Bronchoalveolaire lavage en oliezuurinjectie bij varkens als een double-hit model voor acute respiratory distress syndrome (ARDS)

Samenvatting

Er bestaan verschillende, complexe diermodellen om de pathofysiologie van acute respiratory distress syndrome (ARDS) te bestuderen. Bronchoalveolaire lavage en oliezuurinjectie geïnduceerde longbeschadiging is geschikt als een nieuw dubbeltreffer diermodel voor het bestuderen van het acute respiratory distress syndrome.

Samenvatting

De behandeling van ARDS blijft grote uitdagingen vormen voor intensive care-artsen in de 21e eeuw, waarbij de sterftecijfers in ernstige gevallen nog steeds oplopen tot 50%. Verdere onderzoeksinspanningen zijn nodig om de complexe pathofysiologie van deze ziekte beter te begrijpen. Er zijn verschillende gevestigde diermodellen om acuut longletsel te induceren, maar geen enkele is in staat geweest om de complexe pathomechanismen van ARDS adequaat na te bootsen. De meest cruciale factor voor de ontwikkeling van deze aandoening is de schade aan de alveolaire capillaire eenheid. De combinatie van twee gevestigde longletselmodellen stelt ons in staat om het onderliggende pathomechanisme in meer detail na te bootsen. Bronchoalveolaire lavage (BAL) leidt zowel tot uitputting van oppervlakteactieve stoffen als tot alveolaire collaps. De herhaalde indruppeling van vloeistofvolumes veroorzaakt daaropvolgende hypoxemie. De uitputting van oppervlakteactieve stoffen is een sleutelfactor van ARDS bij mensen. BAL wordt vaak gecombineerd met andere benaderingen van longletsel, maar nog niet met een tweede treffer gevolgd door oliezuurinjectie (OAI). Oliezuurinjectie leidt tot een ernstig verminderde gasuitwisseling, een verslechtering van de longmechanica en verstoring van de alveolo-capillaire barrière. De OAI bootst de meeste van de verwachte effecten van ARDS na, bestaande uit langdurige ontsteking van longweefsel met een toename van alveolaire lekkage en verminderde gasuitwisseling. Een nadeel van de combinatie van verschillende modellen is de moeilijkheid om de invloed op het longletsel te bepalen die wordt veroorzaakt door BAL alleen, OAI alleen of beide samen. Het model dat in dit rapport wordt gepresenteerd, vertegenwoordigt de combinatie van BAL en OAI als een nieuw model voor longletsel met dubbele hit. Dit nieuwe model is eenvoudig te implementeren en een alternatief om in de toekomst verschillende therapeutische benaderingen in ARDS te bestuderen.

Inleiding

Acute respiratory distress syndrome (ARDS) is een ziekte die bestaat uit verminderde gasuitwisseling en longinfiltratie, waarvoor vaak intensieve zorgtherapie nodig is. De mortaliteit van ernstige ARDS blijft wereldwijd hoog (tot 50%) ondanks bijna 50 jaar uitgebreid onderzoek¹. De ARDS wordt gedefinieerd door de definitie van Berlijn, inclusief diagnostische criteria als timing, beeldvorming van de borstkas, oorsprong van oedeem en hypoxemie². Om patiënten met verschillende niveaus van ARDS-ernst beter te categoriseren, worden drie verschillende graden van hypoxemie gedefinieerd: mild (200 mmHg < PaO₂/FIO₂ ≤ 300 mmHg), matig (100 mmHg < PaO₂/FIO₂ ≤ 200 mmHg) en ernstig (PaO₂/FIO₂ ≤ 100 mmHg)². Verschillende diermodellen met een focus op longbeschadiging worden veel gebruikt en geaccepteerd om de pathofysiologische veranderingen en verschillende therapeutische benaderingen in ARDS³ te onderzoeken.

