Methodenartikel

DNA-gordijnen werpen licht op complexe moleculaire systemen tijdens homologe recombinatie

3.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61320

⸱

23 juni 2020

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry & Molecular Biophysics, Columbia University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

DNA-gordijnen presenteren een nieuwe methode voor het visualiseren van honderden of zelfs duizenden DNA-bindende eiwitten in real-time terwijl ze interageren met DNA-moleculen die op het oppervlak van een microfluïdische monsterkamer zijn uitgelijnd.

Samenvatting

Homologe recombinatie (HR) is belangrijk voor het herstel van dubbelstrengs DNA-breuken (DSB's) en vastgelopen replicatievorken in alle organismen. Defecten in HR zijn nauw verbonden met een verlies van genoomintegriteit en oncogene transformatie in menselijke cellen. HR omvat gecoördineerde acties van een complexe reeks eiwitten, waarvan er vele nog steeds slecht worden begrepen. Het belangrijkste aspect van het hier beschreven onderzoek is een technologie die "DNA-gordijnen" wordt genoemd, een techniek die de assemblage van uitgelijnde DNA-moleculen op het oppervlak van een microfluïdische monsterkamer mogelijk maakt. Ze kunnen vervolgens worden gevisualiseerd door middel van totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie (TIRFM). DNA-gordijnen zijn ontwikkeld door ons laboratorium en bieden directe toegang tot spatiotemporele informatie op millisecondeschalen en resoluties op nanometerschaal, die niet gemakkelijk kunnen worden onthuld via andere methodologieën. Een groot voordeel van DNA-gordijnen is dat het het verzamelen van statistisch relevante gegevens uit experimenten met één molecuul vereenvoudigt. Dit onderzoek levert nog steeds nieuwe inzichten op in hoe cellen de genoomintegriteit reguleren en behouden.

Inleiding

Het behoud van de integriteit van het genoom is cruciaal voor het goed functioneren van alle levende cellen1. Defecten in de integriteit van het genoom kunnen leiden tot ernstige gezondheidsproblemen, waaronder verschillende soorten kanker en leeftijdsgebonden degeneratieve ziekten2. Homologe recombinatie (HR) maakt gebruik van sjabloonafhankelijke DNA-synthese om dubbelstrengs DNA-breuken (DSB), enkelstrengs DNA (ssDNA) hiaten en interstrand-DNA-crosslinks te repareren3. HR is ook nodig voor het herstel van vastgelopen en ingestorte replicatievorken 3,4. Bovendien is HR essentieel voor een nauwkeurige chromosoomscheiding tijdens meiose 5,6.

HR omvat de gecoördineerde acties van een complexe reeks eiwitten, waarvan er vele slecht begrepen blijven1. Voorbeelden zijn replicatie-eiwit A (RPA), Rad51 en Rad54, naast vele andere7. Bij HR-reacties in zowel prokaryote als eukaryote cellen is een ssDNA-tussenproduct betrokken, dat snel wordt gecoat met ssDNA-bindende eiwitten (SSB in prokaryoten en RPA in eukaryoten)8. Deze eiwitten beschermen het ssDNA tegen nucleasen, elimineren de secundaire structuur en bevorderen de rekrutering van stroomafwaartse factoren 8,9. Rad51 is een lid van de sterk geconserveerde ATP-afhankelijke Rad51/RecA-familie van DNA-recombinasen, die aanwezig zijn in alle levende organismen1. Rad51 bevordert de invasie van de DNA-streng van de homologe dsDNA-donor. Gezien het belang ervan is Rad51 sterk gereguleerd, en defecten in deze regulerende processen worden vaak geassocieerd met een verlies van genoomintegriteit en oncogene transformatie7. Rad54 is een lid van de Swi2/Snf2-familie van dsDNA-translocasen en chromatine-remodelers10,11. Deze eiwitten dienen als essentiële Rad51-regulerende factoren. Belangrijk is dat Rad54 Rad51 verwijdert uit het dsDNA-product van strenginvasie en ook nodig is om verkeerde accumulatie van Rad51 op chromatine11 te voorkomen. Moleculaire activiteiten voor eiwitten die betrokken zijn bij HR, zowel in gist- als bacteriecellen, hebben licht geworpen op hun functie in HR, maar hoe hun activiteit precies bijdraagt aan HR blijft slecht begrepen 12.

