Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Karakterisering van intrakraakbeen transport eigenschappen van Cationic Peptide Carriers

7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61340

⸱

10 augustus 2020

 ,  , 
1Department of Bioengineering, Northeastern University, 2Department of Mechanical & Industrial Engineering, Northeastern University

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol bepaalt evenwichtsopname, penetratiediepte en niet-evenwichtsdiffusiepercentage voor kationische peptidedragers in kraakbeen. Karakterisering van transporteigenschappen is van cruciaal belang voor een effectieve biologische respons. Deze methoden kunnen worden toegepast voor het ontwerpen van een optimaal geladen drug dragers voor het richten van negatief geladen weefsels.

Samenvatting

Verschillende negatief geladen weefsels in het lichaam, zoals kraakbeen, vormen een barrière voor de gerichte levering van geneesmiddelen vanwege hun hoge dichtheid van negatief geladen aggrecans en vereisen daarom verbeterde targetingmethoden om hun therapeutische respons te verhogen. Omdat kraakbeen een hoge negatieve vaste ladingsdichtheid heeft, kunnen geneesmiddelen worden gewijzigd met positief geladen geneesmiddelendragers om te profiteren van elektrostatische interacties, waardoor een verbeterd intrakraakbeentransport mogelijk is. Het bestuderen van het vervoer van drugsdragers is daarom van cruciaal belang om de werkzaamheid van geneesmiddelen te voorspellen die een biologische respons opwekken. We tonen het ontwerp van drie experimenten die de evenwichtsopname, de diepte van penetratie en niet-evenwichtsdiffusiesnelheid van kationische peptidedragers in kraakbeenexplants kunnen kwantificeren. Evenwichtsopname-experimenten bieden een maat voor de oplosconcentratie in het kraakbeen in vergelijking met het omringende bad, wat handig is voor het voorspellen van het potentieel van een geneesmiddelendrager bij het verbeteren van de therapeutische concentratie van geneesmiddelen in kraakbeen. Diepte van penetratiestudies met behulp van confocale microscopie zorgen voor de visuele weergave van 1D-oplosmiddeldiffusie van de oppervlakkige tot diepe zone van kraakbeen, wat belangrijk is om te beoordelen of solutes hun matrix- en cellulaire doelsites bereiken. Niet-evenwichtsdiffusiegraadstudies met behulp van een op maat ontworpen transportkamer maakt het mogelijk de sterkte van bindingsinteracties met de weefselmatrix te meten door de diffusiesnelheden van fluorescerende gelabelde solutes over het weefsel te karakteriseren; dit is gunstig voor het ontwerpen van dragers van optimale bindingssterkte met kraakbeen. Samen vormen de resultaten van de drie vervoersexperimenten een richtlijn voor het ontwerpen van optimaal geladen geneesmiddelendragers die profiteren van zwakke en omkeerbare ladingsinteracties voor toepassingen voor de levering van geneesmiddelen. Deze experimentele methoden kunnen ook worden toegepast om het vervoer van drugs en drug-drug carrier conjugaats te evalueren. Verder kunnen deze methoden worden aangepast voor het gebruik bij het richten van andere negatief geladen weefsels zoals meniscus, hoornvlies en de glasachtige humor.

Inleiding

Drug-levering aan negatief geladen weefsels in het lichaam blijft een uitdaging als gevolg van het onvermogen van geneesmiddelen om diep door te dringen in het weefsel om cel en matrix doelsites1te bereiken. Een aantal van deze weefsels bestaat uit dicht verpakte, negatief geladen aggrecans die een hoge negatieve vaste ladingsdichtheid (FCD)2 in het weefsel creëren en fungeren als een barrière voor de levering van de meeste macromoleculen3,4. Echter, met de hulp van positief geladen drugsdragers, kan deze negatief geladen weefselbarrière daadwerkelijk worden omgezet in een medicijndepot via elektrostatische ladingsinteracties voor aanhoudende levering van geneesmiddelen1,5,6,7( figuur1).

