Methodenartikel

Vertering van hele muisogen voor multiparameterstroomcytometrische analyse van mononucleaire fagocyten

DOI:

10.3791/61348

⸱

17 juni 2020

 ,  , 
1Department of Ophthalmology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Medicine, Division of Rheumatology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol biedt een methode om hele ogen te verteren tot een suspensie met één cel met het oog op cytometrische analyse van de multiparameterstroom om specifieke oculaire mononucleaire fagocytische populaties te identificeren, waaronder monocyten, microglia, macrofagen en dendritische cellen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het aangeboren immuunsysteem speelt een belangrijke rol in de oculaire pathofysiologie, waaronder uveïtis, diabetische retinopathie en leeftijdsgebonden maculadegeneratie. Aangeboren immuuncellen, met name mononucleaire fagocyten, drukken overlappende celoppervlakmarkers uit, wat het identificeren van deze populaties een uitdaging maakt. Multi-parameter flow cytometrie maakt de gelijktijdige, kwantitatieve analyse van meercellige oppervlaktemarkers mogelijk om monocyten, macrofagen, microglia en dendritische cellen in muisogen te onderscheiden. Dit protocol beschrijft de enucleatie van hele muisogen, oculaire dissectie, spijsvertering in een suspensie met één cel en kleuring van de eencellige suspensie voor myeloïde celmarkers. Daarnaast leggen we de juiste methoden uit voor het bepalen van spanningen met behulp van enkele kleurregelaars en voor het afbakenen van positieve poorten met behulp van fluorescentie minus één bedieningselementen. De belangrijkste beperking van multi-parameter flow cytometrie is de afwezigheid van weefselarchitectuur. Deze beperking kan worden overwonnen door multiparameterstroomcytometrie van individuele oogcompartimenten of complementaire immunofluorescentiekleuring. Immunofluorescentie wordt echter beperkt door het gebrek aan kwantitatieve analyse en het verminderde aantal fluorforen op de meeste microscopen. We beschrijven het gebruik van multiparametrische flowcytometrie om zeer kwantitatieve analyse van mononucleaire fagocyten in laser-geïnduceerde choroïdale neovascularisatie te bieden. Bovendien kan multiparameterstroomcytometrie worden gebruikt voor de identificatie van macrofaagsubsets, fate mapping en celsortering voor transcriptomische of proteomische studies.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het aangeboren immuunsysteem omvat meerdere celtypen die complementactivatie en ontsteking stimuleren. Aangeboren immuuncellen omvatten natural killer (NK) cellen, mestcellen, basofielen, eosinofielen, neutrofielen en mononucleaire fagocyten. Mononucleaire fagocyten, die zijn samengesteld uit monocyten, macrofagen en dendritische cellen, zijn betrokken bij de pathofysiologie van meerdere oogheelkundige aandoeningen, waaronder uveïtis, diabetische retinopathie en leeftijdsgebonden maculadegeneratie (AMD)1. In dit protocol zullen we ons richten op de identificatie van mononucleaire fagocyten met behulp van multi-parameter flow cytometrische analyse in een muismodel van neovasculaire AMD2. Dit protocol is aanpasbaar voor muismodellen van diabetische retinopathie en/of uveïtis, maar uitgebreidere oculaire dissectie wordt aanbevolen vanwege de systemische aard van deze ziekten.