DNA-gordijnen zijn naar voren gekomen als een uniek platform dat directe toegang biedt tot moleculaire mechanismen en macromoleculaire dynamica die anders ontoegankelijk zouden blijven13,14. Om DNA-gordijnen voor te bereiden, wordt het oppervlak van een microfluïdische kamer bedekt met een lipidedubbellaag en worden DNA-moleculen aan de dubbellaag vastgemaakt via een biotine-streptavidine-koppeling. De dubbellaag maakt het oppervlak inert door natuurlijke celmembranen na te bootsen. Hydrodynamische kracht lijnt het DNA uit langs nanogefabriceerde barrières, waardoor visualisatie van honderden moleculen in een enkel gezichtsveld mogelijk is door totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie (TIRFM). De barrières worden gemaakt door elektronenbundellithografie en variaties in het ontwerp van de barrière zorgen voor nauwkeurige controle over de distributie en bindingsgeometrie van het DNA. Deze benaderingen zijn gemakkelijk toepasbaar met ssDNA of dsDNA 13,14,15,16,17,18. Sokkels kunnen ook worden genanofabriceerd (samen met de barrières) om beide uiteinden van het DNA aan het oppervlak van de monsterkamer te kunnen binden, zodat experimenten met stabiele toestand kunnen worden uitgevoerd in afwezigheid van bufferstroom.

Tijdsafhankelijke veranderingen in individuele eiwit-nucleïnezuurcomplexen worden onthuld door de inspectie van real-time video's en worden in druk weergegeven met behulp van kymografen, die de veranderende positie van eiwitten op DNA in de loop van de tijd weergeven. Een belangrijk aspect van de DNA-gordijnbenadering is dat er niet per se a priori modellen of aannames over moleculaire mechanismen voor nodig zijn, omdat het gedrag van individuele reactiecomponenten in real-time kan worden waargenomen. Dit maakt de directe observatie van moleculair gedrag mogelijk. Hierin beschrijft dit protocol hoe DNA-gordijnen met dsDNA-substraten kunnen worden voorbereid, evenals de toepassing ervan om tussenproducten in homologe recombinatie te bestuderen.

Protocol

1. Bereiding van lipidenbouillon

  1. Los 1 g 18:1 (Δ9-Cis) PC, 100 mg 18:1 PEG2000 PE en 5 mg 18:1 biotinyl cap PE op in 10 ml chloroform.
    OPMERKING: Zowel DOPC als DPPE zijn goed gekarakteriseerd en (samen met PEG-modificatie) geselecteerd vanwege hun vermogen om niet-specifieke adsorptie aan het oppervlak van de stroomcel te minimaliseren. Opgeloste lipidenmastermix kan worden verdeeld en tot 12 maanden worden bewaard bij -20 °C.
  2. Gebruik chloroform om een glazen spuit met organische oplosmiddelen schoon te maken en breng vervolgens 200 μL (10% van het uiteindelijke gewenste volume) van het lipidenmastermengsel over in de glazen injectieflacon.
  3. Verdamp de chloroform uit de glazen injectieflacon met behulp van een zeer zachte stroom gecomprimeerde stikstof. Verhoog de druk iets naar het einde van de verdamping toe om ervoor te zorgen dat alle sporen van chloroform worden verwijderd.
    OPMERKING: Kantel en draai de injectieflacon tijdens het verdampingsproces, zodat de lipiden als een uniforme laag witte film op de muur drogen.
  4. Zet de injectieflacon zonder dop een nacht onder vacuüm.
  5. Voeg 2 ml lipidenbuffer (10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 100 mM NaCl) toe aan de gedroogde lipidenfilm en sluit de injectieflacon af. Incubeer gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur (RT) en vortex tot het is opgelost.
  6. Breng de oplossing over in een buis van 5 ml polystyreen met ronde bodem en sonificeer op ijs met behulp van een microtip met de volgende parameters: amplitude = 50, verwerkingstijd = 1,5 min, puls = 15 s, tijd uit = 2 min. De oplossing zal helder zijn na sonicatie (totale energie = 1.500-2.000 J).
  7. Filtreer de oplossing door een PVDF-spuitfilter van 0,22 μm en bewaar de lipidenvoorraad maximaal 1 maand bij 4 °C.