Diermodellen waarbij endotoxinen worden gebruikt (bijv. intraveneuze infusie van bacteriën, afbinden en prikken van de blindedarm om een door sepsis geïnduceerde longbeschadiging na te bootsen), ischemie/reperfusiemodellen, rook/verbranding ARDS-modellen, infusie van oliezuur en bronchoalveolaire lavagemodellen zijn bekend³. Elk model vertegenwoordigt slechts enkele pathofysiologische veranderingen met voor- en nadelen voor de studieresultaten³. Dit weerspiegelt niet de complexiteit van de ziekte ARDS. De combinatie van twee bewezen modellen maakt betere conclusies mogelijk over de pathofysiologie van ARDS. In het gepresenteerde model combineerden we bronchoalveolaire lavage en oliezuurinfusie om de complexiteit van de menselijke ARDS na te bootsen. Oliezuur is een onverzadigd vetzuur en werkt rechtstreeks in op de alveolo-capillaire eenheid van de longen door de activering van aangeboren immuunreceptoren op gang te brengen en vervolgens neutrofielenaccumulatie, pro-inflammatoire cytokineproductie en celdood te veroorzaken ^4,5. Oliezuurinfusie induceert ernstige hypoxemie, verhoogt de pulmonale arteriële druk en accumulatie van extravasculair longwater. Hypotensie en myocardiale depressie als gevolg van rechterventrikelfalen komen vaak voor. De inductie van longbeschadiging door herhaalde bronchoalveolaire lavage (BAL) met uitgebalanceerde elektrolytoplossing verlaagt de alveolaire oppervlakteactieve stoflipideconcentratie³. Oppervlakteactieve stoffen verminderen de alveolaire oppervlaktespanning en voorkomen alveolaire collaps. BAL veroorzaakt onmiddellijke hypoxemie en een toename van het alveolair-arteriële zuurstofverschil³. Menselijke ARDS wordt ook in verband gebracht met uitputting van oppervlakteactieve stof³. De nadelen van dit gecombineerde model zijn de noodzaak van centrale veneuze toegang, intubatie en algemene anesthesie. Bovendien blijft de twijfelachtige mechanistische relevantie (bijv. de oliezuurinfusie) voor translationele aspecten onduidelijk. Het is in ieder geval moeilijk om te bepalen welk deel van de longbeschadiging (BAL vs. OAI, of beide samen) bijdraagt aan longschade. De voordelen van dit model zijn de bruikbaarheid bij grote dieren met vertrouwde monitoring en instrumentatie die vergelijkbaar is met die van menselijke patiënten (geen speciale apparatuur vereist), de goede reproductie van de belangrijkste aspecten van ARDS en de mogelijkheid om geïsoleerde ARDS te bestuderen zonder systemische ontsteking (bijv. endotoxinemodellen). In het volgende artikel geven we een gedetailleerde beschrijving van de double-hit (BAL en OAI) longbeschadiging bij varkens en geven we representatieve gegevens om de stabiliteit van de compromissen in de longfunctie te karakteriseren.

Protocol

Alle hier beschreven dierproeven zijn goedgekeurd door de institutionele en nationale commissie voor dierenverzorging (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz, Koblenz, Duitsland; goedkeuringsnummer G18-1-044) en zijn uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Europese en Duitse Vereniging voor Proefdierwetenschappen.