figure-introduction-1
Figuur 1: Op kosten gebaseerde intrakraakbeenlevering van CPC's. Intra-articulaire injectie van CPC's in de kniegewrichtruimte. Elektrostatische interacties tussen positief geladen CPC's en negatief geladen aggrecangroepen maken een snelle en volledige dieptepenetratie door kraakbeen mogelijk. Dit cijfer is gewijzigd van Vedadghavami et al4. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Onlangs, korte lengte cationic peptide dragers (CPC's) werden ontworpen met het doel van het creëren van kleine kationische domeinen in staat het dragen van grotere grootte therapeutica voor de levering aan de negatief geladen kraakbeen4. Voor effectieve levering van geneesmiddelen aan het kraakbeen voor de behandeling van heersende8,,9 en degeneratieve ziekten zoals artrose (OA)10, is het van cruciaal belang dat therapeutische concentraties van geneesmiddelen diep in het weefsel doordringen, waar een meerderheid van de kraakbeencellen (chondrocyten)11liggen. Hoewel er verschillende potentiële ziekte wijzigen van geneesmiddelen beschikbaar zijn, geen hebben opgedaan FDA goedkeuring, omdat deze niet in staat zijn om effectief te richten op hetkraakbeen 12,13. Daarom is evaluatie van de transporteigenschappen van drugsdragers noodzakelijk om de effectiviteit van geneesmiddelen te voorspellen die een therapeutische respons opwekken. Hier hebben we drie afzonderlijke experimenten ontworpen die kunnen worden gebruikt voor het beoordelen van de evenwichtsopname, de diepte van penetratie en de verspreidingsgraad van CPC's4zonder evenwicht.

Om ervoor te zorgen dat er een voldoende medicijnconcentratie in het kraakbeen is die een optimale therapeutische respons kan bieden, werden opname-experimenten ontworpen om de CPC-concentratie in kraakbeen4te kwantificeren. In dit ontwerp, na een evenwicht tussen het kraakbeen en het omringende bad, kan de totale hoeveelheid oplosmiddel in het kraakbeen (gebonden aan de matrix of vrij) worden bepaald met behulp van een opnameverhouding. Deze verhouding wordt berekend door de concentratie van oplosmiddel in het kraakbeen te normaliseren tot die van het evenwichtsbad. In principe zou neutrale oplosmiddel, waarvan de verspreiding door het kraakbeen niet wordt bijgestaan door ladingsinteracties, een opnameverhouding van minder dan 1 hebben. Omgekeerd vertonen kationische oplosmiddelen, waarvan het transport wordt verbeterd via elektrostatische interacties, een opnameverhouding van meer dan 1. Zoals blijkt uit CPC's kan het gebruik van een optimale positieve lading echter leiden tot een veel hogere opnameratio (groter dan 300)4.

Hoewel een hoge medicijnconcentratie in het kraakbeen belangrijk is voor het bereiken van therapeutisch voordeel, is het ook van cruciaal belang dat geneesmiddelen zich verspreiden door de volledige dikte van het kraakbeen. Daarom zijn studies die de diepte van penetratie laten zien nodig om ervoor te zorgen dat geneesmiddelen diep in het kraakbeen reiken, zodat de matrix- en cellulaire doellocaties kunnen worden bereikt, waardoor een effectievere therapie wordt geboden. Dit experiment was ontworpen om de eenrichtingspreiding van oplosmiddelen door kraakbeen te beoordelen, waarbij de verspreiding van geneesmiddelen in kraakbeen na intra-articulaire injectie in vivo werd gesimuleerd. Fluorescentie beeldvorming met behulp van confocale microscopie zorgt voor de evaluatie van de diepte van penetratie in kraakbeen. Netto deeltjeslading speelt een belangrijke rol bij het matigen van hoe diepe geneesmiddelen zich door de matrix kunnen verspreiden. Een optimale nettolading op basis van een weefsel FCD is vereist om zwakke-omkeerbare binding interacties tussen kationische deeltjes en de anionische weefselmatrix mogelijk te maken. Dit houdt in dat elke interactie zwak genoeg is, zodat deeltjes zich kunnen loskoppelen van de matrix, maar omkeerbaar van aard, zodat het kan binden aan een andere matrix binding site dieper in het weefsel4. Omgekeerd kan een overmatige positieve nettolading van een deeltje schadelijk zijn voor diffusie, omdat een te sterke matrixbinding het losmaken van deeltjes van de oorspronkelijke bindingsplaats in de oppervlakkige zone van kraakbeen verhindert. Dit zou resulteren in een onvoldoende biologische respons, aangezien een meerderheid van de doellocaties diep in het weefsel ligt11.

Om de sterkte van de bindende interacties verder te kwantificeren, is analyse van de verspreidingssnelheden van geneesmiddelen via kraakbeen voordelig. Niet-evenwichtsdiffusiestudies maken het mogelijk om real-time diffusiepercentages tussen verschillende oplospercentages te vergelijken. Als geneesmiddelen verspreiden door de oppervlakkige, middelste en diepe zones van kraakbeen, de aanwezigheid van bindende interacties kan sterk veranderen diffusie tarieven. Wanneer bindende interacties aanwezig zijn tussen geneesmiddelen en de kraakbeenmatrix, wordt deze gedefinieerd als de effectieve diffusiviteit (DEFF). In dit geval, zodra alle bindende plaatsen zijn bezet, wordt het verspreidingspercentage van drugs beheerst door de steady-state diffusie (DSS). Vergelijking tussen de DEFF van verschillende oplosmiddel bepaalt de relatieve bindende sterkte van de oplosmiddel met de matrix. Voor een bepaalde oplosmiddel, als de DEFF en DSS binnen dezelfde orde van grootte zijn, impliceert dit dat er minimale binding aanwezig is tussen het medicijn en de matrix tijdens diffusie. Als DEFF echter groter is dan DSS,bestaat er een aanzienlijke binding van deeltjes aan matrix.