Mononucleaire fagocyten drukken overlappende celoppervlakmarkeringen uit. Ingezeten macrofagen en microglia van langdurig weefsel zijn afkomstig van de van de dooierzak afgeleide erytromyeloïde voorloper3, terwijl recycling van macrofagen en dendritische cellen zich onderscheidt van de van beenmerg afgeleide macrofaagdendritische celveredelvader4. Muisceloppervlakmarkeringen die gebruikelijk zijn voor monocyten, macrofagen en dendritische cellen omvatten CD45, CD11b5, F4/806, Cx3cr17en de intracellulaire marker Iba18. Om deze uitdaging het hoofd te bieden, definieert transcriptomische analyse van macrofagen, monocyten en dendritische cellen uit meerdere weefsels CD64 als een macrofaagspecifieke celoppervlakmarker6. Macrofagen zijn beschreven in de iris, choroïde, ciliaire lichaam en oogzenuw in gezonde ogen3. Als alternatief is dendritische celidentificatie moeilijker; de meest specifieke methode voor dendritische celidentificatie vereist lottoewijzing met behulp van de Zbtb46-GFP-reportermuis9. Onafhankelijk van deze melderlijn kan de expressie van CD11c en MHCII in combinatie met de afwezigheid van CD64 potentiële dendritische cellen6,10identificeren . Dendritische cellen zijn geïdentificeerd in hoornvlies, conjunctiva, iris en choroïd in normale ogen11. Microglia zijn gespecialiseerde macrofagen in het netvlies, beschermd door de bloed-retinale barrière, en afgeleid van dooierzak voorloper cellen12. Als gevolg hiervan kan retinale microglia worden onderscheiden van monocyten-afgeleide macrofagen door hun dimniveaus van CD45-expressie13 en hoge niveaus van Tmem119, die beschikbaar is als een flowcytometrie-antilichaam14. Bij microglia-activering kan CD45 echter up-regulated15 zijn en Tmem119 kan down-regulated3zijn , wat de complexiteit van microgliabiologie aantoont en dit is waarschijnlijk relevant in zowel AMD als het muismodel. Ten slotte kunnen monocyten worden onderverdeeld in ten minste twee subtypen, waaronder klassiek en niet-klassiek. Klassieke monocyten tonen CCR2+Ly6ChogeCX3CR1lage expressie, en niet-klassieke monocyten tonen CCR2-Ly6ClageCX3CR1hoge markers5.

Vanwege de noodzaak van de kwantitatieve analyse van markerexpressie, d.w.z. hoge versus lage/dimniveaus, is multiparameterstroomcytometrie de ideale methode voor discriminatie tussen monocyten, macrofagen, microglia en dendritische cellen in het oog en andere weefsels. Extra voordelen zijn de identificatie van subpopulaties, de mogelijkheid om fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) te gebruiken om celpopulaties te sorteren voor transcriptomische of proteomische analyse, en lottoewijzing. Het grootste nadeel van multi-parameter flow cytometrie is het gebrek aan weefselarchitectuur. Dit kan worden overwonnen door de oogheelkundige dissectie in de verschillende oogsubcompartementen: hoornvlies, conjunctiva, iris, lens, netvlies en choroid-sclera-complex. Bovendien kan bevestigende immunofluorescentiebeeldvorming worden uitgevoerd, maar wordt deze beperkt door het aantal markers en het gebrek aan robuuste kwantificering.

Genoombrede associatiestudies hebben meerdere complementgenen gekoppeld aan AMD16. Complement activering leidt tot anafylaxie productie, leukocyten rekrutering, en resulterende ontsteking. Als aanvulling op receptordeficiënte muizen vermindert laserletsel mononucleaire fagocytenwerving en lasergeïnduceerde choroïdale neovascularisatie (CNV) gebied17. Evenzo toont het C-C-motief chemokine receptor 2 (CCR2) knock-outmuis, die een tekort heeft aan monocytenwerving aan het weefsel, zowel verminderde mononucleaire fagocytenwerving als lasergeïnduceerde CNV-gebied18. Deze gegevens koppelen complementaire en mononucleaire fagocyten aan experimentele CNV en mogelijk neovasculaire AMD. Ter ondersteuning van deze associatie worden complementreceptoren gedyreguleerd op perifere bloedmonocyten bij patiënten met neovasculaire AMD19,20. Deze gegevens tonen een sterke associatie aan tussen AMD en mononucleaire fagocyten.

In dit manuscript zullen we het experimentele lasergeïnduceerde CNV-model gebruiken om de mononucleaire fagocytenpopulaties in het muisoog te karakteriseren met behulp van multiparameterstroomcytometrie. Lasergeïnduceerde CNV is het standaard muismodel van neovasculaire AMD, dat de werkzaamheid van de huidige eerstelijns neovasculaire AMD-therapieaantoonde 21. Dit protocol beschrijft enucleatie van muisogen, oculaire dissectie, spijsvertering in een eencellige suspensie, antilichaamkleuring, bepaling van laserspanningen met behulp van enkele kleurregelaars en gatingstrategie met behulp van fluorescentie minus één (FMO) bedieningselementen. Voor een gedetailleerde beschrijving van het lasergeïnduceerde CNV-model, zie een eerdere publicatie22. Met behulp van dit protocol definiëren we microglia, monocyten, dendritische cellen en macrofaagpopulaties. Verder zullen we MHCII en CD11c gebruiken om macrofaagsubsets verder te definiëren binnen het lasergeïnduceerde CNV-model.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle procedures werden goedgekeurd door de Northwestern University Institutional Animal Care and Use Committee. C57BL/6 muizen werden gegroepeerd in een barrièrefaciliteit in het Center for Comparative Medicine van de Northwestern University (Chicago, IL). Alle dieren waren gehuisvest in 12/12 uur lichte / donkere cyclus met gratis toegang tot voedsel en water.

