen van elke cel.

Protocol

1. Microbiële celkweek

1. Cellen uit een glycerolvoorraad revivificeren.
   OPMERKING: C. albicans worden bij -80 °C opgeslagen in glycerolvoorraden, op knikkers.
   1. Pluk een marmer in de bouillon van -80 °C en wrijf het op gist pepton dextrose (YPD) agar. Kweek de cellen gedurende 2 dagen bij 30 °C, vóór vloeibare teelt.
2. Bereid vloeibare culturen voor.
   1. Vul een kweekbuis met 5 ml steriele YPD-bouillon en voeg een enkele kolonie C. albicans-cellen toe, gekweekt op de YPD-agarplaat.
   2. Kweek de kweek in statische omstandigheden gedurende 20 uur op 30 °C voordat u ze oogst met centrifugeren (4000 x g, 5 min). Gooi het supernatant weg en elimineer het als biogevaarlijk afval.
   3. Was de pellets 2x met 10 ml acetaatbuffer (8 mM natriumacetaat, 1 mM CaCl_2,1 mM MnCl₂, pH 5,2). Centrifugeer (4000 x g, 5 min) tussen het wassen door.
   4. Resuspendeer de pellet in 2 ml acetaatbuffer en gebruik deze oplossing voor celimmobilisatie op de PDMS-stempel.
      OPMERKING: Deze suspensie kan niet worden opgeslagen en moet vers worden bereid voor sectie 3.

2. PDMS-stempelvoorbereiding

1. Silicium master schimmel voorbereiding
   1. Teken de gewenste microstructuren met behulp van CAD-software (Computer Assisted Design).
      OPMERKING: De ontworpen putten moeten even groot zijn als de microbe om te vangen. Het ontwerp moet een grote matrix van putten 100 x 100 op lijst bieden. Het is het beste om verschillende arrays te maken met enigszins verschillende maten rond de gemiddelde grootte van de microbe.
   2. Als er een schone kamer beschikbaar is, volgt u de stappen 2 tot en met 12 van het eerder gepubliceerde protocol¹². Anders kan silicium master schimmel worden verkregen van commerciële cleanroom faciliteiten.
2. PDMS stempellijsten
   1. Bereid 55 g PDMS-prepolymeeroplossing met een mengsel van 10 tot 1, massaverhouding, PDMS-oligomeren en uithardingsmiddel (Tabel van materialen).
   2. Meng en ontgas deze oplossing onder vacuüm (in het bereik van 10^-1-10^-2 bar) totdat alle gevangen bellen uit de PDMS-oplossing zijn verwijderd (5−10 min).
   3. Giet 20 g van de ontgaste oplossing opnieuw op de siliconen mastervorm en ontgassing (in het bereik van 10^-1-10^-2 bar).
      OPMERKING: De stempeldikte moet ongeveer 2−3 mm zijn.
   4. Wanneer alle bellen zijn verwijderd, moet u het PDMS gedurende 1 uur op 80 °C aansnonderen.
   5. Snijd de PDMS microgestructureerde stempel met een scalpel (0,5 x 1,5 cm²) in een richting parallel aan de zichtbare microstructuurarrays.
   6. Schil de stempel van de siliconen master schimmel.
   7. Breng de stempel terug om de microstructuren aan de bovenkant tentoon te stellen en deponeer deze op een glazen glijbaan. Zorg ervoor dat de microstructuren naar boven gericht zijn, weg van de glazen glijbaan. Lijn de microstructuren die op de stempel te zien zijn uit met de zijkant van de glazen glijbaan, die later als referentie zal dienen voor de automatiseringsprocedure van de AFM.
      OPMERKING: In dit stadium is de PDMS-stempel klaar voor celimmobilisatie. De PDMS-stempels kunnen enkele maanden op de siliconen mastervorm worden bewaard. Wanneer alle PDMS uit de master mal wordt verwijderd, kan een nieuwe PDMS stempel opnieuw op de master mold worden gegoten (om de master mold veilig te houden, is het mogelijk om deze te repliceren in polyurethaan)¹⁴.

