Weefselspecifieke RNAi-tools om componenten voor systemische stresssignalering te identificeren

Samenvatting

Onderhoud van organismale proteostase vereist de coördinatie van reacties op eiwitkwaliteitscontrole, zoals chaperonne-expressie van het ene weefsel naar het andere. Hier bieden we hulpmiddelen die worden gebruikt in C. elegans die het mogelijk maken om de proteostasecapaciteit in specifieke weefsels te monitoren en intercellulaire signaalresponsen te bepalen.

Samenvatting

In het afgelopen decennium is er een transformatieve toename geweest in de kennis rond de regulatie van eiwitkwaliteitscontroleprocessen, waardoor het belang van intercellulaire signaleringsprocessen bij de regulatie van cel-niet-autonome proteostase wordt onthuld. Recente studies beginnen nu signaleringscomponenten en -routes bloot te leggen die de eiwitkwaliteitscontrole van het ene weefsel naar het andere coördineren. Het is daarom belangrijk om mechanismen en componenten van het cel-niet-autonome proteostasenetwerk (PN) en de relevantie ervan voor veroudering, stressreacties en eiwitmisvouwingsziekten te identificeren. In het laboratorium gebruiken we genetische knockdown door weefselspecifiek RNAi in combinatie met stressreporters en weefselspecifieke proteostasesensoren om dit te bestuderen. We beschrijven methodologieën om componenten van de cel-niet-autonome PN te onderzoeken en te identificeren die kunnen werken in weefsels die een stresstoestand waarnemen en in reagerende cellen om een beschermende respons te activeren. We beschrijven eerst hoe haarspeld-RNAi-constructies kunnen worden gegenereerd voor constitutieve genetische knockdown in specifieke weefsels en hoe weefselspecifieke genetische knockdown kan worden uitgevoerd door RNAi in verschillende levensfasen te voeren. Stressreporters en gedragstesten fungeren als waardevolle uitlezingen die de snelle screening van genen en aandoeningen mogelijk maken die systemische stresssignaleringsprocessen wijzigen. Ten slotte worden proteostasesensoren die in verschillende weefsels tot expressie komen, gebruikt om veranderingen in de weefselspecifieke capaciteit van de PN in verschillende stadia van ontwikkeling en veroudering te bepalen. Deze hulpmiddelen zouden dus moeten helpen bij het verduidelijken en monitoren van de capaciteit van PN in specifieke weefsels, terwijl ze helpen bij het identificeren van componenten die in verschillende weefsels functioneren om cel-niet-autonome PN in een organisme te mediëren.

Inleiding

Cellulaire proteostase wordt gecontroleerd door een ingewikkeld netwerk van componenten voor eiwitkwaliteitscontrole, zoals moleculaire chaperonnes, stressreacties en afbraakmechanismen, waaronder het ubiquitine-proteasoomsysteem (UPS) en autofagie ^1,2. De activering van stressresponsroutes, zoals de HSF-1-gemedieerde hitteschokrespons (HSR), de ongevouwen eiwitrespons van het endoplasmatisch reticulum (UPR^ER) en de mitochondriën (UPR^mito) is van vitaal belang voor cellulaire aanpassing aan en overleving tijdens omgevingsuitdagingen of eiwitmisvouwingsziekte die leidt tot toxische eiwitaggregatie 1,2,3,4,5^{, 6}. okt.

