Methodenartikel

Continu video-elektro-encefalogram tijdens hypoxie-ischemie bij neonatale muizen

DOI:

10.3791/61346

⸱

11 juni 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, University of Virginia, 2Department of Neurology, University of Virginia, 3Neuroscience Graduate Program, University of Virginia, 4Brain Institute, University of Virginia, 5Department of Neuroscience, University of Virginia

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit manuscript beschrijft een methode voor continue video-EEG-opnames met behulp van meerdere diepte-elektroden bij neonatale muizen die hypoxie-ischemie ondergaan.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hypoxie ischemie is de meest voorkomende oorzaak van neonatale aanvallen. Diermodellen zijn cruciaal voor het begrijpen van de mechanismen en fysiologie die ten grondslag liggen aan neonatale aanvallen en hypoxie-ischemie. Dit manuscript beschrijft een methode voor continue video-elektro-encefalogram (EEG) monitoring bij neonatale muizen om aanvallen te detecteren en EEG-achtergrond te analyseren tijdens hypoxie-ischemie. Gebruik van video en EEG in combinatie maakt een beschrijving van de semiologie van de aanvallen en de bevestiging van aanvallen mogelijk. Deze methode maakt ook analyse van vermogensspectrogrammen en EEG-achtergrondpatroontrends gedurende de experimentele periode mogelijk. In dit hypoxie-ischemiemodel maakt de methode EEG-registratie voorafgaand aan letsel mogelijk om een normatieve basislijn te verkrijgen en tijdens letsel en herstel. De totale controletijd wordt beperkt door het onvermogen om pups langer dan vier uur van de moeder te scheiden. Hoewel we in dit manuscript een model van hypoxisch-ischemische aanvallen hebben gebruikt, kan deze methode voor neonatale video-EEG-monitoring worden toegepast op verschillende ziekte- en aanvalsmodellen bij knaagdieren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hypoxische ischemische encefalopathie (HIE) is een aandoening die jaarlijks 1,5 op de 1000 pasgeborenen treft en is de meest voorkomende oorzaak van neonatale aanvallen1,2. Baby's die overleven lopen risico op verschillende neurologische handicaps zoals hersenverlamming, verstandelijke beperking en epilepsie3,4,5.

Diermodellen spelen een cruciale rol bij het begrijpen en onderzoeken van de pathofysiologie van hypoxie-ischemie en neonatale aanvallen6,7. Een aangepast Vannucci-model wordt gebruikt om hypoxie-ischemie (HI) te induceren op postnatale dag 10 (p10)7,8. Muizenjongen van deze leeftijd vertalen zich neurologisch ruwweg naar de volledige term menselijke pasgeborene9.

Continue video-elektro-encefalografie (EEG) monitoring gebruikt in combinatie met dit letselmodel maakt verder begrip en karakterisering van neonatale hypoxische ischemische aanvallen mogelijk. Eerdere studies hebben verschillende methoden gebruikt voor het analyseren van neonatale aanvallen bij knaagdieren, waaronder video-opnames, beperkte EEG-opnames en telemetrie-EEG-opnames10,11,12,13,14,15,16. In het volgende manuscript bespreken we diepgaand het proces van het opnemen van continu video-EEG bij muizenpups tijdens hypoxie-ischemie. Deze techniek voor continue video-EEG-monitoring bij neonatale muisjongen kan worden toegepast op verschillende ziekte- en aanvalsmodellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierstudies werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Virginia.

1. Elektrodegebouw/kabelbouw

  1. Gebruik een unipolaire geïsoleerde roestvrijstalen draad (0,005 " kale diameter, 0,008 " gecoat) om een elektrode te maken die is verbonden met een vrouwelijke socketconnector (vrouwelijke recipiëntconnector 0,079).
  2. Gebruik een speciale op maat gemaakte kabel om dieren op de versterker aan te sluiten.
    1. Bevestig een mannelijke 4-pins connector (Male connector 0.079") aan de 4-kanaals unity gain impedantie bijpassende operationele versterker (op-amp). Bevestig een 10K weerstand aan de draden die aansluiten op de 9 V batterij. Een aardingsdraad die niet op de op-amp is aangesloten, fungeert als het middelpunt van de batterij.
    2. Sluit het ene uiteinde van de kabel (AWG, 0,012" OD) aan op de op-amp en sluit het andere uiteinde van de kabel aan op de versterker.