3. Monstervoorbereiding

1. Celimmobilisatie
   1. Centrifugeer (500 x g, 5 min) 600 μL van de geresuspendeerde celoplossing om de buffer van de cellen te scheiden.
   2. Pipet 200 μL van het supernatant vanaf stap 3.1.1 op de PDMS-stempel en ontgas onder vacuüm (in het bereik van 10^-1-10^-2 bar) gedurende ongeveer 40 minuten.
      OPMERKING: Deze stap is belangrijk om de celimmobilisatie in de putten te verbeteren. Moleculen uit de gistcelwand, aanwezig in het supernatant, worden waarschijnlijk afgezet op het PDMS-oppervlak tijdens deze pre-bevochtigingsstap. Deze moleculen verbeteren hoogstwaarschijnlijk de hechting van de cellen en dragen bij aan de toename van de vulsnelheid van de stempel.
   3. Verwijder na 40 minuten, met een pipet, de buffer van het PDMS-oppervlak en deponeer met een pipet 200 μL van de celoplossing vanaf stap 1.2.4 gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
   4. Plaats de cellen in de microstructuren van de stempel door convectieve/capillaire assemblage. Verdeel daarvoor handmatig 200 μL celsuspensie over de stempel met behulp van een glazen schuif in beide richtingen met een hoek tussen 30 en 50°. Het kan nodig zijn om de glazen schuif meerdere keren op de stempel door te geven om een hoge vulsnelheid te bereiken.
      OPMERKING: Een volledige beschrijving van deze methode is beschikbaar¹³.
   5. Verwijder de celsuspensie met een pipet. Was de stempel 3x met 1 ml acetaatbuffer, pH 5,2 om de cellen te verwijderen die niet vastzaten.
   6. Droog de achterkant van de stempel met behulp van stikstofstroom, om ervoor te zorgen dat de stempel zich aan de droge petrischaal hecht.
   7. Deponeer ten slotte de PDMS-stempel gevuld met cellen in een petrischaal (tabel met materialen) en vul deze met 2 ml acetaatbuffer om de cellen in vloeibaar medium te houden.
2. De stempel drukken op het AFM-podium
   1. Centreer het podium om 0:0 bij het starten van AFM-operaties.
   2. Kalibreer de gevoeligheid en veerconstante van de cantilever op glas en in water zoals beschreven in Unsay et al.¹⁵
   3. Neem de Petrischaal met de stempel en plaats deze in de AFM Petrischaalhouder.
   4. Lijn de stempelrand loodrecht op de petrischaalhouder Y-as uit.
      OPMERKING: Een aanvaardbare kantelhoek is minder dan 5° zoals afgebeeld in figuur 1.
   5. Plaats de AFM-kop op het podium en zorg ervoor dat de stappenmotoren voldoende zijn uitgeschoven om te voorkomen dat de punt op de stempel crasht.

4. Uitvoeren van het AFM-programma

LET OP: Het AFM-programma wordt aangeboden als Aanvullend Materiaal (AutomatipSoftware2019.pdf). Het vereist een JPK-Bruker AFM Nanowizard II of III uitgerust met een gemotoriseerd podium en JPK desktop software versie 4.3. Het programma is ontwikkeld onder Jython (versie gebaseerd op python 2.7)