1. Anesthesie, intubatie en mechanische beademing

1. Houd voedsel gedurende 6 uur vóór de anesthesie achter om het risico op aspiratie te verminderen, maar zorg voor vrije toegang tot water om stress te verminderen.
2. Injecteer een combinatie van ketamine (4 mg∙^kg-1) en azaperon (8 mg∙^kg-1) intramusculair voor sedatie terwijl het dier in de dierenbox ligt.
3. Breng een veneuze lijn tot stand met een gewone perifere veneuze katheter (20 G) in een oorader na lokale desinfectie met alcohol.
4. Begin met het bewaken van de perifere zuurstofverzadiging (SpO₂) door de sensor op een van de oren of de staart van het dier te klikken.
5. Injecteer fentanyl (4 μg∙^kg-1), propofol (3 mg∙^kg-1) en atracurium (0,5 mg∙^kg-1) voor inductie van anesthesie.
6. Plaats het varken in rugligging op de brancard.
7. Ventileer het varken met een masker dat geschikt is voor dieren met een piekinspiratoire druk van minder dan 20 cmH₂O, een PEEP van 5 cmH₂O, een frequentie van 14-16 /min en een FiO₂ van 1.0.
8. Start een continue infusie met uitgebalanceerde elektrolytoplossing (5 ml∙ ^kg-1∙^h-1), propofol (8-12 mg ∙ ^kg-1∙^h-1) en fentanyl (0,1-0,2 mg ∙ ^kg-1∙^h-1) om de anesthesie te behouden.
9. Gebruik voor de intubatie een gewone endotracheale tube die geschikt is voor het dier (bijv. gewicht van 25-30 kg, endotracheale tube ID 6-7) gewapend met een endotracheale tube-inbrenger en een gewone laryngoscoop met een Macintosh Blade 4. Er zijn twee mensen nodig.
   1. Persoon 1: Trek met één hand de tong uit en druk met de andere hand de snuit naar beneden.
   2. Persoon 2: Plaats de laryngoscoop en verplaats deze zoals gewoonlijk totdat de epiglottis zichtbaar kan worden.
10. Trek de laryngoscoop omhoog om de stembanden zichtbaar te maken. Soms "plakt" de epiglottis aan de zachte palatine. Als dat zo is, mobiliseer het dan met de punt van de buis.
11. Steek de buis door de stembanden en trek de introducer eruit.
12. Blokkeer de ballon van de buis.
13. Sluit de slang aan op de ventilator en controleer de juiste positionering met capnografie en auscultatie.
14. Start mechanische ventilatie (ademvolume 6-8 ml/kg, PEEP 5 cmH_{2 O}, FiO₂ 0,4, frequentie om etCO₂ tussen 35 – 45 mmHg te houden).

2. Instrumentatie

1. Trek de achterpoten in met zwachtels voor het katheteriseren van de noodzakelijke bloedvaten. Een arteriële lijn, een arteriële inbrenghuls, een centrale veneuze lijn en een veneuze inbrengerschede voor het plaatsen van een longslagaderkatheter zijn noodzakelijk.
2. Desinfecteer het dijbeengebied royaal met alcoholische desinfectie. Afhankelijk van de geplande onderzoeken wordt een min of meer aseptische aanpak gebruikt.
3. Bereid katheters voor door ze door te spoelen met zoutoplossing.
4. Plaats de ultrasone sonde op de liesband en scan op dijbeenvaten.
5. Draai de sonde 90° om de dijbeenarteria in de lange as volledig zichtbaar te maken. Indien nodig is het ook mogelijk om in verschillende omstandigheden de weergave van de korte as te gebruiken om de dijbeenarteria volledig in beeld te brengen.
6. Kanuleer de dijbeenarteria onder in-line ultrasone visualisatie met de naald van de introducer ingesteld in de techniek van Seldinger. Wanneer pulserend helder bloed naar buiten stroomt, brengt u de voerdraad in en trekt u de naald in.
7. Visualiseer de dijbeenader en cannuleer de ader onder in-line ultrasone visualisatie en continue aspiratie met de naald van de inbrengerset. Als veneus bloed kan worden opgewekt, koppelt u de spuit los en plaatst u de voerdraad. Trek de naald in.
8. Controleer de positie van de draden met echografie.
9. Plaats de arteriële en de veneuze lijn over de geplaatste voerdraden.
10. Herhaal de arteriële en veneuze interpunctie aan de andere kant en plaats de inleidende omhulsels volgens de techniek van Seldinger zoals hierboven beschreven.
11. Sluit de arteriële lijn en de veneuze lijn elk aan op een transducer.
12. Plaats beide transducers op harthoogte en schakel de driewegkranen van beide transducers open naar de atmosfeer om het systeem op nul te kalibreren.
    OPMERKING: Het is noodzakelijk om luchtbellen en bloedvlekken in het systeem te vermijden om plausibele waarden te genereren.
13. Schakel de infusie van propofol en fentanyl over naar een van de poorten van de centrale veneuze lijn.
14. Kalibreer de sonde voor ultrasnelle pO_2-metingen en steek deze door de arteriële inbrenghuls.
    OPMERKING: De meting van pO₂ met de sonde voor ultrasnelle pO_2-meting is niet verplicht, maar helpt bij het visualiseren van de real-time veranderingen in pO₂.