Cellulaire proteostase wordt gecoördineerd door een extra laag in meercellige organismen, zoals C. elegans, die de orkestratie van cellulaire stressreacties over verschillende weefsels vereist om beschermende eiwitkwaliteitscontrolecomponenten zoals moleculaire chaperonnes te activeren⁷. In het afgelopen decennium is niet-autonome activering van "cellulaire" stressresponsroutes waargenomen voor de hitteschokrespons (HSR), de UPR^ER en de UPR^mito, evenals transcellulaire chaperonnesignalering (TCS)3,4,7,8,9,10 . In elk geval speelt het zenuwstelsel en de signalering van de darm een cruciale rol bij het beheersen van de activering van chaperonnes over weefsels, om te beschermen tegen de toxische gevolgen van acute en chronische eiwitmisvouwingsspanningen 3,5,9,11. Deze overdracht van de neuronen naar de darm en andere cellen in de periferie kan worden bereikt door neurotransmitters, zoals het geval is voor de UPR^ER en de HSR ^6,8,11. In één vorm van niet-autonome stresssignalering in cellen, TCS, die wordt geactiveerd door de verhoogde expressie van HSP-90 in de neuronen, spelen uitgescheiden immuunpeptiden een rol bij de activering van hsp-90-chaperonne-expressie van de neuronen naar de spier⁵. Bij een andere vorm van TCS leidt het verminderen van de expressie van de belangrijkste moleculaire chaperonne hsp-90 in de darm tot een verhoogde expressie van door warmte induceerbaar hsp-70 bij permissieve temperatuur in de lichaamswandspier ^5,10. In dit specifieke geval zijn de specifieke signaalmoleculen die worden geactiveerd in de stresswaarnemende darm en de reagerende spiercellen echter onbekend.

Om vast te stellen hoe chaperonne-expressie van het ene weefsel naar het andere wordt geactiveerd, is dus een aanpak nodig die het mogelijk maakt om de capaciteit van het proteostasenetwerk (PN) en de activering van de stressrespons op weefselspecifiek niveau te monitoren. Om te onderzoeken welke stressresponsroute in de individuele weefsels wordt geactiveerd, kan een beschikbare selectie van transcriptionele chaperonnereporters gefuseerd met fluorescerende eiwitlabels worden gebruikt (zie ook Tabel 3). Deze omvatten fluorescerend gelabelde hsp-90, hsp-70 en hsp-16.2 transcriptionele reporters die de inductie van de HSR aangeven, hsp-4 die de activering van de UPR^ER aangeeft en hsp-6, die de UPR^mito aangeeft. De combinatie van deze reporters met een weefselspecifieke stressconditie maakt vervolgens een krachtige uitlezing mogelijk die individuele weefsels zal lokaliseren die reageren op een onbalans van de PN in een distaal "zender" weefsel dat de stress waarneemt. Om een stresstoestand of onbalans van de PN in een specifiek weefsel te induceren, kunnen verschillende benaderingen worden gevolgd. Een van die benaderingen is bijvoorbeeld door ectopische expressie van de geactiveerde vorm van een stresstranscriptiefactor (bijv. xbp-1's) en een andere is door het tot expressie brengen van de niveaus van een essentiële moleculaire chaperonne (bijv. hsp-90) te verminderen met behulp van weefselspecifieke promotors ^8,10. Om PN-componenten in slechts één celtype uit te putten, is weefselspecifieke knockdown door RNAi een nuttig hulpmiddel.

In C. elegans is RNAi echter systemisch; dubbelstrengs RNA in de omgeving kan het dier binnendringen en zich door het dier verspreiden om een gericht gen tot zwijgen te brengen^12,13. Deze systemische verspreiding van ingenomen dsRNA wordt gemedieerd door SID (systemische RNAi-defecte) eiwitten, zoals SID-1- en SID-2-eiwitten die dsRNA-transporters zijn, evenals SID-5, dat colokaliseert met late endosoomeiwitten en betrokken is bij de export van ingenomen dsRNA 14,15,16. SID-1 is een multi-pass transmembraaneiwit in alle cellen behalve neuronen, en is nodig voor de export van dsRNA en voor de import in cellen¹⁷. SID-2-expressie is beperkt tot de darm, waar het functioneert als een endocytische receptor voor opgenomen dsRNA uit het darmlumen in het cytoplasma van darmcellen¹⁶. Neuronen reageren niet op systemisch RNAi, en dit correleert met verminderde expressie van het transmembraaneiwit SID-1 in neuronen, dat essentieel is voor de import van dsRNA^15,18. Om weefselspecifiek RNAi effectief te laten zijn in slechts één celtype, moet de systemische verspreiding van dsRNA dus worden voorkomen. Dit kan worden bereikt door gebruik te maken van de RNAi-resistente sid-1 (pk3321)-mutant die de afgifte en opname van dsRNA in weefsels voorkomt¹⁵. Expressie van een weefselspecifiek haarspeld-RNAi-construct in deze mutant of de ectopische expressie van SID-1 in een specifiek weefsel kan dan de functie van mutant sid-1 aanvullen en weefselspecifiek RNAi¹⁹ mogelijk maken.