De ontworpen experimenten individueel zorgen voor de karakterisering van het vervoer oplosbaar door het kraakbeen, echter, een holistische analyse inclusief alle resultaten is vereist voor het ontwerpen van een optimaal geladen drug drager. De zwakke en omkeerbare aard van lading interacties regelt deeltjes diffusie en zorgt voor een hoge evenwichtsopname en snelle volledige diepte penetratie door kraakbeen. Door middel van experimenten met evenwichtsopnames moeten we zoeken naar dragers die een hoge opname vertonen als gevolg van ladingsinteracties die kunnen worden geverifieerd met behulp van niet-evenwichtsdiffusieratiostudies. Deze bindende interacties moeten echter zwak en omkeerbaar van aard zijn om volledige diktepenetratie van het oplosmiddel door kraakbeen mogelijk te maken. Een ideale drug drager zou beschikken over een optimale lading die het mogelijk maakt sterk genoeg binding voor opname en hoge intra-kraakbeen drug concentraties, maar niet te sterk om volledige dikte diffusie4belemmeren. De gepresenteerde experimenten zullen helpen bij de ontwerpkenmerken voor op lading gebaseerd weefsel gericht op geneesmiddelendragers. Deze protocollen werden gebruikt voor het karakteriseren van CPC-transport viakraakbeen 4,maar deze kunnen ook worden toegepast op een verscheidenheid van geneesmiddelen en drugsdragers via kraakbeen en andere negatief geladen weefsels.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Universitaire goedkeuringen werden verkregen voor het uitvoeren van de experimenten met dode weefsels. Runderverbindingen werden commercieel verkregen uit een slachthuis.

1. Kraakbeenexplant extractie

  1. Met behulp van een scalpel (#10 blad), knippen en verwijderen van vet, spieren, ligamenten, pezen en alle andere bindweefsel om het kraakbeen bloot te stellen van de femoropatellar groef van runderkniegewrichten.
  2. Met behulp van 3 mm en 6 mm huidstoten, maak loodrecht stoten in het kraakbeen om cilindrische pluggen te extraheren. Plaats onmiddellijk de pluggen in individuele putten van een 48-put plaat met 500 μL fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) aangevuld met 1% v/v antibioticum-antimycotic.
  3. Plaats de oppervlakkige kant van een kraakbeenplug naar beneden in een put in de snijarminrichting(figuur 2). Met behulp van een scheermesje snijdt u de stekker langs het oppervlak van de snijarmmatuur om een 1 mm dik kraakbeenexplant te verkrijgen dat inclusief de oppervlakkige zone is. Herhaal dit voor elke kraakbeenplug.
  4. Bewaar kraakbeenexplants individueel in polypropyleenbuizen met 500 μL 1x PBS aangevuld met proteaseremmers (PBS-PI, 1 PI mini-tablet per 50 mL 1x PBS) bij -20 °C.
  5. Voordat u elk van de volgende transportexperimenten uitvoert, ontdooit u de explanthoudende flesjes gedurende 30 minuten in een waterbad van 37 °C.

figure-protocol-1
Figuur 2: Op maat ontworpen snijarmatuur. Ontwerpparameters van roestvrijstalen snijarmatuur die wordt gebruikt voor het snijden van kraakbeenexplants met een diameter van 3 en 6 mm. Plastic inzetstukken van verschillende dikte werden geplaatst in putten om de dikte van gesneden explants aan te passen. Roestvrijstalen cilindrische pin van <1 mm diameter werd gebruikt om explant uit de armatuur te duwen. Alle numerieke waarden worden gepresenteerd in mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