1. Verzameling van oogweefsel

  1. Offer 10-12 weken oude C57BL/6J muizen van beide geslachten met gereguleerde toediening van kooldioxide totdat de muis niet meer reageert en niet meer inademt. Voer cervicale dislocatie of een andere goedgekeurde secundaire methode uit om euthanasie te garanderen.
    OPMERKING: Transcardiale perfusie kan worden uitgevoerd om circulerende leukocyten te verwijderen die zich niet in de oogweefsels bevinden. In dit experiment vermindert systemische perfusie niet het aantal microglia, monocyten, macrofagen of dendritische cellen gedetecteerd in onbehandelde of laserbehandelde hele ogen. Daarom bevinden de meeste van deze celtypen zich in de oogweefsels en deze stap is optioneel.
  2. Om de ogen te enucleeren, duwt u in de buurt van de oogkas terwijl u een paar gebogen tangen zachtjes onder het oog plaatst terwijl deze uit de socket valt. Knijp de tang gesloten onder het oog zonder het eigenlijke oog te knijpen. Losmaken van het oog van het omringende conjunctiva (zie voorafgaande publicatie)23.
  3. Trek het oog zijdelings totdat de oogzenuw de enige overgebleven verbinding is om het oog los te maken. De oogzenuw snijdt vaak met spanning, maar een kleine schaar is soms nodig om de oogzenuw te snijden. Plaats het oog in koude 1x Hank's Buffered Saline Solution (HBSS) met calcium en magnesium in 1,7 ml microcentrifugebuis.

2. Vertering van oogweefsel

  1. Bereid de vergistingsbuffer voor met 0,1 mg/ml vergistingsenzym en 0,2 mg/ml DNase in koude HBSS. Reconstitueer in eerste instantie 5 mg vergistingsenzym in 2 ml steriel water. Bereid een initiële verdunning van 10 mg/ml DNase in HBSS. Meng voor elke 10 ml van de vergistingsbuffer (voldoende voor 3 dieren) 9,4 ml koude HBSS met 0,4 ml gereconstitueerd spijsverteringsenzym en 0,2 ml verdund DNase I.
    OPMERKING: Deze concentraties werden empirisch bepaald over meerdere experimenten om optimale niveaus van antilichaamkleuring van afzonderlijke cellen te bieden, terwijl de celdood werd verminderd. Collagenase D werd geprobeerd als alternatief voor spijsverteringsenzym met verminderde levensvatbaarheid van cellen en verminderde CD45+ cellen. Zie Discussie voor meer informatie over het iteratieve proces om de spijsvertering te optimaliseren.
  2. Verwijder onder een ontledende microscoop bij 10x totale vergroting het resterende bindvlies en de oogzenuw met behulp van fijne tang en veerschaar in koude HBSS.
  3. Beweeg schone ogen naar een droge ontleedschaal of kleine weegboot. Injecteer 0,15-0,20 ml/oog van de spijsverteringsbuffer via een spuit met een naald van 30 G in de glasholte nadat er twee perforerende wonden in het oog zijn gemaakt via de visuele as en 90° van deze eerste wond voor het uitdrijven van de spijsverteringsbuffer.
  4. Gehakt hele ogen met behulp van een veerschaar en fijne tang met alle stukken kleiner dan 0,5 mm x 0,5 mm. Dissocieer lensweefsel met stompe mechanische verstoring via een tang om verstopping van pipetpunten in volgende stappen te voorkomen. Spoel voor elk monster de tang en schaar elk met 0,75 ml vergistingsbuffer in een kleine schaal. Gebruik voor elk monster een nieuw gerecht.
  5. Breng de inhoud van de schaal over in een dissociatiebuis op ijs met behulp van P1000 pipet en zorg ervoor dat er geen materiaal verloren gaat in de pipetoverdracht. Spoel de schaal af met een extra 1,5 ml vergistingsbuffer die het totale volume in de dissociatiebuis op 3,25-3,50 ml brengt.
  6. Plaats de dissociatiebuis omgekeerd op elektronische dissociator en voer cyclus "m_brain_03_01", bestaande uit 1 min unidirectionele rotatie bij 200 tpm bij kamertemperatuur, wat een vooraf geladen programma is. Zorg ervoor dat al het weefsel zich aan de onderkant van de dissociatiebuis bevindt in contact met de spijsverteringsbuffer en de rotor voor deze en alle resterende stappen.
  7. Plaats de dissociatiebuis gedurende 30 minuten in de schudincubator bij 200 tpm bij 37 °C.
  8. Herhaal stap 2.6 en 2.7 nog één keer. Na de tweede incubatie van 30 minuten voert u een laatste mechanische vergisting uit met behulp van elektronische dissociator zoals in stap 2.6.
  9. Stop de reactie door 10 ml koudestroombuffer toe te voegen en buizen op ijs te plaatsen.