3. Inbrengen van longslagaderkatheter

1. Controleer de ballon van de longslagaderkatheter (PAC) op beschadigingen.
2. Sluit de transducer aan en kalibreer deze.
3. Steek de PAC door de inbrenghuls (ballon leeggelopen).
4. Wanneer de PAC door de inbrenghuls (15-20 cm) is gegaan, blaast u de ballon op.
5. Beweeg de PAC vooruit en bewaak de typische golfvormen (veneuze vaten, rechter atrium, rechterventrikel, longarteria, pulmonale capillaire wigdruk). Laat de ballon leeglopen en controleer of bloed via alle poorten van de PAC kan worden opgezogen.

4. Inductie van longletsel: eerste treffer door bronchoalveolaire lavage

1. Bereid een steriel uitgebalanceerde elektrolytoplossing (bijv. Sterofundin) die is opgewarmd tot 40 °C.
   OPMERKING: Steriel uitgebalanceerde elektrolytoplossing wordt gebruikt om longvervuiling te voorkomen.
2. Verander de FiO₂ van 0.4 naar 1.0 gedurende 10 minuten voordat u de bronchoalveolaire spoeling uitvoert.
3. Start de ultrasnelle pO_2-meting.
4. Bereid noradrenaline voor continue infusie en voor bolusinjectie (indien de gemiddelde arteriële druk < 60 mmHg). Sluit de norepinefrine-spuitpomp aan op een van de poorten van de centraal veneuze katheter zonder deze te starten.
5. Vul 30 ml∙^kg-1 van de verwarmde steriele uitgebalanceerde elektrolytoplossing in een trechter. Controleer of de trechter kan worden aangesloten op de endotracheale tube.
6. Koppel de buis los zonder PEEP-verlies aan inspiratie van de ventilator.
7. Sluit de trechter aan op de endotracheale tube.
8. Til de trechter met de hand 1 m boven het dier op.
9. Open de dop en druppel de volledige hoeveelheid van de opgewarmde, uitgebalanceerde elektrolytoplossing uit de trechter in de endotracheale tube gedurende 30 s met behulp van de hydrostatische druk.
10. Verwijder na 30 s de geïnfuseerde oplossing door de trechter 1 meter onder het dier te laten zakken en de spoelvloeistof passief af te tappen. Sluit het dier weer aan op de ventilator voor zuurstofvoorziening.
11. Vang de verwijderde wasvloeistof op en noteer de hoeveelheid. Het is nodig om de klaring van alveolaire vloeistof te berekenen.
    NOTITIE: Gebruik de uitgebalanceerde elektrolytoplossing niet opnieuw na een spoeling om de uitspoeling van de oppervlakteactieve stof te maximaliseren.
12. Zuig de restanten van de oplossing in de buis op met behulp van afzuigkatheters.
13. Houd de hemodynamica na de bronchoalveolaire lavage nauwlettend in de gaten en houd noradrenaline bij de hand. Indien nodig noradrenaline geven als bolus of continu infuus om de bloeddruk te stabiliseren (vergelijk met stap 4.4).
14. Herhaal de infusie van 30 ml∙^kg-1 gebalanceerde elektrolytoplossing zoals beschreven in de stappen 4.5-4.13 totdat de PaO₂/FiO_2-verhouding lager is dan 250 mmHg. Vier tot vijf herhalingen van de bronchoalveolaire spoeling kunnen nodig zijn.
15. Als de PaO₂/FiO_2-verhouding lager is dan 250 mmHg, begin dan met de inductie van longbeschadiging door oliezuurinjectie. Wijzig de instellingen van de beademingsmachine niet tijdens deze procedure.

