Dit protocol heeft als doel afm-metingen op honderden microbiële cellen te automatiseren. Eerst worden microben geïmmobiliseerd in PDMS-stempelmicrostructuren en vervolgens worden krachtspectroscopiemetingen automatisch uitgevoerd op honderden geïmmobiliseerde cellen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Automatisering van bio-atoomkrachtmicroscoopmetingen op honderden C. albicans-cellen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De in dit artikel gepresenteerde methode is gericht op het automatiseren van Bio-AFM experimenten en het registreren van krachtcurves. Met deze methode is het mogelijk om krachtencurven op 1000 cellen automatisch in 4 uur vast te leggen. Om een analysetijd van 4 uur te behouden, wordt het aantal krachtcurven per cel teruggebracht tot 9 of 16. De methode combineert een op Jython gebaseerd programma en een strategie voor het assembleren van cellen op gedefinieerde patronen. Het programma, geïmplementeerd op een commerciële Bio-AFM, kan de tip centreren op de eerste cel van de array en vervolgens automatisch van cel naar cel bewegen terwijl krachtcurves op elke cel worden opgenomen. Met behulp van deze methodologie is het mogelijk om toegang te krijgen tot de biofysische parameters van de cellen, zoals hun stijfheid, hun kleefeigenschappen, enz. Met de automatisering en het grote aantal geanalyseerde cellen heeft men toegang tot het gedrag van de celpopulatie. Dit is een doorbraak op het gebied van Bio-AFM, waar tot nu toe slechts enkele tientallen cellen gegevens zijn geregistreerd.
Inleiding
Dit werk biedt een methodiek om met behulp van een atoomkrachtmicroscoop (AFM) automatische krachtmetingen uit te voeren op honderden levende cellen. Het biedt ook een methode om microben te immobiliseren op een PDMS-microgestructureerde stempel die compatibel is met AFM-experimenten die in een vloeibare omgeving worden uitgevoerd.
Bio-AFM is een zeer gespecialiseerde technologie die is ontworpen voor toepassingen in de biologie en vervolgens wordt gebruikt om levende cellen te bestuderen. Het vereist een getrainde ingenieur die één cel tegelijk kan analyseren. In deze omstandigheden is het aantal verschillende cellen dat kan worden geanaly....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Microbiële celkweek
- Cellen uit een glycerolvoorraad revivificeren.
OPMERKING: C. albicans worden bij -80 °C opgeslagen in glycerolvoorraden, op knikkers.- Pluk een marmer in de bouillon van -80 °C en wrijf het op gist pepton dextrose (YPD) agar. Kweek de cellen gedurende 2 dagen bij 30 °C, vóór vloeibare teelt.
- Bereid vloeibare culturen voor.
- Vul een kweekbuis met 5 ml steriele YPD-bouillon en voeg een enkele kolonie C. albicans-cellen toe, gekweekt op de YPD-agarplaat.
- Kweek de kweek in statische omstandigheden gedurende 20 uur op 30 °C voordat u ze oogst met centrifugeren (4000 x ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
We gebruikten het beschreven protocol om het effect van caspofungine op de biofysische eigenschappen van de opportunistische menselijke ziekteverwekker C. albicans in zijn gistvorm te analyseren. Caspofungine is een laatste kans antischimmel molecuul gebruikt wanneer andere geneesmiddelen zijn niet effectief vanwege de weerstandsmechanismen cellen ontwikkelen zich in de richting van antischimmelmiddelen. Het werkingsmechanisme is gebaseerd op de remming van de subeenheid Fks2 van het complex fks1/Fks2 die verant.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De belangrijkste verbetering van deze methodologie is een significante toename van het aantal gemeten cellen in een bepaalde hoeveelheid tijd. De tegenwaarde is een vermindering van het aantal gemeten punten per cel. Het betekent dat deze methode niet is ontworpen om een gedetailleerde analyse van een enkele cel te bieden. De methode is alleen van toepassing op cellen die in de putten van de PDMS-stempel passen. De stempel is vrij veelzijdig, terwijl het putten van 1,5 x 1,5 μm2 tot 6 x 6 μm2bevat. .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Dankbetuigingen
We willen FONCYCYT van CONACYT (Mexico), het ministerie van Buitenlandse Zaken van Frankrijk en de Université Paris 13 erkennen, hoewel de financiële steun van het internationale samenwerkingsproject ECOS-NORD genaamd Nano-palpation for diagnosis, nr. 263337 (Mexico) en MI5P02 (Frankrijk). AMR wil de financiële steun van SIP-IPN via het project No. 20195489 bedanken. SPC wordt ondersteund door een PhD fellowship van CONACYT (No. 288029) en IPN via de cotutelle overeenkomst om een dubbel PhD certificaat (IPN-UPS) te behalen. ED en CFD zijn onderzoekers van Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| AFM cantilever | Bruker AFM sondes | MLCT | De gebruikte cantilevers waren de gelabelde “C” met een resonantiefrequentie van 7 tot 10 kHz en k: 0,01 N/m |
| AFM data-analyse | JPK-Bruker | JPK Dataverwerking versie minimaal 5.1.8 | Kan worden gedownload vanaf een JPK-Bruker gebruikersaccount |
| AFM Petri schotels | WPI | FluoroDish FD35-100 | De verwarming werd gebruikt om de temperatuurveranderingen tijdens het experiment te controleren |
| Atomaire krachtmicroscoop (AFM) | JPK-Bruker | Nanowizard II of III | de AFM moet worden gemonteerd op een omgekeerde optische microscoop met een gemotoriseerde stage |
| Caspofungine | Sigma-Aldrich | SML0425-5MG | Caspofungine werd gebruikt met een concentratie van 4 MIC (Minimale Remmerconcentratie) |
| Code-editor | Microsoft | Visual Studio Code versie 1.40.1 | https://code.visualstudio.com/ |
| Cryobeads | IFU | CB12 | |
| Desiccator/Degassing kamer | Fisherbrand | 15594635 | Het apparaat wordt gebruikt om de PDMS-stempels gedurende ongeveer 50 minuten te degasseren, elke desiccator gekoppeld aan een vacuümpomp zal het doen. |
| Petri schotel verwarming | JPK-Bruker | PetriDishHeater | Dit is een toevoeging aan de JPK/Bruker AFM. De verwarming werd gebruikt om de temperatuurveranderingen tijdens het experiment te controleren |
| Natriumacetaatbuffer pH 5,2 | Sigma-Aldrich | S7899 | De oplossing bevat 18 mM natriumacetaat, 1 mM CaCl2 en 1 mM MnCl2. Pas de pH aan met glazuur azijnzuur. De oplossing kan 2 maanden bij 4 °C worden bewaard |
| Statistische analyse taal | https://www.r-project.org | R versie 3.6.1 | R is een taal en omgeving voor statistische computing en grafiek. Het is een GNU-project dat vergelijkbaar is met de S-taal en omgeving |
| Statistische analyse software | https://rstudio.com | R studio versie 1.1.463 | Samenwerking tussen de R Foundation, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP en anderen. RStudio en Shiny zijn aangesloten projecten van de Foundation for Open Access Statistics |
| Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761028 | Polydimetylsiloxaan (PDMS) en uithardingsmiddel in één set |
| Gist Peptone D Bouillon | Difco | 242820 | |
| YPD Agar | Difco | DF0427-17-6 |
Referenties
- Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. Nanomechanical analysis of cells from cancer patients. Nature Nanotechnology. 2 (12), 780-783 (2007).
- Dague, E., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