Dus hoe wordt dsRNA door de darm opgenomen in een sid-1-mutant met functieverlies en hoe kan het vervolgens neuronen of spiercellen bereiken die ectopisch een SID-1-constructie tot expressie brengen? In een huidig model dat dit mechanisme verklaart, wordt endocytosed dsRNA via SID-2 opgenomen in het darmcytoplasma en vervolgens geëxporteerd naar het pseudocoelom door een ander SID-1-onafhankelijk mechanisme, waarbij SID-5 en transcytose¹⁷ betrokken zijn. Omdat SID-1 dus nodig is voor dsRNA-import¹⁷, zullen alleen cellen die wildtype SID-1 tot expressie brengen, in staat zijn om het dsRNA dat uit de darm vrijkomt op te nemen in het pseudocoelom.

Hier demonstreren we het gebruik van een set tools die weefselspecifiek RNAi mogelijk maken. We gebruiken het voorbeeld van de moleculaire chaperonne Hsp90 om de constructie van haarspeld-RNAi te beschrijven die nuttig kan zijn om genexpressie in een specifiek weefsel constitutief neer te halen¹⁰. De beschreven aanpak kan worden gebruikt voor elk doelwitgen dat van belang is. De reactie van andere weefsels op de proteostase-onbalans veroorzaakt door weefselspecifiek hsp-90 RNAi kan worden onderzocht door de expressie van fluorescerend gelabelde stressreporters in andere weefsels te volgen. Als tweede methode voor weefselspecifiek RNAi laten we zien hoe het sid-1-mutantsysteem kan worden aangepast voor het voeden van RNAi-tot expressie brengende bacteriën in plaats van expressie van een haarspeld-RNAi-construct. Dit kan nuttig zijn bij het uitvoeren van een kandidaat- of genoombrede RNAi-screening om componenten te identificeren die nodig zijn voor een weefselspecifieke respons. Evenzo zullen ontwikkelingsdefecten geassocieerd met uitputting van een vitale PN-component RNAi-gemedieerde knockdown in specifieke weefsels in latere stadia van ontwikkeling vereisen. We demonstreren hoe een SID-1 complementatiesysteem kan worden gebruikt op een kandidaat-RNAi-screening voor weefselspecifieke TCS-modificatoren. In het voorbeeld streven we ernaar om signaalcomponenten te identificeren die bij knockdown in het "stress-waarnemende" zenderweefsel (darm) en het stress-beïnvloedende weefsel (spier) leiden tot de veranderde expressie van een fluorescerend gelabelde hsp-70-reporter in spiercellen.