2. Evenwichtsopname van CPC's in kraakbeen

  1. Dep kraakbeenexplants (3 mm dia. X 1 mm dik.) met een delicate taakdoek om overtollige 1x PBS van het explantoppervlak te verwijderen. Met behulp van een evenwicht, snel opnemen van het natte gewicht van elke explant en plaats dan onmiddellijk in een 1x PBS bad om uitdroging te voorkomen.
  2. Bereid 30 μM-oplossingen (300 μL per explant) van fluorescerende CPC's voor in 1x PBS-PI. Gebruik RNase-vrije polypropyleenbuizen voor reconstitutie.
  3. In een 96-put plaat, pipet 300 μL van elke 30 μM CPC oplossing in afzonderlijke putten. Vermijd het gebruik van putten in de buurt van de rand van de plaat om verdamping te voorkomen. Breng met behulp van een spatel elke explant over naar de oplossing met putten.
  4. Vul de omringende putten met 300 μL 1x PBS en bedek de putplaat met deksel. Verzegel de randen van de plaat met flexibele folie om verdamping te minimaliseren.
  5. Plaats de plaat in een couveuse van 37 °C op een plaatshaker om de deeltjessedimentatie te beperken. Incubeer gedurende 24 uur onder zachte rotatie (50 tpm met een baan van 15 mm) om de evenwichtsopname van CPC's in het kraakbeen mogelijk te maken (figuur 3).
  6. Een standaardcurve genereren voor correlatie van fluorescentie tot CPC-concentratie
    1. Bereid seriële verdunningen van CPC-oplossingen van 30 μM – 0 μM (10 2-voudige verdunningen) in 1x PBS-PI in polypropyleenbuizen. Zorg ervoor dat ten minste 500 μL van elke verdunning aanwezig is.
    2. Voeg 200 μL van elke verdunning toe aan opeenvolgende putten in een zwarte 96-putplaat. Dupliceer in een andere rij om de steekproefgrootte te vergroten.
    3. Verkrijg fluorescentiemetingen van elk monster met behulp van een plaatlezer bij de excitatie en emissiegolflengten van het fluorescerende etiket met behulp van een plaatlezer.
    4. Plot fluorescentie lezing vs CPC concentratie en afleiden van een vergelijking voor het lineaire gedeelte van de curve.
      OPMERKING: Om de variabiliteit bij fluorescentiemetingen te beperken, moet u de CPC-voorraadoplossing onder dezelfde omstandigheden als de monsterplaat vóór het genereren van de standaardcurve uitbroeden.
  7. Na 24 uur incubatie, verzamel het evenwichtsbad van elke put in afzonderlijke polypropyleenbuizen.
  8. Breng 200 μL van elke oplossing over in aparte putten van een zwarte 96-putplaat. Verkrijg fluorescentiemetingen van elk monster onder dezelfde fluorescerende instellingen als voor de standaardcurve. Verdun het monster indien nodig in 1x PBS-PI om ervoor te zorgen dat de metingen binnen het lineaire gedeelte van de standaardcurve vallen.

figure-protocol-2
Figuur 3: Schematisch van experimenten met evenwichtsopname. Kraakbeenexplants (3 mm dia. x 1 mm dik) werden geplaatst in individuen putten in een 96-put plaat met fluorescerende cpc oplossing. Na 24 uur werden CPC's opgenomen door het kraakbeen, waardoor de fluorescentie van het omliggende bad werd verminderd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