1. Gegevensverwerving
   1. Centreer de AFM-tip boven op de linkerhoek van de 4,5 x 4,5 μm² putten (overeenkomend met de celgrootte) met behulp van de optische microscoop van de AFM. Als een andere putgrootte nodig is, centreer dan in de linkerbovenhoek van de gewenste putten.
   2. Voer een 64 x 64 krachtkaart uit (Z-bereik = 4 μm, tipsnelheid = 90 μm·s^-1, toegepaste kracht 3 tot 5 nN) over een oppervlakte van 100 x 100 μm². Selecteer De modus Geforceerd toewijzen in het vervolgkeuzevak Meetmodus. Voer in het force control mapping panel de volgende parameters in: Rel. Setpoint = 3 tot 5 nN; z lengte 4 μm; Z-beweging: constante duur; verleng de tijd: 0.01s; ext. vertraging:0; Retr-vertraging: 0, vertragingsmodus: constante kracht, samplefrequentie 2048 Hz; Z gesloten lus uitvinken; Raster: check Vierkant beeld, Snel 100 μm, langzaam: 100μm, X offset: 0 μm; Y offset: 0 μm; rasterhoek: 0 graden; Pixels: 64x64; pixelverhouding: 1:1
      OPMERKING: Een typisch resultaat wordt weergegeven in figuur 2. Deze afbeelding helpt bij het meten en verifiëren van de toonhoogte tussen twee putten.
   3. Let op de coördinaten van het midden van de put linksboven (W1) en van de put linksonder (zie W2 op figuur 2). Maak hiervoor een vierkante doos rond de put. De coördinaat van het midden van de doos verschijnt op het linkerpaneel van de AFM-software in x,y coördinatenvakken.
   4. Om de automatiseringssoftware te openen (Automatip_scan.py): klik in de JPK-desktopsoftware op vooruit in het bovenste balkmenu en selecteer open het script. Selecteer in het venster dat wordt geopend het pad naar het scriptbestand in Aanvullende gegevens (Automatip_scan.py).
   5. Implementeer W1- en W2-coördinatenwaarden in de sectie Invoervak van hetJython-script( figuur3). Voer de W1-coördinaten in de variabele P1-regel 239 van het script en de W2-coördinaten in de variabele P2-regel 241 in. 
      OPMERKING: De putten die als begincoördinaten (W1 en W2) zijn geselecteerd, mogen niet te dicht bij de rand van het scangebied liggen. Anders zou het centreeralgoritme niet correct worden uitgevoerd omdat het de hoogte op het PDMS-oppervlak aan elke kant van de put moet meten. Zie bijvoorbeeld figuur 4.
   6. Wijs de toonhoogtewaarde toe aan de toonhoogtevariabele regel 245 van het script.
   7. Voer de putdimensie in de variabele Ws-regel 248 in. Dit is bekend van het ontwerp van de putpatronen en kan worden gecontroleerd op dezelfde afbeelding als die wordt gebruikt om de toonhoogte te verifiëren (figuur 2).
   8. Schrijf het pad naar de opslagmap in regel 251 om de gegevens op de gewenste plaats op te slaan.
   9. Stel de totaleArea variabele lijn 254 in op het wensmultieve veelvoud "n" van 100 μm (dat is het maximale scangebied van de gebruikte AFM). Het totale aantal putten dat zal worden onderzocht, kan worden berekend met behulp van deze waarde en de toonhoogte: maximaal scangebied/toonhoogte*n².
      OPMERKING: In het voorbeeld van figuur 3worden 9 gebieden van 100 x 100^{μm 2} geanalyseerd.
   10. Stel de krachtcurvematrix, rij en kolom (3, 3 of 4, 4) in, die per put worden geregistreerd in de variabele lijn 257 van numScans.
       OPMERKING: In het voorbeeld van figuur 3wordt voor elke put een matrix van 3 x 3 = 9 FCs geregistreerd.
   11. Voer het programma uit. Klik op de startknop.