Protocol

1. Weefselspecifiek RNAi op twee manieren: haarspeld-RNAi en weefselspecifieke SID-1-aanvulling

1. Generatie van haarspeld RNAi constructen voor weefsel-specifieke expressie in sid-1 mutanten
   1. Amplificeer de sequentie van het doelgen (bijv. hsp-90-sequentie geïsoleerd uit de hsp-90 RNAi-kloon uit de Ahringer RNAi-bibliotheek²⁰) door PCR. Plaats een niet-palindromische sequentie aan het 3'-einde van de hsp-90-sequentie , dat is een SfiI-site (ATCTA)²¹.
      OPMERKING: De primers die worden gebruikt voor het klonen van de hsp-90 met de SfiI-sequentie (onderstreept) zijn:
      as-hsp90-SfiI 5'-GGCCATCTAGGCCCTGGGTTGATTTCGAGATGCT-3'
      as-hsp90 5' TCATGGAGAACTGCGAAGC-3'.
   2. Subkloon de geamplificeerde sequentie in de vector van de commerciële kloonkit (bijv. TOPO pCR BluntII).
   3. Isoleer de omgekeerde hsp-90-sequentie van de hsp-90 RNAi-kloon (Ahringer RNAi-bibliotheek)²⁰ door restrictiedigestie met behulp van XbaI- en PstI-restrictieplaatsen en plaats deze stroomafwaarts van de hsp-90-SfiI-sequentie in de vector (uit stap 1.1.1), resulterend in een hsp-90-haarspeldconstructie (Figuur 1).
   4. Subkloon de haarspeldconstructie in een Gateway-ingangsvector pDONR221 en fuseer deze met Gateway-ingangsklonen die weefselspecifieke promotors bevatten voor beide expressies in neuronen (rgef-1p); in de darm (VHA-6P); of de bodywall-spier (unc-54p) en de unc-54 3'UTR (of een andere 3'UTR naar keuze) in een Gateway-reactie zoals beschreven in het protocol van de leverancier.
   5. Lineariseer de resulterende haarspeld RNAi-constructen (Figuur 1) met behulp van een unieke restrictieplaats buiten de coderende sequentie en micro-injecteer als een complexe array met een concentratie van 1 ng/μL haarspeld RNAi-construct, gemengd met 100 ng/μL N2 Bristol genomisch DNA (verteerd met ScaI) in een C. elegans-stam die de hsp-70p::RFP-reporter tot expressie brengt (stam AM722) en gekruist in de genetische achtergrond van sid-1 (pk3321) mutanten (stam NL3321). Voor een protocol voor het uitvoeren van micro-injectie van complexe arrays volgt u²².
   6. Gebruik als negatieve controle lege vectorhaarspeldconstructies die de niet-palindromische SfiI-bevattende sequentie (GGCCATCTAGGCC) tot expressie brengen onder controle van een weefselspecifieke promotor.
   7. Gebruik de verhoogde hsp-70p::RFP-expressie van de reporter als uitlezing om positieve transformanten te scoren die hsp-90 haarspeld-RNAi tot expressie brengen (Figuur 3). Voor een meer algemene benadering om de weefselspecifieke knock-down van een interessant gen te verifiëren, meet u de mRNA-niveaus van het hele dier met behulp van qRT-PCR van het gen van belang.
   8. Integreer de extrachromosomale array van de resulterende stam die het darmspecifieke hsp-90-haarspeldconstruct (PVH2; zie tabel 1) tot expressie brengt door gammastraling. Voor integratie van de extrachromosomale arrays in het genoom, zie²².
2. Weefselspecifieke SID-1-expressie om weefselspecifiek RNAi mogelijk te maken door bacteriën die dsRNA tot expressie brengen te voeden
   1. Subkloon het sid-1 genomische DNA van vector TU867 (unc-119p::SID-1)¹⁹ in de Gateway-ingangsvector pDONR221. Primers voor het klonen van sid-1 DNA zijn te vinden in¹⁹. Fuseer het sid-1 pDONR221-construct met Gateway-entry-klonen die spier- (myo-3p) of darm- (vha-6p) specifieke promotors bevatten en de unc-54 3'UTR (of een andere 3'UTR naar keuze) in de Gateway-reactie zoals eerder beschreven in 1.1.4.
   2. Micro-injecteer de resulterende vha-6p::SID-1::unc-54 3'UTR of myo-3p::SID-1::unc-54 3'UTR construeert in een concentratie van 30 ng/μL samen met een rode fluorescerende faryngeale co-injectiemarker (bijv. myo-2p::RFP; 5 ng/μL) in sid-1(pk3321) mutanten.
   3. Integreer de extrachromosomale darm- of spierspecifieke sid-1-arrays in het genoom zoals beschreven in²². Hier resulteerde dit in stammen PVH5 [myo-3p::SID-1; myo-2p::RFP]; sid-1(pk3321) en PVH65 [vha-6p::SID-1; myo-2p::RFP]; SID-1 (PK3321).
   4. Voor neuronspecifieke expressie van sid-1 in de sid-1(pk3321) -mutant, gebruik stam TU3401 uIs3401[unc-119p::SID-1; myo-2p::RFP]; sid-1 (pk3321) dat eerder werd gegenereerd door Calixto et ^al.19.
   5. Zoals vermeld in 1.1.7, zorgen voor weefselspecifieke knockdown van het gen van belang door mRNA-niveaus van het gewenste doelgen te meten met qRT-PCR. U kunt ook weefselspecifieke RNAi-gevoeligheid bevestigen door een fluorescerend eiwit (bijv. GFP of RFP) te gebruiken dat in hetzelfde weefsel tot expressie wordt gebracht en wormen te behandelen met GFP of RFP RNAi. Stel nematoden bloot aan GFP/RFP RNAi als larven in het gesynchroniseerde L1-stadium en groei op de RNAi-bacterie tot dag 1 van de volwassenheid (zie figuur 2). In ons geval gebruikten we stammen die SID-1 tot expressie brengen in de neuronen, spieren of darmen en kruisten we naar stammen die HSP-90::RFP tot expressie brengen in neuronen (AM987), in de darm (AM986) en in de spier (AM988).