3. Diepte van penetratie van CPC's in het kraakbeen

  1. Bereid 30 μM-oplossingen (300 μL per explant) van fluorescerende CPC's voor in 1x PBS-PI. Gebruik RNase-vrije polypropyleenbuizen voor reconstitutie.
  2. Met behulp van een scalpel, gesneden kraakbeen explants (6 mm diameter x 1 mm dikte) in de helft om halve schijven te maken. Houd de explant gehydrateerd met een laag van 1x PBS-PI tijdens het snijden.
  3. Lijm een halfschijf uitplanten in het midden van een put van de op maat ontworpen 1-dimensionale transportkamer met behulp van een epoxy (figuur 4, figuur 5). Zorg ervoor dat epoxy wordt toegepast op de omtrek (gebogen) kant van de explant. Verwijder overtollige lijm uit de put om contact met het diffusieoppervlak van kraakbeen te voorkomen en noteer de oppervlakkige kant van de explant.
  4. Voeg 80 μL 1x PBS-PI toe aan beide zijden van de explant. Pipette de vloeistof op en neer van de ene kant van de explant om te controleren op lekkage aan de andere kant. Als er lekkage optreedt, past u de explant aan en breng epoxy indien nodig aan.
  5. Vervang de 1x PBS-PI van de zijkant naar het oppervlakkige oppervlak van kraakbeen (stroomopwaarts) door 80 μL van 30 μM CPC-oplossing. Houd 80 μL 1x PBS-PI aan de zijkant naar de diepe zone van kraakbeen (stroomafwaarts).
  6. Plaats de transportkamer voorzichtig in een afdekbare container. Bedek de basis van de container met een laag 1x PBS om verdamping van oplossingen te voorkomen. Zorg ervoor dat er geen direct contact is tussen oplossingen van upstream- en downstreamkamers.
  7. Plaats de overdekte container op een plaatshaker om deeltjessedimentatie te beperken. Incubeer voor 4 of 24 uur bij kamertemperatuur onder zachte rotatie (50 rpm met een baan van 15 mm).
  8. Na incubatie, verwijder de explant uit de kamer en snijd ~ 100 μm slice uit het midden van de explant.
    OPMERKING: Deze dwarsdoorsnede is inclusief de oppervlakkige, midden- en diepe zones van kraakbeen.
  9. Plaats het segment tussen een glazen schuif en een coverslip. Hydrateer het segment met een laag van 1x PBS-PI.
  10. Bij 10x vergroting, beeld door de volledige dikte van het segment om z-stack van fluorescerende beelden te verkrijgen met behulp van een confocale microscoop.
  11. Met behulp van ImageJ project de gemiddelde intensiteit van de beelden binnen de z-stack om de diepte van penetratie van CPC's in kraakbeen te bepalen.
    1. Open de afbeeldingsstack door op Bestand te klikken | Open.
    2. Klik op 'Afbeelding'op de taakbalk en klik op Afbeelding | Stapels | Z Project vanuit het vervolgkeuzemenu.
    3. Invoersegmentnummers van 1 tot het uiteindelijke segment. Selecteer 'Gemiddelde intensiteit'onder projectietype. Klik op' OK.'