2. Bereiding van dsDNA-substraat

  1. Verwarm de λ-DNA-voorraad (500 μg/ml) tot 65 °C.
  2. Bereid een gloei-/ligatiemengsel voor met: 1,6 pM λ-DNA, 100x molaire overmaat (160 pM) van elk oligonucleotide (BioL: 5'Phos-AGG, TCG, CCG, CCC-3Bio en DigR: 5'Phos-GGG, CGG, CGA, CCT-3Dig_N) en 60 μL 10x T4-ligasereactiebuffer (in een totaal volume van 600 μL).
    OPMERKING: BioL- en DigR-oligonucleotiden worden respectievelijk gebiotinyleerd (Bio) en gemodificeerd met digoxigenine (Dig). Biotinylering maakt de hechting van DNA-moleculen aan gebiotinyleerde lipiden mogelijk via streptavidinekoppelingen. De Dig-modificatie maakt dubbele tethering mogelijk door binding van anti-Dig-antilichamen die op sokkels zijn gecoat aan Dig-groepen.
  3. Gloei de oligonucleotiden aan de λ-DNA-cos-ends door de reactie gedurende 10 minuten bij 65 °C te incuberen en laat deze vervolgens langzaam afkoelen tot RT.
  4. Voeg 5 μL T4 DNA-ligase toe en incubeer een nacht bij RT.
    OPMERKING: Gloei- en ligatiestappen kunnen ook worden uitgevoerd in een thermische cycler.
  5. Precipiteer het λ-DNA door 300 μl PEG-8000-oplossing toe te voegen (30% m/v PEG-8000 en 10 mM MgCl2). Incubeer gedurende ten minste 1 uur bij 4 °C.
  6. Centrifugeer bij 14.000 x g gedurende 5 minuten bij RT. Verwijder het bovenstaande voorzichtig zonder de pellet te verstoren. Was de pellet eventueel 1x met 500 μL gekoelde 70% ethanol.
  7. Resuspendeer de pellet in 40 μL TE-buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA [pH 8,0]).

3. Nanofabricage van chroompatronen

  1. Boor twee gaten in het midden van een kwartsmicroscoopglaasje van 1" x 3" (~3 cm uit elkaar) met behulp van een met diamant beklede boor van 1.4 mm op een tafelkolomboormachine (zie afbeelding 1 voor de geometrie van de boorpositie).
  2. Reinig de geboorde objectglaasjes door ze onder te dompelen in 200 ml Piranha-oplossing (75% zwavelzuur [97%] en 25% waterstofperoxide). Incubeer gedurende 30 minuten.
    LET OP: Er moet uiterste zorg worden besteed om elk contact met de blootgestelde huid te vermijden. Bereid de oplossing voor door koude waterstofperoxide heel langzaam te mengen met zwavelzuur. Gooi Piranha-afval op de juiste manier weg in een daarvoor bestemde afvalcontainer.
  3. Spoel de dia's af door ze onder te dompelen in 200 ml dubbel gedestilleerd water. Herhaal dit 2x om eventuele resterende piranha's te verwijderen. Droog de dia's af met een zachte stroom gecomprimeerde stikstof.
  4. Gebruik een spin coater (4.000 tpm gedurende 45 s, hellingssnelheid van 300 tpm/s) om de schone dia's als volgt te coaten met fotoresist en geleidend polymeer:
    1. Smeer de objectglaasjes in met een laag van 3% (m/v) polymethylmethacrylaat (PMMA; 24,3K MW; opgelost in anisole).
    2. Smeer de objectglaasjes in met een laag van 1,5% (m/v) polymethylmethacrylaat (PMMA; 495K MW; opgelost in anisol).
    3. Smeer dia's in met een laag antistatisch middel voor elektronenbundellithografie.
  5. Schrijf aangepaste patronen voor barrières en sokkels op de gecoate dia's met behulp van elektronenbundellithografie met een scanning-elektronenmicroscoop die is uitgerust met systeemsoftware voor het genereren van nanopatronen.
  6. Ontwikkel de objectglaasjes door eerst het antistatische middel voor de elektronenbundellithografie af te spoelen met dubbel gedestilleerd water. Doe ze vervolgens in buisjes van 50 ml met de ontwikkeloplossing (75% methylisobutylketon [MIBK] en 25% isopropanol; houd gekoeld bij -20 °C) en soniceer gedurende 1 minuut in een ijsbad op laag vermogen.
  7. Spoel de ontwikkeloplossing af met isopropanol en droog af met een zachte stroom gecomprimeerde stikstof.
  8. Breng met behulp van een elektronenstraalverdamper een 250 Å dikke laag chroom aan op het patroonoppervlak met een snelheid van 0,5 Å/s.
  9. Til het chroom en de resterende PMMA op met aceton uit een spuitfles, gevolgd door sonicatie van de dia's in een acetonbad gedurende 10 minuten. Was opnieuw met aceton uit een spuitflesje.
  10. Om afzettingen van de resterende aceton te voorkomen, spoelt u de objectglaasjes af met isopropylalcohol en droogt u ze af met een zachte stroom gecomprimeerde stikstof.