2. Elektrode-implantatiechirurgie

  1. Verdoof de pup (postnatale dag 9) met 4-5% isofluraan in een neerwaartse stroomkap. Injecteer de pups vóór het begin van de procedure met bupivacaïne (0,02-0,05 ml, 0,25% subcutane lokale infiltratie).
  2. Zodra het dier onbeweeglijk is, breng je over naar een stereotactisch stadium met een neuskegel. Gebruik de achterkant van de oorbalk omdat deze zacht is om het hoofd stil te houden. Op deze leeftijd hebben pups geen volledig ontwikkeld oor om het puntige uiteinde van de oorbalk te gebruiken.
  3. Zet de stroom isofluraan lager en houd deze op 2,5-3%. Houd de gestage ademhaling van de pup in de gaten tijdens de operatieprocedure. Knijp in de staart om de pijnrespons te controleren en ga vervolgens verder met incisie.
  4. Steriliseer het incisiegebied op de schedel met betadine en alcohol (3 cycli van afwisselend jodium en 70% ethanol). Drapeer het omliggende lichaamsdeel zodanig dat het incisiegebied zichtbaar is.
  5. Open de voorste-achterste hoofdhuid van iets boven de ogen en trek ongeveer 0,5 cm huid terug. Plaats de muiskop op het stereotaxische podium zodat de huid naar buiten trekt en de schedel blootlegt.
  6. Breng waterstofperoxide aan op de schedel met een wattenstaafje en schraap de schedel schoon met een scalpelmesje. De schedel is erg zacht; wees voorzichtig tijdens het schrapen.
  7. Breng één druppel (ongeveer 50 μL) lijm aan en verdeel deze over het blootgestelde schedelgebied met behulp van de applicator. Stel gedurende 40 s bloot aan UV-licht om de lijm in te stellen.
  8. Meet de coördinaten met behulp van de blootgestelde bregma als referentie. Implantaatelektroden bilateraal in het CA1-gebied van de hippocampus [-3,5 mm Dorsaal-Ventraal (DV), ±2 mm Medial-Lateraal (ML), -1,75 mm diep (D)] en bilateraal in de pariëtale cortex [-1,22 mm DV, ±0,5 mm ML, -1 mm D] en een referentie-elektrode in het cerebellum17. Gebruik een naald van 32 G om een gat te maken in het gemarkeerde gebied.
  9. Reinig het bloed van het oppervlak van de schedel. Lagere elektroden bevestigd aan de vrouwelijke socket connector in de hersenen met behulp van de stereotaxische arm en fixeren op hun plaats met tandheelkundig acryl. Implanteer de elektrode in de hersenen. De headset met aansluiting zit bovenop de schedel, aan elkaar gelijmd door tandacryl.
  10. Injecteer ketoprofen (5 mg/kg) subcutaan in het interscapulaire gebied zodra de elektrode is gefixeerd. Plaats de pups terug bij de moeder.
    OPMERKING: Introduceer de helft van het nest met de headset in één keer aan de moeder in plaats van ze één voor één voor te introduceren. Dit voorkomt dat moeder de headset van de pup beschadigt.