figure-protocol-3
Figuur 4: Op maat ontworpen 1D-transportkamer. Ontwerpparameters van PMMA 1D transportkamer met 6 individuele putten. Alle numerieke waarden worden gepresenteerd in mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-protocol-4
Figuur 5: Schematisch van diepte van penetratiestudies. Kraakbeenexplants (6 mm diameter x 1 mm dikte) werden doormidden gesneden en bevestigd aan het midden van 1D diffusive transportputten. Fluorescerend gelabelde CPC-oplossing werd toegevoegd aan de zijkant van de put in contact met de oppervlakkige zone (SZ) van kraakbeen. 1x PBS-PI werd toegevoegd aan de zijkant van de put in contact met de diepe zone (DZ) van kraakbeen. Na diffusie werd een dwarsdoorsnede van kraakbeen (3 mm x 1 mm) afgebeeld met behulp van confocale microscopie. Dit cijfer is gewijzigd van Vedadghavami et al.4 en Bajpayee et al.3Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

4. Verspreidingspercentage van CPC's zonder evenwicht in het kraakbeen

  1. Breng de twee helften van de op maat ontworpen transportkamer(figuur 6)samen om de kamer te monteren en te sluiten. Gebruik ringen, moeren en bouten om de kamer goed te sluiten met een moersleutel.
    LET OP: De transportkamer moet doorschijnend zijn om fluorescerende metingen niet te verstoren. De transportkamers die in dit protocol worden gebruikt, zijn gemaakt van polymethylmethacrylaat (PMMA).
  2. Bedek de binnenruimte van de kamer met 0,5% w/v vetvrije rundermelkoplossing in 1x PBS (2 mL voor elke kamer) gedurende 15 minuten om niet-specifieke binding van CPC's aan kamerwanden te voorkomen. Spoel vervolgens de kamer af met 1x PBS (2 mL voor elke kamer).
  3. Met behulp van de speciaal ontworpen snijarmatuur(figuur 2) en een scheermesje, snijd een 6 mm diameter kraakbeen explant (dwarsvlak) tot een dikte van 500-800 μm, inclusief de oppervlakkige zone. Laat de explant gehydrateerd met 1x PBS.
  4. Met behulp van hamer-aangedreven en huid stoten, maak pakkingen van rubberen platen zoals weergegeven in figuur 7.
  5. Monteer elke halve transportkamer met 1 grote rubberen pakking, 1 PMMA insert en 1 kleine rubberen pakking elk. Plaats de explant in de putten van de kunststof insert, met de oppervlakkige zone tegenover de stroomopwaartse kamer. Sandwich de twee helften samen om de montage te voltooien en schroef stevig met behulp van een moersleutel (Figuur 7).
  6. Vul de bovenloopkamer met 2 mL 1x PBS-PI en observeer de stroomafwaartse kamer voor lekkage van vloeistof uit de stroomopwaartse kamer. Als er lekkage aanwezig is, de kamer weer in elkaar zetten, de pakkingspositie en de dichtheid van schroeven aanpassen. Als er geen lekkage, vul de downstream kamer met 2 mL 1x PBS-PI ook.
  7. Voeg een mini-roerbar toe aan zowel boven- als stroomafwaartse kamers en plaats de kamer op een roerplaat. Lijn de kamer zo uit dat de laser van de spectrofotometer is gericht op het midden van de stroomafwaartse kamer. Plaats het signaalontvangergedeelte van de spectrofotometer achter de stroomafwaartse kamer(figuur 8).
    OPMERKING: De laser en ontvanger van de spectrofotometer moeten zijn uitgerust met de juiste filters om signalen van het fluorescerende eiwit op te wekken, uit te zenden en door te geven. Bescherm de transportkamer tegen licht met behulp van een zwarte doos tijdens het experimenteren om interferentie in fluorescentiesignaal te voorkomen. Het is de beste praktijk om de openingen op de top van de kamer te verzegelen met flexibele folie om verdamping te voorkomen.
  8. Verzamel real-time downstream fluorescentie emissiemetingen en zorg voor een stabiel signaal gedurende ten minste 5 minuten.
    OPMERKING: Aliquots uit de stroomafwaartse kamer kunnen worden verkregen en beoordeeld op fluorescentie met behulp van een plaatlezer als een op maat ontworpen spectrofotometer of doorschijnende transportkamer niet beschikbaar is.
  9. Pipette een vooraf berekend volume van de voorraad oplossing van fluorescerend getagde CPC's in de upstream kamer om een uiteindelijke concentratie van 3 μM in de upstream kamer te garanderen. Observeer het stroomafwaartse fluorescentiesignaal en laat het vervoer oplosmiddel toe om een gestage toename van de helling te bereiken.
    OPMERKING: Een dikkere kraakbeen explant zal meer tijd nodig hebben om steady-state te bereiken.
  10. Zodra de steady state is bereikt, neem 20 μL uit de upstream kamer en voeg toe aan de downstream kamer ("spike test").
    OPMERKING: Een piek in de stroomafwaartse fluorescentie zal worden waargenomen. Dit zal zorgen voor correlatie tussen fluorescentie metingen en CPC concentratie.
  11. Verzamel real-time downstream fluorescentie metingen.