4. Assemblage van de flowcel

  1. Plaats een rechthoekige papieren sjabloon van 35 mm x 5 mm (die zowel het chroompatroon als de voorgeboorde inlaat-/uitlaatgaten bedekt) over de kwartsdia, met de patroonzijde naar boven ( Afbeelding 1A).
  2. Breng een stuk dubbelzijdig plakband (1 mm dikte) aan op de kwartsdia en bedek de papieren sjabloon en gebruik vervolgens een scheermesje om de rechthoekige papieren sjabloon uit te knippen ( Afbeelding 1A).
  3. Plaats een glazen dekglaasje over de dubbelzijdige tape en oefen lichte druk uit om het dekglaasje op de tape te verzegelen ( Figuur 1A). De ruimte tussen het dekglaasje en het glaasje, afgedicht met dubbelzijdig plakband, vormt de microfluïdische kamer.
    OPMERKING: Het is van cruciaal belang dat de afdichting tussen de afdekstrook en de schuif voldoende goed vastzit om lekkage tijdens het experiment te voorkomen.
  4. Plaats de sandwich tussen de glasdia's en bevestig de bindclips aan alle vier de zijden om de druk gelijkmatig te verdelen. Plaats het geheel 60 minuten in een vacuümoven op 135 °C om de dubbelzijdige tape te smelten en de kamer af te dichten.
  5. Haal het uit de oven en laat vervolgens de bindclips en glasplaatjes los.
  6. Bevestig microfluïdische poorten aan de voorgeboorde inlaat-/uitlaatgaten met een heet lijmpistool door het gelijmde geheel gedurende 1 minuut op een verwarmingsblok (220 °C) te plaatsen, het eraf te halen en voorzichtig lichte druk uit te oefenen om de microfluïdische poorten goed af te dichten. Laat de lijm volledig uitharden voordat u verder gaat.
    NOTITIE: Geassembleerde flowcellen kunnen in buizen van 50 ml worden geplaatst en onder vacuüm worden bewaard.

5. Montage van het dsDNA-gordijn

  1. Bevestig de inlaat-/uitlaatslang aan de microfluïdische poorten van de flowcel en spoel de kamer met 20 ml dubbel gedestilleerd water met behulp van twee spuiten van 10 ml.
  2. Met een spuit van 10 ml gevuld met dubbel gedestilleerd water die aan beide zijden van de stroomcel is aangesloten, oefent u kracht uit om het water tussen de inlaat- en uitlaatspuiten te duwen/trekken. Deze stap verwijdert alle luchtbellen uit de flowcel.
  3. Was de kamer met 3 ml lipidenbuffer (10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 100 mM NaCl).
    NOTITIE: Zorg ervoor dat alle verbindingen met stroomcellen druppelsgewijs zijn om te voorkomen dat er luchtbellen in de stroomcel komen.
  4. Meng 40 μL liposoomoplossing met 1 ml lipidenbuffer. Injecteer 300 μL van de lipidenoplossing in de flowcel en incubeer gedurende 5 min. Herhaal de injectie en incubatie 2x.
    OPMERKING: Wissel de inlaat-/uitlaatzijde af voor injectie telkens wanneer een spuit op de flowcel wordt aangesloten.
  5. Was de kamer met 3 ml lipidenbuffer en incubeer gedurende 15 minuten.
    OPMERKING: Deze incubatietijd kan variëren van 5 minuten tot 2 uur, afhankelijk van de planning van experimenten, zonder merkbare verschillen in de uiteindelijke montage van het gordijn.
  6. Meng 40 μL 1 mg/ml anti-digoxigenine stockoplossing met 200 μL lipidenbuffer. Injecteer 100 μL van de oplossing en incubeer gedurende 10 min. Herhaal de injectie en incubatie 1x voor het wassen met 3 ml lipidenbuffer.
    OPMERKING: Deze stap is alleen nodig voor dubbelgebonden dsDNA-gordijnen. Sla deze stap over voor enkelvoudig vastgebonden dsDNA-gordijnen.
  7. Was de kamer met 3 ml BSA-buffer (40 mM Tris-HCl [pH 8,0], 2 mM MgCl2, 1 mM DTT en 0,2 mg/ml BSA).
  8. Meng 10 μl 1 mg/ml streptavidin-stockoplossing met 990 μl BSA-buffer. Injecteer als twee afzonderlijke injecties van 400 μl met een incubatie van 10 minuten na elke injectie.
  9. Was de kamer met 3 ml BSA-buffer om overtollig streptavidine te verwijderen.
  10. Verdun 25 ng dsDNA-substraatvoorraad in 1 ml BSA-buffer. Injecteer de DNA-oplossing langzaam 200 μl per keer, gevolgd door een incubatie van 5 minuten na elke injectie. De benodigde hoeveelheid DNA kan worden geoptimaliseerd voor specifieke soorten experimenten.
  11. Monteer de flowcel op de microscooptafel en pas de scherpstelling indien nodig aan.
  12. Sluit de invoer- en uitvoerpoorten aan op een voorbeeldinjectiesysteem dat bestaat uit een spuitpomp en een hogedrukschakelklep.
  13. Koppel het DNA dubbel vast aan de sokkels (12 μm tetherlengte) door de kamer continu te wassen met BSA-buffer met 0,8 ml/min gedurende 5 minuten.
    NOTITIE: Het kan nodig zijn om stroomsnelheden en tijden aan te passen om te optimaliseren voor verschillende lengtes van dubbele tethers. Deze stap is alleen nodig voor dubbelgebonden DNA-gordijnen. Sla deze stap over voor enkelvoudig vastgebonden dsDNA-gordijnen.
  14. De gordijnen zijn nu klaar voor experimenten.