3. Voorbereiding van celsuspensie

  1. Om eencellige suspensie te creëren, giet je de gestopte oogverteringsreactie door een filter van 40 μm dat bovenop een conische centrifugebuis van 50 ml is geplaatst. Duw met behulp van de zuiger uit een spuit van 2,5 ml alle resterende stukjes onverteerde oogweefsel door het filter.
  2. Was de dissociatiebuis met 10 ml Flow-buffer en spoel het filter voordat u dezelfde zuiger gebruikt om opnieuw onverteerde oogweefselstukken door het filter te laten gaan.
  3. Herhaal stap 3.2 met 5 ml flowbuffer.
  4. Was de dissociatiebuis en filter met een laatste 10 ml flowbuffer.
    OPMERKING: Het totale volume van de vergistings- en debietbuffer is ongeveer 38-40 ml voor elk monster.
  5. Centrifugeer de conische buis bij 400 x g gedurende 10 min bij 4 °C. Decanteer het supernatant zonder de celkorrel te storen.
  6. Bereid 1x lyseeroplossing door 10x lyseeroplossing toe te voegen aan steriel water. Breek de pellet af door de buis tegen een andere buis te flikkeren. Om rode bloedcellen te lyseren, voeg 1 ml 1x lyseeroplossing toe gedurende 30 s met wervelen bij kamertemperatuur (RT).
  7. Stop de reactie met 20 ml Flow buffer.
  8. Centrifugeer de conische buis bij 400 x g gedurende 10 min bij 4 °C. Decanteer het supernatant zonder de celkorrel te storen.
  9. Dissocieer de pellet door buis tegen een andere buis te flikkeren. Voeg 5 ml koude 1x HBSS per tube toe.
  10. Centrifugeerbuizen bij 400 x g gedurende 10 min bij 4 °C. Aspirate supernatant.