3. EEG-opstelling en -opname (baseline/pre-injury)

  1. Na 24 uur herstel na elektrode-implantatie plaatst u elk dier in een verwarmde (37 °C) op maat gemaakte plexiglaskamer voor EEG-opname. Deze kamer zal ook dienen als hypoxiekamer.
  2. Sluit pups in de kamer aan op een video-EEG-bewakingssysteem via een flexibele kabel (op maat gemaakte op-amp kabel).
    OPMERKING: Met de headset op zijn plaats zijn de muizen vrij mobiel en vertonen ze geen verschillen in gedrag. Eenmaal bevestigd aan de elektrodedraden, moeten de draden in de kamer tether worden aangepast om de juiste hoeveelheid speling te bieden, zodat de pup vrij door de kamer kan bewegen.
  3. Digitaliseer de EEG-gegevens op 1000 Hz met 1K-versterking met behulp van een grasversterker. Controleer het EEG-signaal (banddoorlaatfilter tussen 3-70 Hz) later met behulp van software (bijvoorbeeld LabChart Pro).
  4. Noteer een pre-verwond baseline EEG gedurende 30 minuten voorafgaand aan het loskoppelen van dieren voor de ligatieprocedure van de halsslagader.

4. Ligatie van de linker halsslagader

  1. Verdoof de pup (postnatale dag 10) met 4-5% isofluraan in een neerwaartse stroomkap en plaats ze op een speciaal ingerichte opstelling op een waterbadkussen. Plaats het dier in rugligging en zet de voorpoten vast met papieren tape.
    1. Verlaag de stroom van isofluraan tot 2-3%. Knijp in de staart voor pijnrespons en controleer de ademhaling tijdens de procedure.
  2. Steriliseer het incisiegebied (tussen de onderkaak en het sleutelbeen) aan de linkerkant van de nek met betadine en alcohol (3 cycli van afwisselend jodium en 70% ethanol).
  3. Maak een ongeveer 1 cm lange incisie aan de linkerkant van de nek met behulp van microscisors. Trek met behulp van een ontleedmicroscoop voorzichtig het onderhuidse weefsel en de huid terug om de halsslagader bloot te leggen. Zorg ervoor dat u de nervus vagus (die lateraal naar de slagader loopt) identificeert en voorzichtig scheidt en terugtrekt van de slagader.
  4. Rijg met microforceps een 5 cm lange steriele zijden hechting onder de slagader. Bind een dubbel geknoopte hechting rond de slagader om de stroom af te sluiten.
  5. Snijd de overtollige hechting en sluit de blootgestelde slagader door het onderhuidse weefsel en de huid terug te trekken. Gebruik vet bond om de incisie te verzegelen.
  6. Plaats het dier terug op continue EEG-monitoring in een kamer bij kamertemperatuur, die op een verwarmend matras wordt geplaatst. Neem spot infrarood temperatuurcontroles van de kerntemperatuur van de pup om te voorkomen dat de kamer wordt geopend. Laat het dier 1 uur herstellen voorafgaand aan hypoxie.

5. EEG en hypoxie

  1. Monitor Continu FiO2 (fractie van geïnspireerde zuurstof) in de kamer via een zuurstofmonitor.
  2. Spoel de kamer met 60 L/min van 100% N2 en 0,415 L/min voor 100% O2. Zodra de zuurstofverzadiging in de kamer 12% bereikt, verlaagt u de N2-stroom tot 10 l / min terwijl de O2-stroom ongewijzigd blijft. Houd met kleine aanpassingen de FiO2 gedurende 45 minuten op 8%.
  3. Na 45 minuten blootstelling aan hypoxie, retourneer FiO2 naar 21%.
  4. Laat pups herstellen in de kamer en controleer op EEG gedurende 2 uur post-hypoxie.
  5. Na voltooiing van de opnameperiode, koppelt u muizen los van eeg-opname en keert u terug naar de moeder.