       OPMERKING: Het programma voert eerst automatisch een centreeralgoritme uit om het centrum van W1- en W2-putten beter te bepalen (stap 1). Vervolgens wordt automatisch de Force Curves (FCs) matrix op elke put van het eerste scangebied (stap 2) ver verkrijgt. Wanneer alle putten van dat gebied worden onderzocht, verplaatst het script automatisch de AFM-tip naar de eerste put van het volgende scangebied. De punt wordt ingetrokken, de microscoopfase verplaatst zich naar het volgende gebied, de punt wordt opnieuw benaderd op de stempel en het centreeralgoritme wordt opnieuw uitgevoerd om automatisch opnieuw te centreren op de eerste put (1') van dat gebied (stap 3). Het eerste gebied wordt gedefinieerd door de gebruiker, het tweede, bevindt zich aan de rechterkant enz. totdat n is bereikt. n+1 gebied is onder n, n+2 aan de linkerkant van n+1, etc. tot 2n is bereikt. 2n+1 bevindt zich onder 2n, en 2n+2 bevindt zich aan de rechterkant op 2n, enz. Wereldwijd kronkelt de punt door het totale gebied. Stap 2 en 3 worden automatisch herhaald totdat het totale aantal "n²" scangebieden is onderzocht. Figuur 5 geeft het stroomschema van het programma aan. Het duurt ~ 4 uur om het programma te voltooien.
2. Gegevensanalyse
   1. Voer het python-script "Bestanden kopiëren" uit (Copy_files_L.py, geleverd in aanvullende gegevens) om de FCs-bestanden in één map te ordenen. Dit script is ontwikkeld met Python 2.7 en de SciPy module. Gebruik Visual Studio Code-software om het python-script te openen. Invoerpad naar de algemene map (regel 67 van het script in aanvullende gegevens) en waar het wordt opgeslagen (regel 73).
   2. Open de AFM-software voor gegevensverwerking om de krachtcurven te analyseren. Selecteer in het bovenste menu Bestanddeoptie 'batch spectroscopiecurven openen'.
   3. Selecteer in het batchverwerkingsvenster het proces dat wordt geleverd in Aanvullende gegevens (StiffnessProcess.jpk-proc-force). Selecteer de laatste stap van het proces en klik op Keep and Apply to All. Alle krachtcurves krijgen dezelfde behandeling.
      OPMERKING: Het proces gebruikt de kalibratie van de FCs-bestanden om de afbuigcurven om te zetten in krachtcurven gekalibreerd in Newton; een data smoothing algoritme wordt toegepast (gemiddelde van 3 opeenvolgende punten); de basislijn wordt vertaald naar rust op de nulas; het contactpunt wordt geëxtrapoleerd en de FC wordt gecompenseerd om het contactpunt op coördinaat te plaatsen (0,0); het buigen van de cantilever wordt afgetrokken naar de FCs, de retract slope wordt gemonteerd. Aan het einde van de databehandeling genereert de software een bestand met een tabel die voor elke FCs geeft: de naam, Young Modulus, contactpunt, hechtingskracht, hellingen, enz.
   4. Herhaal de stappen 4.2.1 tot en met 4.2.3 voor alle experimenten. Wees voorzichtig met het opslaan van de gegevens in verschillende mappen (d.w.z.: "...\TREATED\" en "...\UNTREATED\")
   5. Gebruik het R-script in Aanvullende gegevens om histogrammen en boxplots te plotten en ANOVA-statistische behandelingen uit te voeren.
      1. Als u het R-script (DataAnalisys.R) wilt openen, gebruikt u R-studiosoftware en laadt u de bestanden met de informatie die is geëxtraheerd met de gegevensverwerkingssoftware (.tsv).
      2. Gebruik in het omgevingsvenster de knop Gegevensset importeren, selecteer in de weergegeven lijst de optie selecteren uit tekst (readr) en selecteer in het nieuwe venster de knop Browser en zoek het bestand .tsv.
      3. Zodra het bestand is geladen, selecteert u de kolommen (stijfheid en hechting) die voor de analyse moeten worden opgenomen. Druk op Ctrl+Alt+Rom alle code uit te voeren.
         OPMERKING: Het script werkt met 4 datasets, overweeg twee experimenten met zowel onbehandelde als behandelde cellen. Het is mogelijk om blokken van het script uit te voeren en te zien hoe de variabelen veranderen afhankelijk van de uitgevoerde functies.