6. Recycling van flowcellen

  1. Dompel de objectglaasjes minstens 30 minuten onder in ethanol voordat u een scheermesje gebruikt om de microfluïdische poorten en het dekglaasje voorzichtig te verwijderen. Gooi het dekglaasje op de juiste manier weg en verwijder alle resterende lijm van de microfluïdische poorten, zodat ze opnieuw kunnen worden gebruikt. Schrob eventuele lijmresten op de dia schoon.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u geen krassen maakt op het gebied met het patroon in het midden van de dia.
  2. Spoel de objectglaasjes grondig af met dubbel gedestilleerd water en dompel ze een nacht onder onder roeren onder in 2% alkalisch vloeibaar kwartsreinigingsconcentraat.
  3. Spoel de objectglaasjes grondig af met dubbel gedestilleerd water en dompel ze onder in 2% alkalische vloeibare kwartsreinigingsconcentraatoplossing gedurende 1 uur onder roer bij 80 °C, gevolgd door soniceren gedurende 15 minuten bij 45 °C.
  4. Spoel de objectglaasjes grondig af met dubbel gedestilleerd water en dompel ze onder in 1 M NaOH gedurende 30-60 min, onder roer.
  5. Spoel de objectglaasjes grondig af met dubbel gedestilleerd water, dompel ze vervolgens onder in isopropylalcohol en soniceer ze gedurende 15 minuten bij 45 °C.
  6. Spoel de objectglaasjes grondig af met ethanol en dompel ze 1 uur onder roer onder in ethanol.
  7. Plaats de glaasjes 1 uur in een vacuümoven om te drogen op 135 °C. De geleiders zijn nu klaar om weer in elkaar te worden gezet tot flowcellen.

Resultaten

Hierboven beschreven zijn de voorbereiding, assemblage en beeldvorming van enkel- en dubbelgebonden dsDNA-gordijnen in de context van het bestuderen van eiwit-DNA-interacties in DNA-reparatietussenproducten. Figuur 1A toont alle componenten in een flowcel, gelaagd in de volgorde waarin ze zijn geassembleerd. Figuur 1B toont het schema van een enkel- of dubbelgebonden DNA-gordijn. Een lipidedubbellaag wordt gebruikt om het oppervlak van de flowcel te passiveren. Het DNA-gordijn bestaat uit een parallelle reeks DNA-moleculen die aan het ene uiteinde aan het lipide zijn vastgemaakt en zijn uitgelijnd bij de chroombarrière, loodrecht op de stroomrichting georiënteerd. Voor dubbelgebonden DNA-gordijnen wordt het andere uiteinde van het DNA aan het voetstuk vastgemaakt door middel van digoxigenine- en anti-digoxigenine-interacties, zodat beeldvorming kan worden uitgevoerd in afwezigheid van stroom terwijl het DNA uitgestrekt blijft. dsDNA kan worden gekleurd met fluorescerende kleurstof YoYo1 en worden gevisualiseerd door TIRF-microscopie. Figuur 2A toont een representatief breedveldbeeld van YoYo1-gekleurd dubbelgebonden DNA-gordijn.