4. Kleuring van celsuspensie voor mononucleaire fagocyten

  1. Bereid 0,5 ml Live/Dead-vlek per monster door Live/Dead dye 1:5.000 te verdunnen in koude HBSS.
  2. Voeg live/dode vlekken toe aan elk monster met behulp van een P1000 pipet en zorg ervoor dat u de pellet volledig loskoppelt. Breng monsters over naar 1,2 ml micro-titerbuizen.
  3. Neem een kleine aliquot (10 μL) om cellen te tellen met behulp van een hemocytometer of automatische celteller (zie 4.4). Incubeer monsters met Live/Dead vlek gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
  4. Tel cellen met Trypan blauw om het aantal levende cellen per monster te bepalen.
    OPMERKING: Meestal bevatten 2 ogen van een 10-12 weken oude C57BL/6J-muis minder dan 2 x 106 levende cellen.
  5. Was monsters door 400 μL koude flowbuffer toe te voegen. Centrifugeerbuizen in een micro titer buisrek bij 400 x g gedurende 10 min bij 4 °C. Aspirateer de supernatant zonder de celkorrel te storen.
  6. Resuspend cellen volledig in 500 μL koude Flow buffer. Centrifugeerbuizen in een micro titer buisrek bij 400 x g gedurende 10 min bij 4 °C. Aspirateer de supernatant zonder de celkorrel te storen.
  7. Blokkeer tot 5 x 106 levende cellen in 50 μL Fc blok (1:50 verdunning in koude Flow buffer van gezuiverde rat anti-muis CD16/CD32). Als er meer dan 5 x 106 levende cellen zijn, verhoog dan de volumes op de juiste manier.
  8. Voeg het Fc-blok toe aan de pellet en zorg ervoor dat u het monster volledig loskoppelt. Incubeer gedurende 20 min bij 4 °C.
  9. Voeg 50 μL antilichaamkleuroplossing toe (zie tabel 1 voor keuze en hoeveelheid van elk antilichaam dat in de oplossing is opgenomen) per 5 x 106 levende cellen rechtstreeks aan cellen in Fc-blok en meng volledig. Incubeer gedurende 30 min bij 4 °C.
    OPMERKING: Antilichaamhoeveelheden zijn afhankelijk van de configuratie van de flowcytometer en moeten onafhankelijk worden getitreerd voor elk laboratorium en instrument. Zie tabel 2 voor de instrumentconfiguratie van filters en spiegels. Om antilichamen te titreren, begint u met de aanbeveling van de fabrikant en berekent u de kleuringsindex. Voer een testrun uit van verschillende antilichaamconcentraties (zowel boven als onder de aanbeveling van de fabrikant) en kies de laagste concentratie antilichamen waar de kleuringsindex wordt gehandhaafd. Zorg er ook voor dat positieve kleuring minder helder is dan de single-color controle. Gebruik niet-opgeslagen cellen om ervoor te zorgen dat negatief bevlekte cellen op schaal zijn en een piek hebben van of minder dan 1 x 102. Gebruik een fluorescentie minus één controle om de positief bevlekte cellen te definiëren.
  10. Was monsters door 700 μL koude flowbuffer toe te voegen. Centrifugeerbuizen in een micro titer buisrek bij 400 x g gedurende 10 min bij 4 °C. Aspirateer de supernatant zonder de celkorrel te storen.
  11. Optioneel kunnen de monsters na het beitsen van antilichamen worden bevestigd met 500 μL van 2% paraformaldehyde in flowbuffer. Bevestig monsters gedurende 15 minuten op kamertemperatuur. Voer vervolgens één wasbeurt uit zoals beschreven in 4.10. Bewaar vaste monsters op 4 °C. Telparels moeten worden toegevoegd op de dag van het verzamelen van stroomcytometriegegevens. Vaste monsters moeten binnen 1-2 dagen op de flowcytometer worden uitgevoerd.
    LET OP: Paraformaldehyde is corrosief en een gevaar voor de gezondheid.
  12. Was de monsters opnieuw met 500 μL koude flowbuffer. Centrifugeerbuizen in een micro titer buisrek bij 400 x g gedurende 10 min bij 4 °C. Aspirateer de helft van de supernatant zonder de celkorrel te verstoren.
  13. Resuspend pellets en overdracht naar een 96 put, U-bodem testplaat. Centrifugeerplaat op 400 x g gedurende 5 min bij 4 °C. Om de supernatant te decanteren, draait u de plaat om en in één sterke shake onttrekt u de vloeistof in een gootsteenbekken, zonder de pellet te storen.
  14. Plaats in een nieuwe 1,2 ml microtiterbuis 50 μL goed gekolkte telparels.
  15. Resuspend pellets in 96 putplaat in 200 μL koude Flow buffer. Voeg vanaf de vorige stap celmengsel toe aan de bovenkant van kralen. Run op flow cytometer in totaal volume van 250 μL / micro titer tube.

5. Verzameling van stroomcytometriegegevens

  1. Schakel flowcytometer in en bereid deze voor. De hier vermelde instructies zijn voor een gewijzigde vierlasercytometer (tabel 2).
  2. Voer een testmonster uit, dat een kleine aliquot van elk monster bevat, om ervoor te zorgen dat alle cellen voor elke detector op schaal zijn. Stel de spanningen zo in dat alle cellen op schaal zijn.
  3. Voer enkele kleurregelaars (SCC) uit voor elke fluorfore die wordt gebruikt in kleuringscocktail(tabel 3). Plaats micro titer buis in een grotere 5 ml polystyreen buis voor plaatsing op de flow cytometer fase.
    OPMERKING: Wortelfluorforen zoals BV421 (Pacific Blue), FITC, PE, Alexa647 (APC) en Alexa700 hebben niet hetzelfde antilichaam nodig als de cocktail (d.w.z. CD19 PE voor CD64 PE). Tandemfluorforen zoals PE-CF594, PE-Cy7 of APC-Cy7 vereisen echter hetzelfde antilichaam voor SCC als cocktail vanwege mogelijke dissociatie van de geconjugeerde fluorforen.
    1. Maak de SCC voor BV421 door 2 druppels compensatieparels toe te voegen aan een 1,2 ml titerbuis samen met 1 μL hamster anti-muis CD11c BV421. Compensatieparels worden gebruikt omdat CD11c BV421 een IgG lambda subtype is in plaats van kappa zoals beschreven in 5.3.3. Incubeer gedurende 15 minuten bij 4 °C. Voeg 0,2 ml stroombuffer toe.
    2. Maak de SCC voor de Live/Dead kleurstof door één druppel positieve vlekken (groene dop) van de amine reactieve kralen toe te voegen, gevolgd door 1 μL Live/Dead kleurstof. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Voeg een druppel van de negatieve kralen (witte dop) van de amine reactieve kralen toe. Voeg 0,2 ml stroombuffer toe.
    3. Maak de resterende SCC's door één druppel positieve vlekken (groene dop) toe te voegen uit de anti-rat en anti-hamster Ig kappa kralenset, gevolgd door de vermelde antilichaamhoeveelheid (tabel 3) in een 1,2 ml titerbuis. Incubeer gedurende 15 minuten bij 4 °C. Voeg een druppel van de negatieve kralen (witte dop) van de anti-rat en anti-hamster Ig kappa kraal set toe. Voeg 0,2 ml stroombuffer toe.
    4. Vortex alle kralenmengsels volledig. Bewaar SCC's tot 3 dagen bij 4 °C.
      OPMERKING: De SCC voor fluorescerende reportermuizen is onbevlekte cellen.
    5. Stel bij het uitvoeren van SCC's spanningen zo in dat het SCC-monster een piek heeft die groter is dan een fluorescentie voor een monster van cellen in hetzelfde detectorkanaal. Bovendien moeten spanningen zo worden ingesteld dat elke SCC ten minste een 0,5 Log-verschil heeft tussen de histogrampiek in het interessant kanaal ten opzichte van een ander kanaal (figuur 1).
  4. Voer monsters uit op "Low" keeping events/second onder de 4000. Als het debiet niet op de juiste manier kan worden verlaagd, verdun dan monsters met extra koudestroombuffer. Noteer het toegevoegde volume omdat dit nodig is voor de tellingsberekening (zie representatieve resultaten).
  5. Verzamel ten minste 3 x 106 gebeurtenissen per monster. Dit kan hoger zijn dan het celnummer als gevolg van pigmentkorrels en vuiltellingen als gebeurtenissen op uw cytometer.
  6. Neem een fluorescentie minus één (FMO) op voor elke andere fluorfore dan Live/Dead voor een goede gatingstrategie in rubriek 6.4. Een FMO is een monster dat is bevlekt met alle fluorforen behalve één.
  7. Reinig en schakel de stroomcytometer uit volgens de instructies van de fabrikant of faciliteit.

6. Annotatie van flowcytometriegegevens

  1. Open een nieuw werkblad met behulp van analysesoftware. Importeer FCS-bestanden uit cytometer voor alle monsters en besturingselementen met één kleur.
  2. Gebruik SCC's om een compensatiematrix te maken.
  3. Pas de compensatiematrix toe op uw bevlekte monsters en VBO's.
  4. Gebruik de VBO's om positieve vlekken te bepalen om poorten te tekenen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 1 toonde niet-gecompenseerde frequentie histogrammen voor de SCC's en cellen voor de rode laser: Alexa647, Alexa700 en APC-Cy7. In figuur 1Atoonde de magentalijn de piek van de SCC voor Alexa647, terwijl de cyaanlijn het beoogde 0,5 Log-verschil liet zien. Merk op dat de piek in Alexa700 en APC-Cy7 links (minder helder) van de cyaanlijn was. Merk ook op dat de cellen allemaal links van de magentalijn stonden. Cellen rechts van de SCC-piek werden niet geco...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multi-parameter flow cytometrie maakt de kwantitatieve analyse van meerdere celtypen in een complex weefsel mogelijk. In dit rapport beschrijven we de stroomcytometrische detectie van mononucleaire fagocytenpopulaties, waaronder monocyten, dendritische cellen en macrofaagsubsets, na laserletsel in het muisoog. Liyanage et al rapporteerden onlangs een vergelijkbare gating-strategie om neutrofielen, eosinofielen, lymfocyten, DC's, macrofagen, infiltrerende macrofagen en monocyten te detecteren27. On...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JAL werd ondersteund door NIH-subsidie K08EY030923; CMC werd ondersteund door een K01-subsidie (5K01AR060169) van het NIH National Institute of Arthritis and Musculoskeletal Diseases en een Novel Research Grant (637405) van de Lupus Research Alliance.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.6 ml microcentrifuge tubesFisher Scientific05-408-120
1.7 ml microcentrifuge tubesCostar3620
10 ml pipettesFisher Scientific431031
15 ml conicalsThermoFisher339650
1x HBSS, 500 mlGibco14025-092
2.5 ml syringeHenke Sass Wolf7886-1
20% paraformaldehyde solutionElectron Microscopy Sciences15713-S
25 ml pipettesFisher Scientific431032
30 G needleExel26437
3ml luer lock syringeFisher Scientific14955457
41 x 41 x 8 mm polystyrene weigh dishFisher Scientific08-732-112
50 ml conicalsFalcon352070
96-well, U-bottom assay plate without lidFalcon353910
Amine reactive beadsThermoFisherA10628
Analysis softwareFlowJov 10
Anti-rat and anti-hamster Ig kappa bead setBD Biosciences552845
C57BL/6J miceJackson Laboratory664
Cell counterInvitrogenAMQAX1000
Cell counter slidesInvitrogenC10283
Compensation beadsThermoFisher01-1111-42
Count beadsThermoFisher01-1234-42
Curved forcepsFisher Scientific16-100-123
Digestion enzymeSigma Aldrich5401020001
Dissecting microscopeNational Optical and Scientific Instruments, Inc.DC3-420T
Dissociation tubesMiltenyi Biotec130-096-334
DNaseRoche10104159001
Electronic dissociatorMiltenyi Biotec130-095-937
FACS Diva softwareBD Biosciences
Fc block, rat anti-mouse CD16/CD32BD Biosciences553142
Fine forcepsIntegra Miltex17035X
Flow bufferMiltenyi Biotec130-091-221
Flow cytometerBD Biosciences
Flow tubesFalcon352008
Hamster anti-mouse CD11c BV421BD Biosciences562782
Ice bucketFisher Scientific07-210-123
Live/Dead dyeThermoFisher65-0866-14
Lysing solution, 10x solutionBD Biosciences555899
Micro titer tube and rackFisher Scientific02-681-380
Mouse anti-mouse CD64 PEBioLegend139304
Mouse anti-mouse NK1.1 PECF594BD Biosciences562864
P1000 pipet tipsDenville ScientificP2404
P1000 pipettorGilsonFA10006M
P2 pipet tipseppendorf22491806
P2 pipettorGilsonFA10001M
P20 pipettorGilsonFA10003M
P200 pipet tipsDenville ScientificP2401
P200 pipettorGilsonFA10005M
Pipet manFisher ScientificFB14955202
Rat anti-mouse B220 PECF594BD Biosciences562313
Rat anti-mouse CD11b APC-Cy7BD Biosciences557657
Rat anti-mouse CD19 AlexaFluor 700BD Biosciences557958
Rat anti-mouse CD19 PEBD Biosciences553786
Rat anti-mouse CD4 PECF594BD Biosciences562314
Rat anti-mouse CD45 FITCThermoFisher11-0451-82
Rat anti-mouse CD45 PE-Cy7BD Biosciences552848
Rat anti-mouse CD8 PECF594BD Biosciences562315
Rat anti-mouse Ly6CBD Biosciences561085
Rat anti-mouse Ly6G PECF594BD Biosciences562700
Rat anti-mouse MHC II AlexaFluor 700BioLegend107622
Rat anti-mouse Siglec F PECF594BD Biosciences562757
Rat anti-mouse Tim4 AlexaFluor647BD Biosciences564178
Shaking incubatorLabnet311DS
Spring scissorsFine Science Tools15024-10
Sterile cell strainer, 40 mm nylon meshFisher Scientific22363547
Sterile water, 500 mlGibcoA12873-01
Swinging bucket centrifugeeppendorf5910 R
Trypan blue, 0.4% solutionGibco15250061

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chinnery, H. R., McMenamin, P. G., Dando, S. J. Macrophage physiology in the eye. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 469 (3-4), 501-515 (2017).
  2. Droho, S., Cuda, C. M., Perlman, H., Lavine, J. A. Monocyte-Derived Macrophages Are Necessary for Beta-Adrenergic Receptor-Driven Choroidal Neovascularization Inhibition. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (15), 5059-5069 (2019).
  3. O'Koren, E. G., et al. Microglial Function Is Distinct in Different Anatomical Locations during Retinal Homeostasis and Degeneration. Immunity. 50 (7), 723-727 (2019).
  4. Kratofil, R. M., Kubes, P., Deniset, J. F. Monocyte Conversion During Inflammation and Injury. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 35-42 (2017).
  5. Zimmermann, H. W., Trautwein, C., Tacke, F. Functional role of monocytes and macrophages for the inflammatory response in acute liver injury. Frontiers in Physiology. 3, 56(2012).
  6. Gautier, E. L., et al. Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages. Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).
  7. Sutti, S., et al. CX3CR1 Mediates the Development of Monocyte-Derived Dendritic Cells during Hepatic Inflammation. Cells. 8 (9), 1099(2019).
  8. Liu, J., et al. Myeloid Cells Expressing VEGF and Arginase-1 Following Uptake of Damaged Retinal Pigment Epithelium Suggests Potential Mechanism That Drives the Onset of Choroidal Angiogenesis in Mice. PLoS One. 8 (8), 72935(2013).
  9. Satpathy, A. T., et al. Zbtb46 expression distinguishes classical dendritic cells and their committed progenitors from other immune lineages. The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1135-1152 (2012).
  10. Krause, T. A., Alex, A. F., Engel, D. R., Kurts, C., Eter, N. VEGF-Production by CCR2-Dependent Macrophages Contributes to Laser-Induced Choroidal Neovascularization. PLoS One. 9 (4), 94313(2014).
  11. Lin, W., Liu, T., Wang, B., Bi, H. The role of ocular dendritic cells in uveitis. Immunology Letters. 209, 4-10 (2019).
  12. Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).
  13. O'Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina. Science Reports. 6, 20636(2016).
  14. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  15. Müller, A., Brandenburg, S., Turkowski, K., Müller, S., Vajkoczy, P. Resident microglia, and not peripheral macrophages, are the main source of brain tumor mononuclear cells. International Journal of Cancer. 137 (2), 278-288 (2014).
  16. McHarg, S., Clark, S. J., Day, A. J., Bishop, P. N. Age-related macular degeneration and the role of the complement system. Molecular Immunology. 67 (1), 43-50 (2015).
  17. Nozaki, M., et al. Drusen complement components C3a and C5a promote choroidal neovascularization. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (7), 2328-2333 (2006).
  18. Tsutsumi, C. The critical role of ocular-infiltrating macrophages in the development of choroidal neovascularization. Journal of Leukocyte Biology. 74 (1), 25-32 (2003).
  19. Subhi, Y., et al. Association of CD11b +Monocytes and Anti–Vascular Endothelial Growth Factor Injections in Treatment of Neovascular Age-Related Macular Degeneration and Polypoidal Choroidal Vasculopathy. JAMA Ophthalmology. 137 (5), 515-518 (2019).
  20. Singh, A., et al. Altered Expression of CD46 and CD59 on Leukocytes in Neovascular Age-Related Macular Degeneration. AJOPHT. 154 (1), 193-199 (2012).
  21. Kwak, N., Okamoto, N., Wood, J. M., Campochiaro, P. A. VEGF is major stimulator in model of choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (10), 3158-3164 (2000).
  22. Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization. Journal of Visualized Experiments. (106), e53502(2015).
  23. Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping. Journal of Visualized Experiments. (57), e3814(2011).
  24. Makinde, H. M., et al. A Novel Microglia-Specific Transcriptional Signature Correlates with Behavioral Deficits in Neuropsychiatric Lupus. Frontiers in Immunology. 11, 338-419 (2020).
  25. Sakurai, E., Anand, A., Ambati, B. K., van Rooijen, N., Ambati, J. Macrophage depletion inhibits experimental choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (8), 3578-3585 (2003).
  26. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
  27. Liyanage, S. E., et al. Flow cytometric analysis of inflammatory and resident myeloid populations in mouse ocular inflammatory models. Experimental Eye Research. 151, 160-170 (2016).
  28. Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry. Journal of Visualized Experiments. (123), e55578(2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Multi parameter flowcytometriedigestie van muisogensingle cell suspensieceloppervlaktemerkersfluorescence minus oneflowcytometrie gatingmacrofaagsubsetsidentificatie van microgliaanalyse van dendritische cellen

Gerelateerde artikelen