2. Gebruik van stressreporters en proteostasesensoren om celautonome en celniet-autonome proteostase te monitoren

OPMERKING: Om de PN-capaciteit in specifieke weefsels te bewaken, gebruikt u weefselspecifieke proteostasesensoren (zoals stammen die Q44 in de darm of Q35 in de spier tot expressie brengen - zie tabel 3) en stressreporters (zoals de door warmte induceerbare hsp-70p::mCherry-reporter ; Tabel 3).

1. Genetisch kruisen van het sid-1 (pk3321) mutante allel in een proteostasesensorstam en het bevestigen van de aanwezigheid van sid-1 (pk3321) door RNAi te voeden
   1. Genetisch kruisen van de proteostasesensor/stress reporter-stam naar de genetische achtergrond van de sid-1 (pk3321) mutante stam. Om genetische kruisingen tussen verschillende transgene stammen vast te stellen, volgt u²³ voor een gedetailleerd protocol.
      OPMERKING: sid-1(pk3321) mutanten zijn resistent tegen het voeden van RNAi en daarom zal behandeling van embryo's met RNAi tegen een essentieel gen (zoals elt-2 of hsp-90) alleen leiden tot ontwikkelingsstilstanden of larvale letaliteit in stammen die heterozygoot of wildtype zijn voor het sid-1-gen .
   2. Laat 10 drachtige hermafrodieten eieren leggen op RNAi-platen tegen elt-2 of hsp-90 en controleer (lege vector; EV) RNAi-platen bij 20 °C. Verwijder de moeders na 1 - 2 uur. Gebruik N2 Bristol en de sid-1(pk3321) mutant als controles.
   3. Observeer de ontwikkeling van de larven op de RNAi-platen gedurende de komende 2-3 dagen. elt-2 RNAi zal resulteren in L1-larvale arrestatie, terwijl hsp-90 RNAi resulteert in L3-larvale arrestatie in N2 Bristol. sid-1-mutanten zullen niet worden beïnvloed door de RNAi-behandeling en zullen zich ontwikkelen tot zwangere volwassenen.
      OPMERKING: C. elegans homozygoot voor sid-1 (pk3321) zal een uniforme populatie vertonen die zich ontwikkelt tot in de volwassenheid. Heterozygoten worden aangeduid door gemengde populaties van sommige dieren die larvale arrestatie vertonen, en sommige dieren die zich ontwikkelen tot volwassenen.
2. Bevestiging van de aanwezigheid van sid-1 (pk3321) door genotypering
   1. Pak 15-20 wormen van de geselecteerde kandidaat-F2-stam in een PCR-buisje met 15 μL wormlysisbuffer (tabel 2).
   2. Plaats de tube minimaal 10 minuten of een nacht op -80 °C.
   3. Incubeer de buis in de PCR-machine met behulp van het volgende programma:
   4. 65 °C gedurende 60 minuten (lyseworm); 95 °C gedurende 15 minuten (proteïnase K inactiveren); houden op 4 °C.
   5. Gebruik 2 μL van het wormlysaat als een "sjabloon" om de PCR-reactie uit te voeren voor genotypering, met behulp van de volgende primers voor sid-1: sid-1 forw: 5'-agctctgtacttgtattcg-3' en sid-1 rev: 5'-gcacagttatcagatttg-3'.
   6. Gebruik het volgende programma voor PCR-genotypering: 1 cyclus bij 95 °C gedurende 3 min; vervolgens 30 cycli van 95 °C gedurende 10, 55 °C gedurende 30 s en 72 °C gedurende 30 s; 1 cyclus bij 72 °C gedurende 10 min, vasthouden bij 4 °C.
   7. Zuiver het PCR-product van ~650 bp met behulp van een PCR-zuiveringskit (materiaaltabel) en sequentie het sid-1 PCR-product om de G-naar-A-puntmutatie van het sid-1 (pk3321) allel te identificeren. Als alternatief creëert de G-naar-A-puntmutatie een ApoI-restrictieplaats, die op het PCR-product kan worden gebruikt voor genotypering zoals beschreven in²⁴.
3. iQ44::YFP gebruiken als proteostasesensor voor de darm
   1. Synchroniseer C. elegans die Q44::YFP tot expressie brengt in de darm (stam OG412) of gekruist in de sid-1(pk3321) mutante achtergrond door bleken, volgens het protocol beschreven in²⁵. Plaat gesynchroniseerde L1-larven op een 9 cm nematodengroeimedium (NGM)-agarplaat met OP50-bacteriën en groeien tot L4-stadium bij 20 °C.
   2. Verzamel L4-dieren door wormen van de plaat te wassen met 5 ml M9-buffer. Breng de M9-buffer met L4-wormen over in een buis van 15 ml met behulp van een glazen pipet of een gesiliconiseerde plastic pipet en centrifugeer op 1000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur om de wormen voorzichtig te pelleteren. Verwijder het bovenstaande voorzichtig en zorg ervoor dat de wormkorrel ongemoeid blijft.
   3. Kritieke stap: Om nematoden over te brengen of uit te werken, gebruikt u een glazen pipet of een plastic pipetpunt die is behandeld met een siliconenmiddel (bijv. SigmaCote) volgens de instructies van de fabrikant. Dit voorkomt het plakken van wormen aan het plastic oppervlak van een pipetpunt.
   4. Herhaal stap 2.3.2 nog drie keer om alle OP50-bacteriën van de wormen af te wassen.
   5. Neem de wormkorrel op in 5 ml M9-buffer en tel het aantal aanwezige wormen in 10 μl.
   6. Plaat L4 dieren op 6 cm NGM agarplaten met lege vector control (EV) of hsp-90 RNAi-bacteriën met een dichtheid van 10 wormen per plaat (5 platen per tijdstip bereiden en biologisch dupliceren) en gedurende 24-48 uur bij 20 °C uitbroeden.
   7. Tel na 24 uur (=Dag 1 volwassene) en 48 uur (=Dag 2 volwassenen) het aantal Q44 foci in de darmen van nematoden die aggregaten vertonen. Scoor in totaal 30-50 nematoden per biologische replicaat.