Time-lapse-beeldreeksen die zijn verzameld uit DNA-gordijnexperimenten worden meestal geanalyseerd door eerst een kymograaf te genereren, die de positie langs het DNA-molecuul op de verticale as versus de tijd op de horizontale as uitzet voor elk DNA-molecuul dat van belang is in ImageJ. Figuur 2B zijn representatieve kymografen die de resectie tonen van YoYo1-gekleurd enkelvoudig gebonden λ-DNA (groen) door de gistresectiemechanismen GFP-Sgs1 (niet zichtbaar), Top3-Rmi1 en Dna2 in aanwezigheid van enkelstrengs DNA-bindend eiwit RPA-mCherry (magenta) en ATP. Het YoYo1-signaal gaat na verloop van tijd verloren omdat dsDNA van het vrije uiteinde wordt verwijderd door Sgs1-Dna2. Tegelijkertijd colocaliseert het mCherry-signaal met de DNA-uiteinden waar ssDNA wordt gegenereerd als gevolg van de resectie. Biofysisch relevante kenmerken van de resectie, zoals snelheid en processiviteit, kunnen worden geëxtraheerd door de hellingen van de YoYo1-signaalverliestrajecten te kwantificeren. Figuur 2C,D toont de verdeling van respectievelijk snelheden en processiviteit van resectie door Sgs1-Dna2.

figure-results-1
Figuur 1: Schema's van de assemblage van flowcellen en DNA-gordijnen. (A) Stapsgewijze illustratie voor de assemblage van flowcellen. Dubbelzijdig plakband wordt bovenop de kwartsdia geplaatst en een papieren sjabloon wordt gebruikt om een rechthoekig kanaal uit het midden te snijden, dat wordt afgedicht met een dekglaasje erop om een kamer te vormen. (B) Schema's van volledig geassembleerde DNA-gordijnen. Het middelste paneel toont een enkelvoudig gebonden stroomcel, terwijl het onderste paneel een dubbelgebonden stroomcel presenteert. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Visualisatie en analyse van een enkel molecuul DNA-gordijn. (A) Representatief breedveldbeeld van een dubbelgebonden λ-DNA-gordijn gekleurd met YoYo1 (groen). (B) Representatieve kymografen die de resectie van YoYo1-gekleurd dsDNA (groen) tonen in aanwezigheid van vooraf gebonden GFP-Sgs1 (niet zichtbaar) wanneer gejaagd met Dna2, in aanwezigheid van RPA-mCherry (magenta) en 2 mM ATP. Snelheidsverdeling (C) en processiviteitsplot (D) van dsDNA-resectie door Sgs1-Dna2, verkregen door de snelheid en omvang van het YoYo1-signaalverlies in de loop van de tijd te kwantificeren. Panelen (B), (C) en (D) zijn een bewerking van Xue et al.19. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

DNA-gordijnen hebben bewezen een veelzijdig platform te zijn voor het bestuderen van verschillende DNA-reparatieprocessen 13,14,15,16. DNA-moleculen die gedurende het hele experiment dicht bij het oppervlak blijven liggen, door middel van continue bufferstroom of dubbele binding aan het voetstuk, maken TIRFM-beeldvorming van eiwit-DNA-interacties op reparatietussenproducten op het niveau van één molecuul mogelijk. De methode zorgt voor verbetering van de experimentele doorvoer en voorspelbaarheid, aangezien honderden DNA-moleculen ordelijk zijn uitgelijnd bij nanogefabriceerde barrières in plaats van niet-specifiek aan het oppervlak te zijn bevestigd, wat de verwerking van grote datasets verder ten goede komt.

Zorgvuldige analyse van de resulterende time-lapse-beeldreeksen levert kwantitatieve metingen op van eiwit-DNA-interacties (d.w.z. bindingslevensduur, posities, stoichiometrie, dissociatiekinetiek, translocatiesnelheden, processiviteiten van motoreiwitten en colokalisaties en interacties tussen eiwitten en/of DNA). Vergeleken met andere beeldvormingstechnieken met één molecuul die DNA-moleculen rechtstreeks aan het oppervlak binden of confocale beeldvorming combineren met krachtmanipulatie in commerciële instrumenten, is de belangrijkste afweging van DNA-gordijnen voor een hogere doorvoer het vaststellen van de technieken die nodig zijn voor de eerste set-up 13,14,15,16 . Eenmaal vastgesteld, leidt de mogelijkheid om gegevens over honderden moleculen tegelijk in één stroomcel te verzamelen echter tot aanzienlijke besparingen op de tijd die wordt besteed aan het verzamelen van gegevens.