Resultaten

We gebruikten het beschreven protocol om het effect van caspofungine op de biofysische eigenschappen van de opportunistische menselijke ziekteverwekker C. albicans in zijn gistvorm te analyseren. Caspofungine is een laatste kans antischimmel molecuul gebruikt wanneer andere geneesmiddelen zijn niet effectief vanwege de weerstandsmechanismen cellen ontwikkelen zich in de richting van antischimmelmiddelen. Het werkingsmechanisme is gebaseerd op de remming van de subeenheid Fks2 van het complex fks1/Fks2 die verant...

Discussie

De belangrijkste verbetering van deze methodologie is een significante toename van het aantal gemeten cellen in een bepaalde hoeveelheid tijd. De tegenwaarde is een vermindering van het aantal gemeten punten per cel. Het betekent dat deze methode niet is ontworpen om een gedetailleerde analyse van een enkele cel te bieden. De methode is alleen van toepassing op cellen die in de putten van de PDMS-stempel passen. De stempel is vrij veelzijdig, terwijl het putten van 1,5 x 1,5 μm² tot 6 x 6 μm²bevat. ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
AFM cantilever	Bruker AFM sondes	MLCT	De gebruikte cantilevers waren de gelabelde “C” met een resonantiefrequentie van 7 tot 10 kHz en k: 0,01 N/m
AFM data-analyse	JPK-Bruker	JPK Dataverwerking versie minimaal 5.1.8	Kan worden gedownload vanaf een JPK-Bruker gebruikersaccount
AFM Petri schotels	WPI	FluoroDish FD35-100	De verwarming werd gebruikt om de temperatuurveranderingen tijdens het experiment te controleren
Atomaire krachtmicroscoop (AFM)	JPK-Bruker	Nanowizard II of III	de AFM moet worden gemonteerd op een omgekeerde optische microscoop met een gemotoriseerde stage
Caspofungine	Sigma-Aldrich	SML0425-5MG	Caspofungine werd gebruikt met een concentratie van 4 MIC (Minimale Remmerconcentratie)
Code-editor	Microsoft	Visual Studio Code versie 1.40.1	https://code.visualstudio.com/
Cryobeads	IFU	CB12
Desiccator/Degassing kamer	Fisherbrand	15594635	Het apparaat wordt gebruikt om de PDMS-stempels gedurende ongeveer 50 minuten te degasseren, elke desiccator gekoppeld aan een vacuümpomp zal het doen.
Petri schotel verwarming	JPK-Bruker	PetriDishHeater	Dit is een toevoeging aan de JPK/Bruker AFM. De verwarming werd gebruikt om de temperatuurveranderingen tijdens het experiment te controleren
Natriumacetaatbuffer pH 5,2	Sigma-Aldrich	S7899	De oplossing bevat 18 mM natriumacetaat, 1 mM CaCl2 en 1 mM MnCl2. Pas de pH aan met glazuur azijnzuur. De oplossing kan 2 maanden bij 4 °C worden bewaard
Statistische analyse taal	https://www.r-project.org	R versie 3.6.1	R is een taal en omgeving voor statistische computing en grafiek. Het is een GNU-project dat vergelijkbaar is met de S-taal en omgeving
Statistische analyse software	https://rstudio.com	R studio versie 1.1.463	Samenwerking tussen de R Foundation, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP en anderen. RStudio en Shiny zijn aangesloten projecten van de Foundation for Open Access Statistics
Sylgard 184	Sigma-Aldrich	761028	Polydimetylsiloxaan (PDMS) en uithardingsmiddel in één set
Gist Peptone D Bouillon	Difco	242820
YPD Agar	Difco	DF0427-17-6