3. Weefselspecifieke kandidaat-RNAi-screening voor modificatoren van niet-autonome proteostase

OPMERKING: Voor de weefselspecifieke RNAi-screening gebruikten we stam PVH172 die darmspecifiek RNAi mogelijk maakt door RNAi-bacteriën te voeden en stam PVH171 die spierspecifiek RNAi mogelijk maakt (zie tabel 1 voor genotype).

1. Voorbereiding van de kandidaat-RNAi-platen
   1. Bereid 6 cm NGM-agarplaten aangevuld met 100 μg/ml ampicilline, 12,5 μg/ml tetracycline en 1 mM IPTG volgens de standaardmethoden²⁵.
   2. Gebruik de Ahringer RNAi-bibliotheek om de kandidaat-RNAi-klonen voor de RNAi-screening²⁰ te verkrijgen.
   3. Inoculeer 3 ml LB-amp-media (50 μg/ml ampicilline in LB-media) in een buis van 15 ml met de gewenste RNAi-kloon met behulp van een plastic pipetpunt. Kweek 's nachts bij 37 °C met agitatie.
   4. Voeg de volgende dag Isopropyl-b-D-thiogalactopyranosid (IPTG) (uit een voorraad van 1 M) toe aan een uiteindelijke concentratie van 1 mM in de bacteriële nachtcultuur.
   5. Schud de culturen nog 3 uur bij 37 °C.
   6. Breng 300 μL bacteriële RNAi-cultuur aan op een 6 cm NGM agarplaat aangevuld met 100 μg/ml ampicilline, 12,5 μg/ml tetracycline en 1 mM IPTG. Laat de platen 2 dagen op de bank bij kamertemperatuur drogen, afgedekt met aluminiumfolie ter bescherming tegen licht. Eenmaal droog kunnen de RNAi-platen enkele weken in een doos bij 4 °C worden bewaard.
2. Synchronisatie van C. elegans en behandeling met RNAi-bacteriën
   1. Om wormstammen te synchroniseren, kies je 15 zwangere volwassenen op RNAi-platen en laat je ze 1 uur eieren leggen. Haal vervolgens de volwassen dieren van het bord.
   2. Kritieke stap: Synchronisatie door bleken wordt in dit geval vermeden, omdat het de hsp-70p::RFP-reporter kan induceren, omdat het een stressvolle toestand is voor C. elegans.
   3. Pluk gesynchroniseerde L4-stadiumlarven en breng ze over naar een verse RNAi-plaat.
   4. Laat nematoden twee generaties lang op het relevante RNAi groeien om een efficiënte opname van dsRNA te garanderen, en zorg ervoor dat de temperatuur op 20 °C blijft.
   5. Gebruik voor beeldvorming en kwantificering van hsp-70p::RFP-fluorescentie dag 1 volwassenen.
3. Voorbereiding van microscoopglaasjes
   1. Bereid de microscoopglaasjes voor door ~250 μL van een 2% agarose-oplossing (in M9-buffer) op een glazen microscoopglaasje te plaatsen en een tweede dia erop te plaatsen om een platte schijf te maken.
   2. Plaats 5 μL 5 ml Levamisoloplossing (in M9-buffer) op het ingestelde agarosekussen en breng 5 Dag 1 volwassen wormen over in de Levamisoldruppel. Laat de nematoden 5 minuten verlammen.