Net als bij veel andere beeldvormingsmethoden met één molecuul, bepaalt het vermogen om een schoon oppervlak voor te bereiden grotendeels het vermogen van de gebruiker om DNA-gordijnen betrouwbaar in elkaar te zetten. In dit geval moeten schone oppervlakken niet alleen beginnen met een schone schuif, maar ook ervoor zorgen dat er geen microscopisch kleine luchtbelletjes in de kamer komen tijdens het maken van een van de vloeistofverbindingen. Ten eerste, wat betreft de netheid van de dia's, zouden de stappen die hierboven in sectie 6 zijn beschreven, voldoende moeten zijn als een routinematig reinigingsproces. Het gebruik van gefilterde oplossingen en buffers wordt ook aanbevolen. Ten tweede is het maken van druppel-tot-druppelverbindingen tijdens de bevestiging van de flowcel aan het bufferinjectiesysteem essentieel om het introduceren van luchtbellen te voorkomen. Het kan nuttig zijn om het dubbel gedestilleerde water dat wordt gebruikt voor het maken van buffers te ontgassen. Het wordt ook aanbevolen om elk injectieproces zorgvuldig te observeren om er zeker van te zijn dat er geen luchtbellen aanwezig zijn. Als een microscopisch kleine bel wordt geïntroduceerd voordat deze het middelste patroongebied bereikt, kan dit worden verholpen door buffer uit de microfluïdische poort aan de andere kant te injecteren om de bel weer naar buiten te duwen.

Een ander belangrijk aandachtspunt bij experimenten op basis van fluorescentie is signaal-ruis. Een sleutel tot het waarnemen van enkele fluorescerende eiwitten (d.w.z. GFP) bevindt zich ook in schone oppervlakken. Na langdurig gebruik hopen eiwitaggregaten zich meestal op bij de chromen barrières en sokkels. Daarom, als een sterk fluorescentiesignaal wordt waargenomen bij de barrières voorafgaand aan de toevoeging van fluorescerende eiwitten, wordt geadviseerd om objectglaasjes te behandelen met een onderdompeling van 10 minuten in een piranha-oplossing. De tijdsperiode wordt kort gehouden om te voorkomen dat de chromen functies worden uitgehold. De Piranha-wasbeurt moet worden gevolgd door de reguliere reinigingsprocedure.

Nanofabricage met behulp van elektronenbundellithografie kan een uitdaging zijn vanwege de vereisten van apparatuur en faciliteiten, evenals bestaande expertise op het gebied van materiaalwetenschap. Als alternatief is een op UV-lithografie gebaseerde methode ontwikkeld voor de fabricage van chroomkenmerken voor DNA-gordijnen20. Bij dit protocol wordt ook een basispatroon geleverd voor het dubbel binden van lambda-DNA bij 12 μm (zie aanvullende informatie). Verschillende aspecten van het ontwerp van dit patroon kunnen worden aangepast aan verschillende experimentele behoeften. Deze omvatten de afstand tussen barrières en sokkels, de afstand tussen aangrenzende putten in de barrière om de DNA-dichtheid te controleren, en de vorm en grootte van sokkels om de efficiëntie van dubbele tethering te optimaliseren en de onzekerheid in dubbele tethering-lengtes te minimaliseren. Andere praktische uitdagingen kunnen zijn: de keuze van fluorescerende labelstrategieën voor eiwitten, het minimaliseren van vooringenomenheid bij handmatige gegevensanalyse en de ontwikkeling van scripts voor meer gestroomlijnde gegevensverwerking.

Hoewel het hier beschreven protocol betrekking heeft op dsDNA-substraten, zijn DNA-gordijnen op basis van ssDNA ook op grote schaal gebruikt 13,14,15,16. Bereiding van ssDNA-substraten maakt gebruik van rollende cirkelreplicatie van het M13 ssDNA-plasmide met gebiotinyleerde primers13. De assemblage van het ssDNA-gordijn vereist ook het gebruik van ureum en ssDNA-bindend eiwit RPA om de secundaire structuur te elimineren en het ssDNA-substraat uit te breiden13. Het kan ook mogelijk zijn om DNA-gordijnen uit te breiden tot het gebruik van RNA of DNA/RNA-hybriden voor onderzoek naar RNA-interagerende eiwitten. Zoals het er nu uitziet, kan het DNA-gordijnplatform profiteren van automatisering in het assemblageproces, zoals beschreven in sectie 5, waarvan het grootste deel bestaat uit herhaalde injecties van een standaardset buffers. Dit kan leiden tot een efficiëntere uitvoering van meerdere experimenten tegelijk. Bovendien zou een uniforme en mogelijk op machine learning gebaseerde suite van analysescripts de gegevensverwerking verder versnellen met minimale vooringenomenheid.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs bedanken de voormalige en huidige leden van het Greene-lab voor het ontwikkelen, optimaliseren en bespreken van het DNA-gordijnprotocol, en voor het becommentariëren van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Science Foundation (MCB1154511 tot E.C.G.) en de National Institutes of Health (R01CA217973 tot E.C.G.).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
nano pattern generation system softwareJC Nabity Lithography SystemsN/ANPGS 
PFA Tubing, Natural 1/16" OD x.020" IDIDEX1512L
Poly(Methyl Methacrylate), Atactic (24.3K MW)Polymer Source Inc.P9790-MMA
Quartz Microscope SlideG. Finkenbeiner Inc.N/A1" x 3" x 1 mm dik
Scanning Electron MicroscopeFEIN/ANova Nano SEM 450
Scotch Double Sided Tape, 3/4 x 300 inches3MN/A
SonicatorMisonixS-4000Voor bereiding van lipiden
SonicatorBranson1800Voor het soniceren van slides
Streptavidin from Streptomyces avidiniiSigma-AldrichS4762Opgelost in 1X PBS tot een eindconcentratie van 1 mg/mL
Sulfuric AcidAvantor - J.T.Baker9681-01
Syringe PumpKD Scientific78-0200
Syringe, 500 µL, Model 750 RN SYR, Large Removable NDL, 22 ga, 2 in, point style 2Hamilton80830Alleen gereserveerd voor gebruik met lipiden
T4 DNA Ligase (400.000 units/ml)NEBM0202S