6. EEG-analyse

  1. Analyseer het EEG-bestand met video in LabChart Pro. Laat een geblindeerde onderzoeker het EEG markeren voor aanvallen en achtergrondpatronen17. Aanvallen worden gedefinieerd als een elektrografische gebeurtenis die langer duurt dan 10 seconden met hoogfrequente ritmische scherpe golfontladingen (≥3x baseline) met duidelijke evolutie17.
  2. Laat een tweede geblindeerde onderzoeker gebeurtenissen willekeurig markeren voor overeenstemming.
  3. Bekijk de bijbehorende video voor elke gemarkeerde elekrografische gebeurtenis en analyseer volgens de neonatale gedragsmatige aanvalsscore van knaagdieren16. In het kort varieert deze score van 0-6 (immobiliteit tot ernstig tonisch-clonische gedrag). Om de semiologie van aanvallen verder te karakteriseren, analyseert u gedrag op lateraliteit (multifocale / bilaterale bewegingen versus focale / unilaterale versus gemengde).
  4. Maak een machtsspectrogram. Gebruik een snelle fouriertransformatie met een Cosine-Bell-gegevensvenster met een grootte van 1024 gegevenspunten. Maak een vloeiende x-as in het spectrogram met behulp van een vensteroverlapping van 87,5%. Druk het vermogen uit als μV218.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epileptische semiologie

Blootstelling aan neonatale hypoxie-ischemie resulteert in zowel gegeneraliseerde als focale aanvallen bij muizen (figuur 1A-C). Video-EEG-opnames maken het mogelijk om elektrografische bevindingen te correleren met gedrag op video. Dit gedrag werd gescoord met behulp van een eerder gepubliceerde neonatale knaagdiergedragstestscore (BSS)16. Naast BSS hebben we gebeurtenissen gecategoriseerd ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben een model gepresenteerd voor continue video-EEG-monitoring bij neonatale muizen tijdens hypoxisch-ischemische aanvallen. Video-analyse in combinatie met EEG maakt karakterisering van de semiologie van aanvallen mogelijk. Analyse van EEG maakt extractie van vermogensspectrogrammen en achtergrondamplitudeanalyse mogelijk.

Correcte en zorgvuldige plaatsing van elektroden is cruciaal in dit protocol, omdat letsel tijdens het plaatsen van elektroden of onnauwkeurige plaatsing de resultate...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We erkennen de volgende financieringsbronnen: NIH NINDS - K08NS101122 (JB), R01NS040337 (JK), R01NS044370 (JK), University of Virginia School of Medicine (JB).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
OPERATIE
Ball Point ApplicatorMetrex Research8300-Fi-bond applicator
Cranioplast (poeder/hars)ColteneH00383Perm Reline/Power
I-BondKulzer GmbH, Duitsland
LOOK Silk SutureSurgical Specialities CorporationSP115LOOK SP115 zwarte gevlochten zijde, niet-absorbeerbare chirurgische hechting
RS-5168 Botvin ForcepsRoboz Surgical InstrumentRS5168Pincet voor chirurgie/ligatie
RS-5138 Graefe ForcepsRoboz Surgical InstrumentRS5138Pincet voor chirurgie/ligatie
UV-licht voor I-BondBlast Lite van First MediaBL778UV-licht voor I-bond
Vannas Microdissectie schaarRoboz Surgical InstrumentRS5618Schaar voor ligatie
Vet Bond3M Vetbond1469SBVetlijm
HYPOXIA
HypoxidialStarr Life Science
ZuurstofsensorMedische productenMiniOxI- zuurstofanalysator/sensor voor hypoxie-apparaat
EEG-RECORDING
Vrouwelijke ontvanger connector 0.079"Mill-Max Manufacturing Corp832-10-024-10-001000Besteld bij Digikey
Grass VersterkerNatus Neurology IncorporatedGrass Product
LabChart ProADI InstrumentsSoftware om het systeem te bedienen
Mannelijke aansluiting 0.079"Mill-Max Manufacturing Corp833-43-024-20-001000Besteld bij Digikey
Operationele VersterkerTexas Instruments, Dallas, TX, USATLC2274CDTLC2274 Quad Low-Noise Rail-to Rail operationele versterker
Operationele VersterkerTexas Instruments, Dallas, TX, USATLC2272ACDRTLC2274 Quad Low-Noise Rail-to Rail operationele versterker
Roestvrij staal draadA-M Systems7914000.005" ongecoat/0.008" gecoat 100 ft
Ultra-flexibele draadMcMaster-Carr9564T136 Gauge draad in verschillende kleuren