5. Inductie van longletsel: tweede treffer door oliezuurinjectie

1. Bereid oliezuuroplossing: 0,1 ml∙^kg-1 oliezuur in een spuit van 20 ml en sluit deze aan op een 3-weg-kraan. Neem 2 ml bloed in een andere spuit van 20 ml. Voeg de zoutoplossing toe tot een totaal volume van 20 ml in beide spuiten en sluit de tweede spuit ook aan op de 3-weg-kraan.
   LET OP: Gebruik handschoenen en oogbescherming bij het werken met oliezuur.
2. Bereid noradrenaline voor continue infusie en voor bolusinjectie (indien de gemiddelde arteriële druk < 60 mmHg). Sluit de norepinefrine-spuitpomp aan op een van de poorten van de centraal veneuze katheter zonder deze te starten.
3. Blijf de ultrasnelle pO_2-meting die nog steeds meet in de gaten houden. FiO₂ is nog steeds 1.0.
4. Sluit de 3-wegkraan aan op de proximale poort van de PAC.
5. Meng het oliezuur en het mengsel van bloed en zoutoplossing grondig door de oplossing herhaaldelijk van de ene spuit naar de andere spuit te verplaatsen en vice versa via de driewegkraan en blijf de hele tijd mengen. Als het een homogene emulsie is, injecteer dan 2 ml van de emulsie en ga verder met mengen.
   OPMERKING: Als het mengen stopt, kan de emulsie zich scheiden in een lipofiel en een hydrofiel deel.
6. Houd de hemodynamica na injectie van oliezuur nauwlettend in de gaten en houd noradrenaline bij de hand. Indien nodig noradrenaline geven als bolus of continu infuus om de bloeddruk te stabiliseren (vergelijk met stap 5.2).
   OPMERKING: Wees waakzaam; De dieren kunnen tijdens deze procedure sterven.
7. Herhaal de injectie van 2 ml van de oplossing om de 3 minuten totdat de PaO₂/FiO_2-verhouding lager is dan 150 mmHg.
8. Als de spuit leeg is voordat de PaO₂/FiO_2-verhouding tussen 100 en 200 mmHg ligt, maak dan nog 2 spuiten klaar zoals beschreven in stap 5.1. Herhaal de stappen 5.5-5.8 totdat de PaO₂/FiO_2-verhouding tussen de 100 en 200 mmHg ligt.
   OPMERKING: Een halve tot volle spuit van het oliezuur en het mengsel van bloed en zoutoplossing is meestal vereist.
9. Als de PaO₂/FiO_2-verhouding tussen 100 en 200 mmHg ligt, wacht dan 30 minuten en controleer het opnieuw. Als het constant onder de 200 mmHg is, start dan het experiment/de behandeling; Maak anders nog 2 spuiten klaar zoals beschreven in stap 5.1 en herhaal stap 5.5-5.9.
   OPMERKING: Na inductie van longletsel zoals beschreven, kan de aantasting van de longfunctie stabiel blijven of verslechteren of zelfs verbeteren binnen bepaalde grenzen.

6. Einde van het experiment en euthanasie

1. Injecteer 0,5 mg fentanyl naast de continue anesthesie en wacht 5 minuten. Injecteer 200 mg propofol en 40 mmol kaliumchloride om het dier in diepe anesthesie te doden.

Resultaten

De PaO₂/FiO_2-verhouding neemt af na bronchoalveolaire lavage en gefractioneerde toepassing van oliezuur (Figuur 1). Omdat het onduidelijk is om de impact van bronchoalveolaire lavage (bijv. de impact van de dosis gefractioneerd oliezuur) op de PaO₂/FiO_2-ratio te voorspellen, wordt aanbevolen om de PaO₂/FiO_2-ratio te controleren tijdens het induceren van de longschade. Ultrasnelle pO_2-meti...