Referenties

  1. Kowalczykowski, S. C. An Overview of the Molecular Mechanisms of Recombinational DNA Repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, 016410(2015).
  2. Ferlay, J., et al. Estimating the global cancer incidence and mortality in 2018: globocan sources and methods. International Journal of Cancer. 144, 1941-1953 (2018).
  3. Li, X., Heyer, W. D. Homologous recombination in DNA repair and DNA damage tolerance. Cell Research. 18, 99-113 (2008).
  4. Michel, B., Baoubakri, H., Baharoglu, Z., LeMasson, M., Lestini, R. Recombination proteins and rescue of arrested replication forks. DNA Repair. 6, 967-980 (2007).
  5. Paques, F., Haber, J. E. Multiple pathways of recombination induced by double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 63, 349-404 (1999).
  6. Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).
  7. Mason, J. M., et al. RAD54 family translocases counter genotoxic effects of RAD51 in human tumor cells. Nucleic Acids Research. 43, 3180-3196 (2015).
  8. Wold, M. S. Replication protein A: A heterotrimeric, single-stranded DNA-binding protein required for eukaryotic DNA metabolism. Annual Review of Biochemistry. 66, 61-92 (1997).
  9. Bianco, P. R. The tale of SSB. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 127, 111-118 (2017).
  10. Hopfner, K. P., Gerhold, C. B., Lakomek, K., Wollmann, P. Swi2/Snf2 remodelers: hybrid views on hybrid molecular machines. Current Opinion in Structural Biology. 22, 225-233 (2012).
  11. Shah, P. P., et al. Swi2/Snf2-related translocases prevent accumulation of toxic Rad51 complexes during mitotic growth. Molecular Cell. 39, 862-872 (2010).
  12. Wright, W. D., Heyer, W. D. Rad54 functions as a heteroduplex DNA pump modulated by its DNA substrates and Rad51 during D loop formation. Molecular Cell. 53, 420-432 (2014).
  13. Ma, C. J., Steinfeld, J. B., Greene, E. C. Single-Stranded DNA Curtains for Studying Homologous Recombination. Methods in Enzymology. 582, 193-219 (2017).
  14. Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. Cell. 160, 856-869 (2015).
  15. Visnapuu, M. L., Greene, E. C. Single-molecule imaging of DNA curtains reveals intrinsic energy landscapes for nucleosome deposition. Nature Structural Molecular Biology. 16, 1056-1062 (2009).
  16. Kaniecki, K., De Tullio, L., Greene, E. C. A change of view: homologous recombination at single-molecule resolution. Nature Reviews Genetics. 19, 191-207 (2018).
  17. Redding, S., et al. Surveillance and Processing of Foreign DNA by the Escherichia coli CRISPR-Cas System. Cell. 163, 854-865 (2015).
  18. Lee, J. Y. Base triplet stepping by the Rad51/RecA family of recombinases. Science. 349, 977-981 (2015).
  19. Xue, C., et al. Regulatory control of Sgs1 and Dna2 during eukaryotic DNA end resection. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 116 (13), 6091-6100 (2019).
  20. Gallardo, I. F., Finkelstein, I. J. High-Throughput Universal DNA Curtain Arrays for Single-Molecule Fluorescence Imaging. Langmuir. 31 (37), 10310-10317 (2015).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Total Internal Reflection Fluorescence MicroscopieDubbelstrengs DNA breukenGenoomintegriteitSingle Molecule ExperimentenMicroflu dische MonsterkamerSpatiotemporele InformatieProte neassemblageDNA reparatie
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen