Methodenartikel

Een pijpleiding die bilaterale in Utero-elektroporatie gebruikt om genetische invloeden op knaagdiergedrag te ondervragen

DOI:

10.3791/61350

⸱

21 mei 2020

 ,  ,  , 
1The Graduate Program for Neuroscience, Boston University, 2Department of Biology, Boston University, 3Neurophotonics Center, Boston University, 4Center for Systems Neuroscience, Boston University, 5Research and Early Development, Biogen, 6Department Pharmacology and Experimental Therapeutics, Boston University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De rol van recent ontdekte ziekte-geassocieerde genen in de pathogenese van neuropsychiatrische aandoeningen blijft onduidelijk. Een gemodificeerde bilaterale in utero elektroporatie techniek maakt de genoverdracht in grote populaties neuronen en onderzoek van de veroorzakers van genexpressie veranderingen op sociaal gedrag mogelijk.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aangezien genoombrede associatiestudies licht werpen op de heterogene genetische onderbouwing van veel neurologische ziekten, neemt de noodzaak om de bijdrage van specifieke genen aan de ontwikkeling en functie van de hersenen te bestuderen toe. Vertrouwen op muismodellen om de rol van specifieke genetische manipulaties te bestuderen is niet altijd haalbaar, omdat transgene muislijnen vrij kostbaar zijn en veel nieuwe ziektegerelateerde genen nog geen commercieel beschikbare genetische lijnen hebben. Bovendien kan het jaren van ontwikkeling en validatie duren om een muislijn te maken. In utero biedt elektroporatie een relatief snelle en eenvoudige methode om genexpressie te manipuleren op een celspecifieke manier in vivo waarvoor alleen het ontwikkelen van een DNA-plasmide nodig is om een bepaalde genetische manipulatie te bereiken. Bilaterale in utero elektroporatie kan worden gebruikt om grote populaties van frontale cortex piramidale neuronen te targeten. Door deze genoverdrachtsmethode te combineren met gedragsbenaderingen, kan men de effecten van genetische manipulaties op de functie van prefrontale cortexnetwerken en het sociale gedrag van jonge en volwassen muizen bestuderen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genoombrede associatiestudies (GWAS) hebben geleid tot de ontdekking van nieuwe kandidaatgenen die geassocieerd zijn met hersenpathologieën1,2,3,4. Deze studies zijn bijzonder nuttig geweest bij het begrijpen van verwoestende neuropsychiatrische aandoeningen zoals schizofrenie (SCZ), waar het onderzoek naar nieuwe genen heeft gediend als startpunt voor nieuwe onderzoekslijnen en therapeutische interventie5,6. Genen met een risico op SCZ vertonen bevooroordeelde expressie in de prefrontale cortex (PFC) tijdens prenatale en vroege postnatale ontwikkeling, een regio die betrokken is bij de pathologie van verschillende neuropsychiatrische aandoeningen7. Bovendien vertonen muismodellen van psychiatrische stoornissen abnormale activiteit in PFC-netwerken6,8,9. Deze resultaten suggereren dat SZC-geassocieerde genen een rol kunnen spelen in de ontwikkelingsbedrading van deze regio. Verder onderzoek met behulp van diermodellen is nodig om de bijdrage van deze kandidaatgenen aan de vaststelling van verbindingen in de PFC te begrijpen en om te bepalen of deze genen een veroorzaker hebben in de pathogenese van neuropsychiatrische aandoeningen. Genetische manipulatietechnieken bij muizen die de studie van genexpressieveranderingen op specifieke neuronale circuits tijdens prenatale en vroege postnatale ontwikkeling mogelijk maken, zijn een veelbelovende methode om de moleculaire mechanismen te begrijpen die genexpressieveranderingen koppelen aan PFC-disfunctie.

Genetische muislijnen bieden een methode om de impact van bepaalde genen op de hersenontwikkeling en -functie te bestuderen. Het vertrouwen op transgene muizen kan echter beperkend zijn, omdat er niet altijd commercieel beschikbare lijnen zijn om de effecten van specifieke genen op de ontwikkeling van neurale circuits te onderzoeken. Bovendien kan het extreem duur en tijdrovend zijn om aangepaste muislijnen te ontwikkelen. Het gebruik van intersectionele genetische manipulatiestrategieën die transgene muizen combineren met virale benaderingen heeft een revolutie teweeggebracht in het begrip van de hersenen10,11,12. Ondanks veel vooruitgang hebben virale strategieën bepaalde beperkingen, afhankelijk van het virale vectortype, waaronder limieten in verpakkingscapaciteit die virale expressie13 en celtoxiciteit in verband met virale expressie14kunnen beperken. Bovendien vereist robuuste genexpressie met behulp van adeno-geassocieerd virus (AAV's) in de meeste experimentele omstandigheden ongeveer 2 tot 4 weken15, waardoor routinematige virale strategieën onhaalbaar zijn om genen te manipuleren tijdens de vroege postnatale ontwikkeling.

In utero elektroporatie (IUE) is een alternatieve aanpak die een snelle en goedkope genoverdracht mogelijk maakt16,17 die, in combinatie met fluorescerende etikettering en farmacogenetische of optogenetische benaderingen, een krachtig platform biedt om de functie van neuronale circuits te ontleden. Bovendien kunnen met de ontwikkeling van CRISPR-Cas9 genoombewerkingsgenen worden overexpressie of precies worden gewijzigd door celspecifieke knock-down of knock-out van specifieke genen of door de modulatie van promotors18,19. Genmanipulatiebenaderingen met behulp van IUE zijn vooral voordelig wanneer het effect van genen op neuronale circuits moet worden getest tijdens smalle ontwikkelingsvensters20. IUE is een veelzijdige techniek en overexpressie kan gemakkelijk worden bereikt door een gen in een expressievector onder een specifieke promotor in te voegen. Extra controle van genexpressie kan worden bereikt door expressie te stimuleren met behulp van promotors van verschillende sterktes of met behulp van induceerbare promotors die in staat zijn om de genexpressie tijdelijk te regelen21,22. Bovendien maakt IUE het mogelijk om cellen te targeten binnen specifieke corticale lagen, celtypen en hersengebieden, wat niet altijd haalbaar is met behulp van andere benaderingen5,17. Recente vooruitgang in de IUE-configuratie op basis van het gebruik van drie elektroden, die een efficiëntere verdeling van het elektrische veld genereert, heeft het functionele repertoire van deze methode uitgebreid en wetenschappers in staat gesteld zich te richten op nieuwe celtypen en de efficiëntie, nauwkeurigheid en het aantal cellen te verhogen dat kan worden gericht23,24. Deze techniek werd onlangs gebruikt om de veroorzaker van complementcomponent 4A (C4A), een gen gekoppeld aan SCZ , in PFC-functie en vroege cognitie5te bepalen .

Hier gepresenteerd is een experimentele pijplijn die genoverdrachtsbenaderingen combineert om grote populaties van excitatory neuronen in de frontale cortex, waaronder de PFC, te targeten met gedragsparadigma's die niet alleen de studie van veranderingen op cel- en circuitniveau mogelijk maken, maar ook mogelijk maken om gedrag te volgen tijdens de vroege postnatale ontwikkeling en volwassenheid. De eerste beschreven methode is een methode om bilaterale transfectie van grote populaties van laag (L) 2/3 piramidale neuronen in frontale corticale regio's. Vervolgens worden taken beschreven om sociaal gedrag bij juveniele en volwassen muizen te testen. Celtellingen kunnen worden verkregen na voltooiing van gedragstaken om de omvang en locatie van celtransfectie te kwantificeren. Bovendien kan het aantal getransfecteerde cellen worden gecorreleerd met gedragsgegevens om te bepalen of een groter aantal getransfecteerde cellen leidt tot grotere verstoringen in gedrag.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle experimentele protocollen werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de National Institutes of Health (NIH) voor dieronderzoek en werden goedgekeurd door de Boston University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. BEREIDING VAN DNA-oplossingen

  1. Koop een commercieel plasmide of subclone een gen van belang in plasmide met de gewenste promotor. Hier werd een plasmide gebruikt dat EGFP bevat onder de CAG-promotor (pCAG-EGFP).
    OPMERKING: Bepaal de gewenste promotor op basis van het vereiste expressieniveau. Over het algemeen kunnen plasmiden onder de CAG-promotor worden gebruikt om hoge niveaus van het transgeen te bereiken, terwijl celspecifieke promotors (bijv. synapsine voor neuronen) meestal minder actief zijn. De experimenteerder moet empirisch de juiste expressieniveaus voor elk plasmide bepalen.
  2. Transformeer bacteriën en kweek voorraden in bacteriële media met het juiste antibioticum.
    1. Verwijder competente cellen (DH5α-cellen) van -80 °C en ontdooi gedurende 20 minuten op ijs.
    2. Meng 100 pg -100 ng van het plasmide DNA met 30 μL competente cellen. Incubeer het mengsel gedurende 20 minuten op ijs.
    3. Voer een hitteschok uit door gedurende 45 s in een waterbad van 42 °C te broeden en vervolgens de buis gedurende 2 minuten terug te brengen naar ijs.
    4. Voeg 200 - 1.000 μL LB-media toe aan de getransformeerde competente cellen en groei gedurende 45 minuten bij 37 °C op een schudincubator.
    5. Plaat 200 μL van de getransformeerde cellen in een LB-agarplaat met het juiste antibioticum en incubeert de plaat 's nachts bij 37 °C.
    6. De volgende dag, incubeer één bacteriële kolonie in 200 ml LB bouillon met het juiste antibioticum bij 37 °C op een schuddende incubator 's nachts.
  3. Zuiver het plasmide DNA met behulp van een maxiprep kit.
    1. Volg de instructies in de verkregen maxiprep-kit. Voor de elutiestap mag u DNA niet in de elutiebuffer steken. In plaats daarvan, elute DNA met behulp van ofwel 200 μL steriele 1x PBS of moleculaire kwaliteit water.
    2. Zorg ervoor dat de uiteindelijke concentratie van het DNA groter is dan 1 μg/μL. Als het plasmide dat het gen van belang bevat geen reporter-gen bevat, bereid dan ook een plasmide voor om samen te transfecteren met een reportermolecuul, zoals groen fluorescerend eiwit (GFP), om de visualisatie van getransfecteerde cellen mogelijk te maken.
  4. Bereid DNA-oplossing voor op de operatie door het plasmide-DNA te verdunnen tot 1x PBS tot 1 μg/μL eindconcentratie van elk plasmide. Voeg snelgroene kleurstof toe aan de DNA-oplossing tot een uiteindelijke concentratie van 0,1%. Bereid voor bilaterale injecties 60 μL oplossing per moeder (voor ongeveer 10 pups).
    OPMERKING: Als plasmide geen reporter-gen bevat, co-elektroporaat met GFP. Co-elektroporatiepercentages zijn meestal 95% of hoger. In onze handen werd de efficiëntie van de transfectie niet beïnvloed door co-transfectie. Alle geëlektroporeerde plasmiden moeten worden verdund tot 1 μg/μL.

2. Bestellen of fokken van getimede zwangeren

  1. Als u getimede zwangermuizen bestelt, bestelt u muizen om op embryonale dag (E) 13 of eerder aan te komen, zodat de moederdieren voldoende tijd hebben om aan de huisvesting van dieren te wennen.  In dit protocol worden CD-1 outbred muizen gebruikt voor alle experimenten.
    OPMERKING: Een paar dagen van tevoren bestellen vermindert de stress van dieren en leidt tot een hogere overlevingskans van de pups.
  2. Als u getimede zwangermuizen kweekt, koppelt u vrouwelijke muizen 's nachts, eenmaal per week, met een mannetje. Controleer op de aanwezigheid van een vaginale plug op de volgende ochtend (E0.5). Bepaal de zwangerschap door het gewicht van de vrouwelijke muizen te controleren.
    OPMERKING: Verschillende muisstammen hebben verschillende gewichtstoenames tijdens de zwangerschap, dus bepaal de typische gewichtstoename voor de gebruikte muisstam.
  3. Of het nu gaat om het bestellen of fokken van de muizen, om de stress van de dammen te verminderen, plaats een nestkussen en muizenhuis in de kooi. Het verminderen van stress kan helpen de overlevingskans van de pups te verhogen.

3. Ontwerp en montage van drie tanden elektrode

  1. Gebruik titanium platen van klasse 2 met een dikte van 0,063 als voorraadmateriaal voor elektrodecontacten.
  2. Maak met behulp van standaard bewerkingstechnieken of precisie handgereedschap elektroden met de volgende afmetingen: 20 mm x 5 mm met een afgeronde punt en gegroefde rug. Verwijder eventuele ruwe randen of bramen met fijn grit schuurpapier.
  3. Om de elektrodecontacten te bekabelen, wikkelt u 22 G gestrande koperdraad rond de groeven van de elektrode en bevestigt u deze door te solderen. Bescherm dit gewricht met krimpkousen.
  4. Bevestig vervolgens de aangesloten elektrode aan autoclaveerbare, niet-geleidende tang met behulp van een extra krimpkous om de twee negatieve elektroden te maken. Bevestig de enkele positieve elektrode aan een autoclaveerbaar, niet-geleidend materiaal (zoals een tandenborstelhandvat met een afgezaagde kop). Plaats het open uiteinde van de draad met een standaard bananenstekker.

4. Voorbereiding op de operatie

  1. Breng zwangere moederdieren ten minste 30 minuten voor de operatie naar het operatiegebied om de stressniveaus na transport vanuit de dierenfaciliteit te verminderen.
  2. Steriliseer de hele operatieplaats met behulp van steriliserende kiemdoden en vervolgens 70% ethanol. Vervang handschoenen voordat u met de operatie begint.
  3. Steriliseer autoclaafgereedschappen in een glazen kraalsterilisator.
  4. Breng steriele 1x PBS (ongeveer 50 ml per dam) over op conische buizen van 50 ml en plaats in een buizenrek in het waterbad verwarmd tot 38-40 °C. Controleer de steriele zouttemperatuur met een thermometer.
  5. Schakel de waterverwarmingscirculatiepomp in, zodat deze vóór het begin van de operatie wordt opgewarmd tot 37 °C. Dit houdt de lichaamstemperatuur van de muis voor de duur van de operatie.
  6. Schakel de drukinjector en elektroporator in en zorg voor een goede werking voorafgaand aan de operatie.
  7. Draai de plasmide DNA-oplossing (verkregen in stap 1.4) kort op een tafelbladcentrifuge en plaats deze op ijs.
  8. Trek glazen pipetten op een pipettrekker zodat de punt van de getrokken glazen pipet ongeveer 50 μm in diameter is.
  9. Vul de pipet met 20-40 μL DNA-oplossing (verkregen in stap 1.4).
  10. Stel alle benodigde items in voor chirurgie, waaronder haarverwijderingslotion, jodium, 70% ethanol, katoenen swaps, oogzalf, hechtingen, gaas, enz.
  11. Bereid een operatieblad voor en vul de nodige informatie in, zoals muis-ID en -gewicht, datum van de operatie, naam van de chirurg, enz.

5. Bij utero elektroporatie chirurgie

  1. Weeg de muis voorafgaand aan de operatie af en noteer dit op het operatieblad.
  2. Verdoof een zwangere muis (E16) door inademing in een inductiekamer met 4% (v/v) zuurstof-isofluraanmengsel. Zodra de muis is geïnduceerd, gaat u naar een maskerinhalatie en houdt u isofluraan op 1-1,5% (v/v) en controleert u de ademhaling tijdens de operatie. Controleer of de muis volledig verdoofd is, de ademsnelheid moet ~ 55-65 ademhalingen per minuut zijn.
  3. Preoperatieve pijnstillers toedienen: buprenorfine (3,25 mg/kg; SC) en meloxicam (1–5 mg/kg; SC) bij een maximaal volume van 10-30 ml/kg.
  4. Gebruik ontharingscrème of gebruik voorzichtig een scheermes om de vacht uit de buik te verwijderen. Steriliseer de buik door uit te vegen met povidone-jodium en 70% ethanol en herhaal dit minstens 3 keer. Maak een steriel veld rond de buik met behulp van een steriel gaas, steriel drapen kan ook worden gebruikt.
  5. Maak een midline incisie (3-4 cm) in de buikhuid, zorg ervoor dat je de huid optilt met een tang om te voorkomen dat je door de spier snijdt. Snijd vervolgens door de spier en zorg er opnieuw voor dat de spier omhoog wordt gekomen om te voorkomen dat vitale organen worden gesneden.
  6. Trek voorzichtig de baarmoederhoorns uit de dam met behulp van ring forceps en plaats ze voorzichtig op het steriele veld, zorg ervoor dat de baarmoederhoorn wordt ondersteund met vulling en niet te ver van de dam trekt. Houd vanaf dit punt de baarmoederhoorn gedurende de rest van de operatie bevochtigd met de voorverwarmde steriele 1x PBS.
  7. Plaats een embryo met behulp van een tang of vingers. Plaats de getrokken glazen pipet voorzichtig in een hoek van 45 graden ten opzichte van het horizontale vlak van het hoofd en in de laterale ventrikel, die visueel kan worden geïdentificeerd tussen de middellijn van de hersenen en het oog. Injecteer ongeveer 2-3 μL in elke laterale ventrikel door de pipet in de ene en vervolgens de andere ventrikel (aanbevolen) te plaatsen of door de DNA-oplossing in één ventrikel te injecteren totdat deze in beide laterale ventrikels overgaat. De ventrikel is met succes gericht als er na injectie een halvemaanvorm aanwezig is.
    OPMERKING: De punt van de glazen pipet kan breken tijdens de operatie. Als dit gebeurt, vervangt u de glazen pipet en zorgt u ervoor dat de baarmoederhoorns bevochtigd blijven terwijl een nieuwe pipet wordt voorbereid en gevuld met de DNA-oplossing.
  8. Om cellen bilateraal in de frontale cortex te transfecteren, plaatst u de twee negatieve elektroden aan de zijkanten van het embryohoofd net zijdelings en licht caudaal naar de laterale ventrikels en plaatst u de positieve elektrode tussen de ogen, net voor de zich ontwikkelende snuit.
  9. Zorg ervoor dat het embryo royaal bevochtigd is. Breng vier vierkante pulsen aan (pulsduur = 50 ms duur, pulsamplitude = 36 V, interpulse interval = 500 ms).
  10. Injecteer en elektroporaat alle embryo's en ga één voor één, zodat elk embryo onmiddellijk na de injectie met de DNA-oplossing wordt geëlektroporeerd. Zodra alle embryo's geëlektroporeerd zijn, plaatst u de baarmoederhoorns voorzichtig terug in de buikholte. Bedek tijdens deze stap de buikholte in steriele PBS (1x) om de plaatsing van baarmoederhoorns te helpen.
  11. Vul de buikholte met steriele 1x PBS zodat er na het hechten geen luchtzakken meer overblijven. Hecht de spier met opneembare hechtingen en de huid met zijde niet-opneembare hechtingen.
  12. Laat de dam gedurende ten minste 1 uur volledig herstellen in een verwarmde kamer. Controleer in de volgende 48 uur regelmatig de dammen. Als de dam herstelt van de anesthesie en weer bij bewustzijn komt, zal hij beginnen te bewegen en te kloppen.
  13. Dien postoperatieve pijnstillers toe als dammen tekenen van pijn vertonen, zoals hun lichaam omhoog slaan en snel ademen. Alleen toedienen als er tekenen van pijn zijn, omdat SC-injecties de dammen kunnen belasten, maar indien toegediend aan de experimentele groep ook toedienen aan de controlegroep, of vice versa.

6. Vroeg sociaal gedrag testen in een maternale interactietaak

OPMERKING: Dit protocol is aangepast aan eerdere publicaties5,25. Voer deze taak uit nadat muizen zijn geboren vanaf postnatale dag (P) 18-21.

  1. Maternal homing gedrag in de maternale interactie I (MI1) taak.
    1. Zorg ervoor dat kooibed niet wordt gewijzigd in de week voordat de taak wordt uitgevoerd.
    2. Verkrijg of bouw een open veld (OF) arena die eenvoudig kan worden gereinigd (acryl wordt aanbevolen) met de volgende afmetingen: 50 x 50 x 30 cm (lengte-breedte-hoogte). Lichtomstandigheden tijdens de prestaties van gedrag kunnen variëren afhankelijk van experimentele vragen en kunnen niveaus van opwinding en angstachtig gedrag beïnvloeden. Neem gedragsexperimenten op onder een zwak licht (ongeveer 20 lux) boven het midden van de arena.
    3. Gedurende twee dagen voorafgaand aan de gedragstests, acclimatiseer de dam aan de arena door deze gedurende vijf minuten per dag onder een gaasbeker (zoals een potloodbeker) in een hoek van de arena te plaatsen.
    4. Op de testdag, die van P18-21 kan zijn, voordat muizen zijn gespeend, reinigt u de arena grondig met ontsmettende doekjes en 70% ethanol.
    5. Zet de arena op met twee tegengestelde hoeken, beide met schoon beddengoed en een hoek met bevuild nestbedden uit de huiskooi van de pup.
    6. Laat elke pup de arena 3 minuten verkennen en plaats elke pup in de neutrale, lege hoek aan het begin.
      OPMERKING: Neem het gedrag op met een videocamera op 30 fps. Maak de arena tussen elke pup grondig schoon en vervang het verse beddengoed. Wissel af welke hoek het verse versus nestbed is als controle om hoekvoorkeur te vermijden om andere redenen (d.w.z. omgevingsgeluid of licht). Als u meerdere nesten door het ontwikkelingsvenster van P18-21 uitvoert, voert u gedragsexperimenten tegelijkertijd uit tussen dagen. Zorg er ook voor dat gedurende een bepaalde dag controle- en experimentele groepen parallel worden uitgevoerd.
  2. Maternale sociale interactie in de maternale interactie II (MI2) taak
    1. Voer deze taak onmiddellijk na de MI1-taak uit.
    2. Zet de arena zo in dat één hoek een lege gaasbeker bevat en de tegenoverliggende hoek de dam onder een gaasdraadbeker bevat. Als muizen de beker kunnen verplaatsen, weeg de beker dan af met een gewicht dat aan de bovenkant van de beker kan worden geplakt om beweging te voorkomen. Zet bevuild nestbed uit huiskooi in een andere hoek.
    3. Voer de MI2-taak uit. Plaats de pup in de lege hoek en noteer het gedrag gedurende vijf minuten op 30 fps, zodat de pup kan verkennen. Voer elke pup afzonderlijk uit en maak de hele arena en gaasbekers tussen elke pup grondig schoon.

7. Het testen van volwassen sociale gedragstaak

  1. Voer sociaal gedrag voor volwassenen uit in dezelfde muizen die werden uitgevoerd in de MI1- en MI2-taak zodra ze volwassen waren (P60-P70 of ouder). De hier verzamelde gegevens werden in een apart cohort verzameld.
  2. Behandel de volwassen muizen gedurende 3 opeenvolgende dagen om gewenning aan de experimenteerder mogelijk te maken. Zorg ervoor dat alleen experimenten die bekend zijn met de muizen gedragsexperimenten uitvoeren, idealiter dezelfde persoon alle taken laten uitvoeren.
  3. Habitueer muizen gedurende 3 dagen gedurende 5 minuten elke dag naar de OF-arena.
  4. Testgedrag in een nieuwe objectherkenningstaak om algemene voortbeweging en interesse in een nieuw object te meten. Dit zal een zinvollere interpretatie van sociaal gedrag mogelijk maken als muizen een specifiek tekort hebben in sociale interacties.
    1. Plaats muizen 5 minuten in de arena met een nieuw object (klein plastic speelgoed met gladde, reinigbare oppervlakken) in een hoek van de arena. Reinig de arena grondig tussen muizen met 70% ethanol.
    2. Voor nieuwe objectherkenning plaatst u het eerder blootgestelde 'nieuwe object', dat nu bekend is, in één hoek en plaatst u een nieuw nieuw object in de tegenoverliggende hoek. Schakel voor alle taken de hoeken tussen proefversies als besturingselement.
    3. Voor nieuwe sociale interactie, zorg ervoor dat de nieuwe muizen leeftijd, stam en geslacht-afgestemd zijn en zijn geacclimateerd aan de mesh draad cup gedurende 2 opeenvolgende dagen gedurende 5 minuten per dag. Plaats voor elke proef een nieuwe muis onder een gaasdraadbeker en plaats in de tegenoverliggende hoek een lege gaasdraadbeker. Laat de muizen de arena gedurende 5 minuten verkennen tijdens het opnemen van gedrag. Maak de arena en mesh wire cups grondig schoon tussen elke proef.

8. Analyseren van gedragsgegevens

  1. Gebruik DeepLabCut (https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut) om basistracking van het lichaamsdeel uit te voeren. Gedetailleerde opmerkingen over het installeren en gebruiken van DeepLabCut zijn te vinden op de GitHub-pagina. Ook beschikbaar is een aangepaste python-gebaseerde bibliotheek 'dlc_utils' (https://github.com/balajisriram/dlc_utils) voor verdere analyse van de gegevens nadat de basisregistratie van lichaamsdelen is voltooid. Meer informatie over het gebruik van deze bibliotheek vindt u op de GitHub-pagina.
    1. Installeer DeepLabCut met behulp van het anaconda-installatieproces. Installeer een GUI-compatibele CPU-only versie van DeepLabCut en de GPU-compatibele versie voor het trainen van het netwerk.
    2. Volg de instructies in de onderstaande link om een project te maken voor het volgen van lichaamsdelen. Breifly, kies een voorbeeld van frames uit uw gegevensset en markeer handmatig de relevante lichaamsdelen in deze bemonsterde frames. Train het DeepLabCut-netwerk om de lichaamsdelen te voorspellen en te controleren of het getrainde netwerk voldoende presteert.
      https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut/blob/master/examples/Demo_yourowndata.ipynb
    3. Met het oog op het volgen van de lichaamspositie en het identificeren van eenvoudige interacties in een open veld, identificeert u het zwaartepunt van het dier, het hoofd (operationeel gedefinieerd als het middelpunt tussen de oren), de linker- en rechteroren, evenals de snuit en de basis van de staart. Het laten bijhouden van meerdere lichaamsdelen zorgt voor de juiste vervanging wanneer sommige lichaamsdelen in het frame ontbreken als gevolg van occlusie.
    4. Afgezien van lichaamsdelen van dieren, volg een verscheidenheid aan punten met betrekking tot de omgeving: zoals de randen van gedragsvakken. Deze maken een herhaalbare schatting van dergelijke punten in meerdere sessies mogelijk - zelfs als de positie van de gedragsinstelling enigszins verandert ten opzichte van de camera tussen sessies.
    5. Nadat u de lichaamsdelen hebt gevolgd op basis van de gedragsgegevens, moet u ervoor zorgen dat de voorspelde lichaamsdelenlocaties worden gefilterd op basis van het vertrouwen dat is gekoppeld aan de voorspelling op elk frame van de video. Lage betrouwbaarheidsvoorspellingen worden meestal geassocieerd met afgesloten lichaamsdelen. Vervang voor dergelijke voorspellingen een bepaald lichaamsdeel door een ander (indien een dergelijke vervanging passend is) of gebruik de locaties van andere lichaamsdelen om te voorspellen waar het relevante lichaamsdeel waarschijnlijk zal zijn. Voor de meeste open veldtoepassingen wordt het zwaartepunt van het lichaam van de knaagdieren zelden afgesloten en kan met hoge nauwkeurigheid en precisie worden voorspeld.
    6. Gebruik de voorspelde locatie van het zwaartepunt en de locatie van de bijgehouden punten in de omgeving om een aantal kenmerken van het gedrag van het dier te schatten. In de open veldgegevens kan bijvoorbeeld de tijdsderivaat van de positie worden gebruikt om de snelheid van het dier te berekenen.
  2. Om vooringenomenheid te voorkomen, voert u indien mogelijk alle experimenten "blind" uit met betrekking tot de experimentele groep, met name wanneer er een subjectief element is bij de beoordeling van de resultaten. Test op het effect van sekseverschillen op de belangrijkste experimentele uitkomsten door het bundelen van gegevens in mannelijke en vrouwelijke groepen. Alle statistische tests zijn ontworpen om een gelijk aantal dieren tussen groepen te testen.

9. Post hoc celtelling om de omvang van celtransfectie te karakteriseren

  1. Bepaal het aantal cellen dat per muis wordt getransfecteerd, omdat niet alle muizen een succesvolle transfectie hebben en er variatie zal zijn in het aantal getransfecteerde cellen. Een methode om dit te bereiken omvat het tellen van het aantal getransfecteerde neuronen in afwisselende coronale secties gevolgd door een interpolatie om het totale aantal getransfecteerde cellen te schatten. Afbeelding en tel hiervoor elke andere coronale sectie (50 μm).
    1. Gebruik transcardiale perfusies met 4% PFA om weefsel te fixeren en vervolgens de hersenen te ontleden. Na cryoprotectie, sectie de hersenen in coronale secties op 50 μm.
    2. Tel voor de frontale cortex cellen binnen +2,75 en + 1,35 mm van Bregma. Deze coördinaten bevatten frontale corticale gebieden en omvatten een deel van de somatosensorische cortex (S1).  Met behulp van deze methode waren er geen waargenomen getransfecteerde cellen in meer caudale corticale regio's of subcorticale gebieden.
    3. Zorg ervoor dat u de linkerkant van de rechterhersenhelft aanduidt, zoals het markeren van één halfrond met een naaldgat tijdens het doorsnijden, en tel cellen bilateraal. Gebruik een geautomatiseerde software voor het tellen van cellen of tel cellen handmatig en bevestig de aanwezigheid van een cellichaam met BEHULP VAN DAPI.
  2. Zodra het aantal cellen is verkregen, stelt u een drempelwaarde in voor opname. Neem bijvoorbeeld alleen muizen op die bilateraal geëlektroporated zijn in analyse. Correleer voor verdere analyse het aantal cellen dat is getransfecteerd met gedragsreacties om te zien of er een associatie is. Deze techniek zal zich richten op meerdere hersengebieden, dus het is noodzakelijk om informatie te verstrekken over welke hersengebieden genetisch zijn gemanipuleerd.
    OPMERKING: Het is mogelijk dat het manipuleren van bepaalde genen de neuronale migratie, specificatie en/of dood kan veranderen. Zorg er tijdens het tellen van cellen voor dat de anatomie van de hersenen wordt onderzocht en dat elk getransfecteerd neuron zich in de laag bevindt die zogenaamd is getransfecteerd (d.w.z. L2/3). Bruto anatomische metingen zoals corticale dikte kunnen ook worden gekwantificeerd door de afstand van de pia tot corticale L6 te meten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Succesvolle ontwikkeling en implementatie van een op maat gemaakte elektroporator en drie prong-elektrode.
Voor IEE's werd een goedkope op maat gemaakte elektroporator gebouwd op basis van een eerder beschreven ontwerp27 (figuur 1A en figuur 2). Een drie tanden elektrode werd gemaakt23,24 met behulp van plastic tang met 2 negatieve elektroden bevestigd aan de u...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hierin wordt een pijplijn beschreven die de manipulatie van nieuwe genen van belang in grote populaties frontale corticale neuronen combineert met gedragstests bij muizen. Bovendien maakt deze pijpleiding de longitudinale studie van gedrag bij dezelfde muizen mogelijk, zowel tijdens de vroege postnatale ontwikkeling als op volwassen leeftijd. Deze techniek omzeilt de noodzaak om te vertrouwen op genetische diermodellen die duur kunnen zijn in termen van tijd en kosten. De kracht van dit protocol is dat het kan worden geb...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken Lisa Kretsge voor kritische feedback en bewerking van het manuscript. We danken alle onderzoeksassistenten in het Cruz-Martín lab die van onschatbare waarde waren bij het helpen met perfusies en het tellen van gedraghersenen. We danken Andrzej Cwetsch voor de input over het ontwerp van de tripolar elektrode, en Todd Blute en de Boston University Biology Imaging Core voor het gebruik van de confocale microscoop. Dit werk werd ondersteund door een NARSAD Young Investigator Grant (AC-M, #27202), de Brenton R. Lutz Award (ALC), de I. Alden Macchi Award (ALC), de NSF NRT UtB: Neurophotonics National Research Fellowship (ALC, #DGE1633516) en het Boston University Undergraduate Research Opportunities Program (WWY). De financiers hadden geen rol bij studieontwerp, gegevensverzameling en -analyse, beslissing om het manuscript te publiceren of voor te bereiden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
13mm Silk Black Braided SutureHavel'sSB77DSuture skin
Adson ForcepsF.S.T.11006-12IUE
C270 WebcamLogitechN/ARecord behavior
ElectroporatorCustom-builtN/AZie Figuur 1 en 2 en Bullmann et al, 2015
EZ-500 Spin Column Plasmid DNA Maxi-preps Kit, 20prepsBio Basic Inc.BS466Pladmid voorbereiding
Fast Green FCFSigmaF7252-5GKleurstof voor DNA-oplossing
Fine scissors- sharpF.S.T.14060-09IUE
Fisherbrand Gauze SpongesFisher Scientific1376152IUE
Gaymar Heating/CoolingBraintreeTP-700Verwarmingskussen
Glass pipette pullerSutter Instrument,P-97IUE
Glass pipettesSutter Instrument,BF150-117-10IUE
Hair Removal LotionNairN/AHaarverwijdering
Hartman HemostatsF.S.T.13002-10IUE
Open field maze- homemade acrylic arenaCustom-builtN/A50 × 50 × 30 cm lengte-breedte-hoogte
pCAG-GFPAddgene11150Zoogdierexpressievector voor expressie van GFP
Picospritzer IIIParker HannifinN/Adrukinjector
Retractor - 2 Pronged BluntF.S.T.17023-13IUE
Ring forcepsF.S.T.11103-09IUE
Sterilizer, dry beadSigmaZ378569chirurgische instrumenten steriliseren
SUTURE, 3/0 PGA, FS-2, VIOLET FOR VET USE ONLYHavel'sHJ398Spieren sutureren
Water bathCole-ParmerEW-12105-84Steriele zoutoplossing verwarmen

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yang, Y., et al. Genetic association and meta-analysis of a schizophrenia GWAS variant rs10489202 in East Asian populations. Translational Psychiatry. 8 (1), 144(2018).
  2. Schizophrenia Working Group of the Psychiatric Genomics Consortium. Biological insights from 108 schizophrenia-associated genetic loci. Nature. 511 (7510), 421-427 (2014).
  3. Howard, D. M., et al. Genome-wide meta-analysis of depression identifies 102 independent variants and highlights the importance of the prefrontal brain regions. Nature Neuroscience. 22 (3), 343-352 (2019).
  4. Grove, J., et al. Identification of common genetic risk variants for autism spectrum disorder. Nature Genetics. 51 (3), 431-444 (2019).
  5. Comer, A. L., et al. Increased expression of schizophrenia-associated gene C4 leads to hypoconnectivity of prefrontal cortex and reduced social interaction. PLoS Biology. 18 (1), 3000604(2020).
  6. Chini, M., et al. Resolving and Rescuing Developmental Miswiring in a Mouse Model of Cognitive Impairment. Neuron. 105 (1), 60-74 (2020).
  7. Clifton, N. E., et al. Dynamic expression of genes associated with schizophrenia and bipolar disorder across development. Translational Psychiatry. 9 (1), 74(2019).
  8. Oberlander, V. C., Xu, X., Chini, M., Hanganu-Opatz, I. L. Developmental dysfunction of prefrontal-hippocampal networks in mouse models of mental illness. European Journal of Neurosciences. 50 (6), 3072-3084 (2019).
  9. Batista-Brito, R., et al. Developmental Dysfunction of VIP Interneurons Impairs Cortical Circuits. Neuron. 95 (4), 884-895 (2017).
  10. Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic Dissection of Neural Circuits: A Decade of Progress. Neuron. 98 (2), 256-281 (2018).
  11. DeNardo, L., Luo, L. Genetic strategies to access activated neurons. Current Opinion in Neurobiology. 45, 121-129 (2017).
  12. Huang, Z. J., Zeng, H. Genetic approaches to neural circuits in the mouse. Annual Reviews in Neurosciences. 36, 183-215 (2013).
  13. Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Molecular Therapy. 18 (1), 80-86 (2010).
  14. Callaway, E. M., Luo, L. Monosynaptic Circuit Tracing with Glycoprotein-Deleted Rabies Viruses. Journal of Neurosciences. 35 (24), 8979-8985 (2015).
  15. Cruz-Martín, A., et al. A dedicated circuit links direction-selective retinal ganglion cells to the primary visual cortex. Nature. 507 (7492), 358-361 (2014).
  16. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nature Protocols. 1 (3), 1552-1558 (2006).
  17. Cruz-Martín, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. Delayed stabilization of dendritic spines in fragile X mice. Journal of Neurosciences. 30 (23), 7793-7803 (2010).
  18. Zhang, J. H., Adikaram, P., Pandey, M., Genis, A., Simonds, W. F. Optimization of genome editing through CRISPR-Cas9 engineering. Bioengineered. 7 (3), 166-174 (2016).
  19. Strecker, J., et al. RNA-guided DNA insertion with CRISPR-associated transposases. Science. 365 (6448), 48-53 (2019).
  20. Cruz-Martín, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. Glutamate induces the elongation of early dendritic protrusions via mGluRs in wild type mice, but not in fragile X mice. PLoS One. 7 (2), 32446(2012).
  21. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cerebral Cortex. 19, Suppl 1 120-125 (2009).
  22. Kolk, S. M., de Mooij-Malsen, A. J., Martens, G. J. Spatiotemporal Molecular Approach of in utero Electroporation to Functionally Decipher Endophenotypes in Neurodevelopmental Disorders. Frontiers in Molecular Neurosciences. 4, 37(2011).
  23. Szczurkowska, J., et al. Targeted in vivo genetic manipulation of the mouse or rat brain by in utero electroporation with a triple-electrode probe. Nature Protocols. 11 (3), 399-412 (2016).
  24. dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nature Communications. 3, 960(2012).
  25. Zhan, Y., et al. Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior. Nature Neurosciences. 17 (3), 400-406 (2014).
  26. Mathis, A., et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nature Neurosciences. 21 (9), 1281-1289 (2018).
  27. Bullmann, T., Arendt, T., Frey, U., Hanashima, C. A transportable, inexpensive electroporator for in utero electroporation. Development Growth and Differentiation. 57 (5), 369-377 (2015).
  28. Li, Z., et al. Genome-wide association analysis identifies 30 new susceptibility loci for schizophrenia. Nature Genetics. 49 (11), 1576-1583 (2017).
  29. Ripke, S., et al. Genome-wide association analysis identifies 13 new risk loci for schizophrenia. Nature Genetics. 45 (10), 1150-1159 (2013).
  30. De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. Subtype-selective electroporation of cortical interneurons. Journal of Visualized Experiment. (90), e51518(2014).
  31. Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 143 (2), 151-158 (2005).
  32. Soma, M., et al. Development of the mouse amygdala as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation. Journal of Comparative Neurology. 513 (1), 113-128 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Bilaterale elektroporatiefrontale cortexpiramidale neuronengenetische manipulatiegedragsanalysemuisembryo schirurgische procedureDNA plasmideDeepLabCut

Gerelateerde artikelen