figure-protocol-5
Figuur 6: Op maat ontworpen niet-evenwichtsverspreidingstransportkamer. Ontwerpparameters van PMMA non-equilibrium diffusie transportkamer. De kamer moet doorschijnend zijn om de fluorescentiemetingen niet te verstoren. De volledige transportkamer bestond uit twee identieke helften van het getoonde armatuur. Twee cilindrische roestvrijstalen pinnen (~ 2,94 mm diameter, ~ 18 mm lang) waren nodig om uitlijning en volledige sluiting van de helften van de kamer te garanderen. Vier identieke sleuven voor 6-32 draadschroeven werden gemaakt in elke hoek van de kamer voor schroef strakke montage. Alle numerieke waarden worden weergegeven in millimeters. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-protocol-6
Figuur 7: Vergadering van de transportkamer van niet-evenwichtsverspreiding. Ontwerpparameters van (A) zwarte PMMA wisselplaten en (B) grote en kleine rubberen pakkingen. De dikte van rubberen pakkingen werd aangepast om een strakke sluiting van de kamer te garanderen. Alle numerieke waarden worden weergegeven in mm. (C) Schematisch met de volgorde van de montage voor twee helften van de transportkamer met kraakbeen explant geplaatst in het midden. SZ geeft oppervlakkige zone van kraakbeen die werd geconfronteerd met de upstream kamer. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-protocol-7
Figuur 8: Schematisch van experimenten met niet-evenwichtsdiffusie. Kraakbeenexplants (6 mm diameter x 1 mm dikte) werden geplaatst in het midden van de transportkamer met het oppervlakkige oppervlak naar de stroomopwaartse kamer. Zowel up als downstream zijkanten van de kamer werden gevuld met 1x PBS-PI en gemengd met behulp van een mini roerstaaf. Met een laser wees naar de downstream kamer om fluorescerende lezingen te verzamelen, fluorescerend gelabeld CPC oplossing werd toegevoegd aan de upstream kamer. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Na evenwichtsabsorptie van CPC's door kraakbeen neemt de badfluorescentie af wanneer het oplosmiddel door het weefsel is opgenomen. Echter, als de fluorescentie waarde van het uiteindelijke bad blijft vergelijkbaar met de eerste, het geeft aan dat er geen / minimale oplosmiddel opname. Een andere bevestiging van de opname van solute is als het weefsel zichtbaar van kleur is veranderd in de kleur van de fluorescerende kleurstof. De kwantitatieve opname van oplosmiddel in kraakbeen werd bepaald aan de hand van de opnamever...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De methoden en protocollen die hier worden beschreven zijn belangrijk voor het gebied van gerichte levering van geneesmiddelen aan negatief geladen weefsels. Vanwege de hoge dichtheid van negatief geladen aggrecans aanwezig in deze weefsels, wordt een barrière gecreëerd, waardoor drugs hun cellulaire doelsites die diep in de matrix liggen, niet bereiken. Om deze nog opmerkelijke uitdaging het land aan te pakken, kunnen geneesmiddelen worden aangepast om positief geladen drugsdragers op te nemen die het vervoerspercentage...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door het Amerikaanse ministerie van Defensie door middel van de Congressionally Directed Medical Research Programs (CDMRP) onder contract W81XWH-17-1-0085, en het National Institute of Health R03 EB025903-1. AV werd gefinancierd door het College of Engineering Dean's Fellowship aan de Northeastern University.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
316 Stainless Steel SAE WasherMcMaster-Carr91950A044Voor schroefmaat nummer 5, 0,14" ID, 0,312" OD
96-Well Polystyrene PlateFisherbrand12566620Zwart
Acrylic Thick Gauge SheetReynolds PolymerN/AVoor niet-evenwichtsdiffusie en 1-D diffusietransportkamer
Antibiotic-AntimycoticGibco15240062100x
Bovine CartilageResearch 87N/A2-3 weken oud, femoropatellaire groef
Bovine Serum AlbuminFisher BioReagentsBP671-1
CPC+14LifeTeinLT1524Op maat gemaakt peptide
CPC+20LifeTeinLT1525Op maat gemaakt peptide
CPC+8LifeTeinLT1523Op maat gemaakt peptide
Delicate Task WipersKimberly-Clark Professional34155
Dermal PunchMedBladesMB5-13, 4 en 6 mm
Economy Plain Glass Microscope SlidesFisherbrand12550A3
Flat Bottom Cell Culture PlatesCorning Costar3595Heldere, 96-well
Flexible Wrapping FilmBemis Parafilm M Laboratory1337412
Gold Seal Cover GlassElectron Microscopy Sciences6378701# 1.5, 18x18 mm
Hammer-Driven Hole PunchMcMaster-Carr3427A151/2" Diameter
Hammer-Driven Hole PunchMcMaster-Carr3427A193/4" Diameter
LaserChroma TechnologyAT480/30mSpectrofotometer Laserlicht
Low-Strength Steel Hex NutMcMaster-Carr90480A0076-32 Draadmaat
LSM 700 Confocal MicroscopeZeissLSM 700
Micro Magnetic Stirring BarsBel-Art SpinbarF37119-00077x2 mm
Multipurpose Neoprene Rubber SheetMcMaster-Carr1370N121/32" Dikte
Non-Fat Dried Bovine MilkSigma AldrichM7409
Petri DishChemglass Life SciencesCGN1802145150 mm diameter
Phosphate-Buffered SalineCorning21-040-CMR1x
Plate ShakerVWR89032-088
Protease InhibitorsThermo ScientificA32953
Razor BladesFisherbrand12640
R-Cast Acrylic Thin Gauge SheetReynolds PolymerN/AZwarte transportkamerinzetstukken
RTV SiliconeLoctite234323Epoxy, Niet-corrosief, helder
ScalpelTedPella549-3#10, #11 mesjes
Signal ReceiverChroma TechnologyET515lpSpectrofotometer Laser Signaal Ontvanger
Snap-Cap Microcentrifuge TubesEppendorf223632041,5 mL
SpatulaTedPella13508
Synergy H1 Microplate ReaderBiotekH1M
Zinc-Plated Alloy Steel Socket Head ScrewMcMaster-Carr90128A1536-32 Draadmaat, 1" Lang