   3. Zodra C. elegans verlamd zijn, lijnt u deze voorzichtig uit met een platina draadplectrum en verwijdert u overtollig levamisol met een laboratoriumdoekje voordat u een dekglaasje toevoegt.
   4. Kritieke stap: Zorg ervoor dat u binnen 30 minuten na de voorbereiding van de microscoopglaasjes foto's van de wormen maakt. Verlamde nematoden op het microscoopglaasje kunnen uitdrogen en barsten, wat de fluorescentiemetingen in gevaar kan brengen.
4. Microscoopinstellingen en beeldanalyse
   OPMERKING: Beelden worden verkregen met behulp van een confocale microscoop die is uitgerust met een EM-CCD-camera en een software voor beeldautomatisering en beeldanalyse met microscopie.
   1. Maak foto's met een vergroting van 10x met behulp van een laser van 561 nm voor RFP-fluorescentie-excitatie. Zorg ervoor dat alle foto's zijn gemaakt met dezelfde instellingen voor laservermogen, pinhole-grootte en fluorescentieversterking om vergelijkingen mogelijk te maken.
   2. Sla alle afbeeldingen op als TIFF-bestanden.
   3. Voer beeldanalyse uit met behulp van ImageJ. Meet de fluorescentie-intensiteit in elke afbeelding als pixels per oppervlakte-eenheid, waarbij achtergrondfluorescentie wordt afgetrokken. Normaliseer de fluorescentie-intensiteit voor elk beeld naar het beeldgebied en de lengte van de wormen.
   4. Meet de gemiddelde intensiteit met behulp van Analyseren | Meten in afbeeldingJ. Normaliseer de resulterende intensiteitswaarde naar het afbeeldingsgebied door de intensiteit te delen door gebied.
   5. Om de intensiteit te normaliseren naar de lengte van de worm, meet u de worm door een lijn te trekken langs de lengte van de worm in AfbeeldingJ en Analyseren | Meten. De reden voor het normaliseren van de fluorescentie-intensiteit naar wormlengte, is dat wormen in grootte kunnen variëren, afhankelijk van het gen dat wordt uitgeschakeld door RNAi, en dit kan de gemiddelde intensiteit beïnvloeden.
   6. Normaliseer de gemeten fluorescentie-intensiteiten naar onbehandelde controles (d.w.z. transgene C. elegans gekweekt op controle (EV) RNAi-platen). Bundel de genormaliseerde waarden om de gemiddelde fluorescentie-intensiteiten voor elke RNAi-conditie te vergelijken. Streef ernaar om 20 wormen per biologische replicaat in beeld te brengen en verzamel ten minste 3 biologische replicatiebeelden.
   7. Bereken P-waarden van de gemiddelde fluorescentie-intensiteitswaarden met behulp van de t-test van de student en voer een correctie uit voor meervoudige tests met behulp van de Benjamini-Hochberg-methode, met behulp van een false discovery rate van 0,05.