Discussie

De beschreven double-hit methode om een ernstige longbeschadiging bij varkens te veroorzaken is geschikt om verschillende behandelingsopties bij ARDS te bestuderen. Het double-hit-model bootst twee centrale elementen van het pathomechanisme van ARDS na: verlies van de alveolaire-capillaire eenheid en verstoring van de endotheliale barrière⁷. Vanwege de twee treffers is het belangrijk om een onderzoeksprotocol te hebben met vooraf gedefinieerde streefwaarden (bijv....

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1 M Kaliumchlorid-Lösung 7.46% 20 mL	Fresenius, Kabi Deutschland GmbH	kalium chloride
Absaugkatheter Ideal CH14, 52 cm, gerade	B. Braun Melsungen AG, Germany	suction catheter
Arterenol 1 mg/mL, 25 mL	Sanofi- Aventis, Seutschland GmbH	norepinephrine
Atracurium Hikma, 50 mg/5 mL	Hikma Pharma GmbH, Martinsried	atracurium
BD Discardit II Spritze 2, 5, 10, 20 mL	Becton Dickinson S.A. Carretera Mequinenza Fraga, Spain	syringe
BD Luer Connecta	Becton Dickinson Infusion Therapy AB Helsingborg, Sweden	3-way-stopcock
BD Microlance 3 20 G	Becton Dickinson S.A. Carretera Mequinenza Fraga, Spain	canula
Datex Ohmeda S5	GE Healthcare Finland Oy, Helsinki, Finland	hemodynamic monitor
Engström Carestation	GE Heathcare, Madison USA	ventilator
Fentanyl-Janssen 0.05 mg/mL	Janssen-Cilag GmbH, Neuss	fentanyl
Führungsstab, Durchmesser 4.3	Rüsch	endotracheal tube introducer
Incetomat-line 150 cm	Fresenius, Kabi Deutschland GmbH	perfusorline
Ketamin-Hameln 50 mg/mL	Hameln Pharmaceuticals GmbH	ketamine
laryngoscope	Rüsch	laryngoscope
logicath 7 Fr 3-lumen 30 cm lang	Smith- Medical Deutschland GmbH	central venous catheter
Masimo Radical 7	Masimo Corporation Irvine, Ca 92618 USA	periphereal oxygen saturation
Neofox Oxygen sensor 300 micron fiber	Ocean optics Largo, FL USA	ultrafast pO2-measurements
Ölsäure reinst Ph. Eur NF C18H34O2 M0282.47g/mol, Dichte 0.9	Applichem GmbH Darmstadt, Deutschland	oleic acid
Original Perfusor syringe 50 mL Luer Lock	B.Braun Melsungen AG, Germany	perfusorsyringe
PA-Katheter Swan Ganz 7.5 Fr, 110 cm	Edwards Lifesciences LLC, Irvine CA, USA	PAC
PE-Trichter, 60 mm	Aquintos-Wasseraufbereitung GmbH, Germany	funnel
Percutaneous sheath introducer set 8.5 und 9 Fr, 10 cm with integral haemostasis valve/sideport	Arrow international inc. Reading, PA, USA	introducer sheath
Perfusor FM Braun	B.Braun Melsungen AG, Germany	syringe pump
Propofol 2% 20 mg/mL (50 mL Flaschen)	Fresenius, Kabi Deutschland GmbH	propofol
Radifocus Introducer II, Größe 5-8 Fr	Terumo Corporation Tokio, Japan	introducer sheath
Rüschelit Super Safety Clear 6.5 /7.0	Teleflex Medical Sdn. Bhd, Malaysia	endotracheal tube
Seldinger Nadel mit Fixierflügel	Smith- Medical Deutschland GmbH	seldinger canula
Sonosite Micromaxx Ultrasoundsystem	Sonosite Bothell, WA, USA	ultrasound
Stainless Macintosh Größe 4	Welsch Allyn69604	blade for laryngoscope
Sterofundin Infusion	B. Braun Melsungen AG, Germany	bronchoalveolar lavage
Stresnil 40 mg/mL	Lilly Deutschland GmbH, Abteilung Elanco Animal Health	azaperon
Vasofix Safety 22 G	B.Braun Melsungen AG, Germany	venous catheter