Referenties

  1. Bajpayee, A. G., Grodzinsky, A. J. Cartilage-targeting drug delivery: can electrostatic interactions help. Nature Reviews Rheumatology. 13 (3), 183-193 (2017).
  2. Maroudas, A. Transport of solutes through cartilage: permeability to large molecules. Journal of Anatomy. 122, Pt 2 335-347 (1976).
  3. Bajpayee, A. G., Wong, C. R., Bawendi, M. G., Frank, E. H., Grodzinsky, A. J. Avidin as a model for charge driven transport into cartilage and drug delivery for treating early stage post-traumatic osteoarthritis. Biomaterials. 35 (1), 538-549 (2014).
  4. Vedadghavami, A., et al. Cartilage penetrating cationic peptide carriers for applications in drug delivery to avascular negatively charged tissues. Acta Biomaterialia. 93, 258-269 (2019).
  5. Mehta, S., Akhtar, S., Porter, R. M., Önnerfjord, P., Bajpayee, A. G. Interleukin-1 receptor antagonist (IL-1Ra) is more effective in suppressing cytokine-induced catabolism in cartilage-synovium co-culture than in cartilage monoculture. Arthritis Research & Therapy. 21 (1), 238(2019).
  6. Vedadghavami, A., Zhang, C., Bajpayee, A. G. Overcoming negatively charged tissue barriers: Drug delivery using cationic peptides and proteins. Nano Today. 34, 100898(2020).
  7. Young, C. C., Vedadghavami, A., Bajpayee, A. G. Bioelectricity for Drug Delivery: The Promise of Cationic Therapeutics. Bioelectricity. , (2020).
  8. Felson, D. T. Osteoarthritis of the knee. New England Journal of Medicine. 354 (8), 841-848 (2006).
  9. Wieland, H. A., Michaelis, M., Kirschbaum, B. J., Rudolphi, K. A. Osteoarthritis - An untreatable disease. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (4), 331-344 (2005).
  10. Martel-Pelletier, J. Pathophysiology of osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 7 (4), 371-373 (1999).
  11. Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of articular cartilage: Structure, composition, and function. Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
  12. Chevalier, X., et al. Intraarticular injection of anakinra in osteoarthritis of the knee: A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled study. Arthritis Care and Research. 61 (3), 344-352 (2009).
  13. Cohen, S. B., et al. A randomized, double-blind study of AMG 108 (a fully human monoclonal antibody to IL-1R1) in patients with osteoarthritis of the knee. Arthritis Research and Therapy. 13 (4), 125(2011).
  14. Evans, C. H., Kraus, V. B., Setton, L. A. Progress in intra-articular therapy. Nature Reviews Rheumatology. 10 (1), 11-22 (2014).
  15. He, T., et al. Multi-arm Avidin nano-construct for intra-cartilage delivery of small molecule drugs. Journal of Controlled Release. 318, 109-123 (2020).
  16. Bajpayee, A. G., Scheu, M., Grodzinsky, A. J., Porter, R. M. A rabbit model demonstrates the influence of cartilage thickness on intra-articular drug delivery and retention within cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 33 (5), 660-667 (2015).
  17. Bajpayee, A. G., Quadir, M. A., Hammond, P. T., Grodzinsky, A. J. Charge based intra-cartilage delivery of single dose dexamethasone using Avidin nano-carriers suppresses cytokine-induced catabolism long term. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (1), 71-81 (2016).
  18. Zhang, C., et al. Avidin-biotin technology to synthesize multi-arm nano-construct for drug delivery. MethodsX. , 100882(2020).
  19. Wagner, E. K., et al. Avidin grafted dextran nanostructure enables a month-long intra-discal retention. Scientific Reports. 10.1, 1-14 (2020).
  20. Troeberg, L., Nagase, H. Proteases involved in cartilage matrix degradation in osteoarthritis. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1824 (1), 133-145 (2012).
  21. Kirk, T. B., Wilson, A. S., Stachowiak, G. The effects of dehydration on the surface morphology of articular cartilage. Journal of Orthopaedic Rheumatology. 6 (2-3), 75-80 (1993).
  22. Ateshian, G. A., Maas, S., Weiss, J. A. Solute transport across a contact interface in deformable porous media. Journal of Biomechanics. 45 (6), 1023-1027 (2012).
  23. Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Multiphasic modeling of charged solute transport across articular cartilage: Application of multi-zone finite-bath model. Journal of Biomechanics. 49 (9), 1510-1517 (2016).
  24. Arbabi, V., Pouran, B., Zadpoor, A. A., Weinans, H. An experimental and finite element protocol to investigate the transport of neutral and charged solutes across articular cartilage. Journal of Visualized Experiments. 2017 (122), (2017).
  25. Sampson, S. L., Sylvia, M., Fields, A. J. Effects of dynamic loading on solute transport through the human cartilage endplate. Journal of Biomechanics. 83, 273-279 (2019).
  26. Bajpayee, A. G., Scheu, M., Grodzinsky, A. J., Porter, R. M. Electrostatic interactions enable rapid penetration, enhanced uptake and retention of intra-articular injected avidin in rat knee joints. Journal of Orthopaedic Research : Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 32 (8), 1044-1051 (2014).
  27. Bajpayee, A. G., et al. Sustained intra-cartilage delivery of low dose dexamethasone using a cationic carrier for treatment of post traumatic osteoarthritis. European Cells & Materials. 34, 341-364 (2017).
  28. Malda, J., et al. Of Mice, Men and Elephants: The Relation between Articular Cartilage Thickness and Body Mass. PLoS One. 8 (2), 57683(2013).
  29. Frisbie, D. D., Cross, M. W., McIlwraith, C. W. A comparative study of articular cartilage thickness in the stifle of animal species used in human pre-clinical studies compared to articular cartilage thickness in the human knee. Veterinary and Comparative Orthopaedics and Traumatology. 19 (3), 142-146 (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

KraakbeinexplantatenEvenwichtsopnamePenetratiediepteNiet-evenwichtsdiffusieConfocale microscopieFluorescentiemetingenTransportkamerProteaseremmer PBSFluorescentielabeling
Karakterisering van intrakraakbeen transport eigenschappen van Cationic Peptide Carriers
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.