Resultaten

Weefselspecifiek RNAi op twee manieren: Expressie van haarspeldconstructies of weefselspecifieke SID-1-complementatie
Expressie van weefselspecifieke haarspeld-RNAi-constructies maakt het mogelijk om een gen tijdens de ontwikkeling constitutief uit te schakelen. Dit kan echter soms onpraktisch zijn wanneer het onderzochte gen nodig is voor de organogenese van dat specifieke weefsel, zoals elt-2 , dat nodig is voor de ontwikkeling van de darm^...

Discussie

De hier beschreven methoden demonstreren het gebruik van instrumenten die het mogelijk maken om PN-componenten op een constitutieve en temporele manier weefselspecifieke knockdown te maken. We hebben eerder TCS geïdentificeerd, een niet-autonoom stressresponsmechanisme dat wordt geïnduceerd door weefselspecifieke verandering van Hsp90-expressieniveaus¹⁰. Weefselspecifieke knockdown van hsp-90 door expressie van haarspeld-RNAi leidt tot niet-autonome opreg...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Ampicillin	Merck	A0166-5G	Protocol Sectie 3.1.
DNA Clean & Concentrator-500	Zymo Research	D4031	Protocol Sectie 2.2.
IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactoside	Merck	367-93-1	Protocol Sectie 3.1.
Multisite Gateway Cloning Kit	Thermo Fisher	12537100	Protocol Sectie 1.2.
SigmaCote	Merck	SL2-25mL	Protocol Sectie 2.3.
Tetracycline	Merck	T7660-5G	Protocol Sectie 3.1.
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit	Thermo Fisher	K280002	Protocol Sectie 1.1.