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vasudevan, C., Levene, M. Epidemiology and aetiology of neonatal seizures. Seminars in Fetal & Neonatal Medicine. , (2013).
  2. Volpe, J., et al. Neonatal Seizures. Volpe's Neurology of the Newborn. , Elsevier. 275-321 (2018).
  3. Shankaran, S., et al. Network EKSNNR. Childhood outcomes after hypothermia for neonatal encephalopathy. New England Journal of Medicine. 366 (22), 2085-2092 (2012).
  4. Pappas, A., et al. Cognitive outcomes after neonatal encephalopathy. Pediatrics. 135 (3), 624-634 (2015).
  5. van Schie, P. E., et al. Long-term motor and behavioral outcome after perinatal hypoxic-ischemic encephalopathy. European Journal of Paediatric Neurology. 19 (3), 354-359 (2015).
  6. Rensing, N., et al. Longitudinal analysis of developmental changes in electroencephalography patterns and sleep-wake states of the neonatal mouse. PLoS One. 13 (11), 1-17 (2018).
  7. Rice, J. E., Vannucci, R. C., Brierley, J. B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Annals of Neurology. 9 (2), 131-141 (1981).
  8. Burnsed, J. C., et al. Hypoxia-ischemia and therapeutic hypothermia in the neonatal mouse brain--a longitudinal study. PLoS One. 10 (3), 0118889(2015).
  9. Semple, B. D., et al. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Progress in Neurobiology. , 1-16 (2013).
  10. Comi, A. M., et al. Gabapentin neuroprotection and seizure suppression in immature mouse brain ischemia. Pediatric Research. 64 (1), 81-85 (2008).
  11. Comi, A. M., et al. A new model of stroke and ischemic seizures in the immature mouse. Pediatric Neurology. 31 (4), 254-257 (2004).
  12. Kadam, S. D., White, A. M., Staley, K. J., Dudek, F. E. Continuous Electroencephalographic Monitoring with Radio-Telemetry in a Rat Model of Perinatal Hypoxia-Ischemia Reveals Progressive Post-Stroke Epilepsy. Journal of Neuroscience. 30 (1), 404-415 (2010).
  13. Burnsed, J., et al. Neuronal Circuit Activity during Neonatal Hypoxic - Ischemic Seizures in Mice. Annals of Neurology. 86, 927-938 (2019).
  14. Sampath, D., White, A. M., Raol, Y. H. Characterization of neonatal seizures in an animal model of hypoxic-ischemic encephalopathy. Epilepsia. 55 (7), 985-993 (2014).
  15. Sampath, D., Valdez, R., White, A. M., Raol, Y. H. Anticonvulsant effect of flupirtine in an animal model of neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy. Neuropharmacology. 123, 126-135 (2017).
  16. Kang, S. K., et al. and sex-dependent susceptibility to phenobarbital-resistant neonatal seizures: role of chloride co-transporters. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 1-16 (2015).
  17. Zanelli, S., Goodkin, H. P., Kowalski, S., Kapur, J. Impact of transient acute hypoxia on the developing mouse EEG. Neurobiology of Disease. 68, 37-46 (2014).
  18. Lewczuk, E., et al. EEG and behavior patterns during experimental status epilepticus. Epilepsia. 59 (2), 369-380 (2017).
  19. Wu, D., Martin, L. J., Northington, F. J., Zhang, J. Oscillating gradient diffusion MRI reveals unique microstructural information in normal and hypoxia-ischemia injured mouse brains. Magnetic Resonance in Medicine. 72 (5), 1366-1374 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Continue video EEGneonataal muismodelelektro implantatiechirurgieEEG registratiepowerspectrogramanalysedetectie van insultenligatie van de arteria carotisfractie ge nspireerde zuurstofvideo EEG monitoring

Gerelateerde artikelen