Methodenartikel

Synaptische degeneratie visualiseren bij volwassen drosofie in combinatie met neurodegeneratie

7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61363

⸱

13 mei 2020

 , 
1Department of Biological Sciences, Lehigh University

In dit artikel

Samenvatting

Het doel van deze procedure is om het dorsale longitudinale spierweefsel (DLM) te ontleden om de structurele integriteit van DLM neuromusculaire knooppunten (NMJs) in neurodegeneratieve ziektemodellen te beoordelen met behulp van Drosophila melanogaster.

Samenvatting

Drosophila dient als een nuttig model voor het beoordelen van synaptische structuur en functie geassocieerd met neurodegeneratieve ziekten. Hoewel veel werk is gericht op neuromusculaire knooppunten (NMJs) in Drosophila larven, heeft het beoordelen van synaptische integriteit bij volwassen Drosophila veel minder aandacht gekregen. Hier bieden we een eenvoudige methode voor dissectie van de ruglangsbeenspieren (DDLM's), die nodig zijn voor vluchtvermogen. Naast de vlucht als een gedragsuitlezing, deze dissectie zorgt voor de zowel DLM synapsen en spierweefsel te vatbaar zijn voor structurele analyse met behulp van fluorescerend gelabeld antilichamen voor synaptische markers of eiwitten van belang. Dit protocol maakt de evaluatie van de structurele integriteit van synapsen bij volwassen Drosophila mogelijk tijdens het ouder worden om de progressieve, leeftijdsafhankelijke aard van de meeste neurodegeneratieve ziekten te modelleren.

Inleiding

Synaptische disfunctie is een van de vroegst bekende kenmerken van de meeste belangrijke neurodegeneratieve ziekten1,2,3,4,5,6. Er is echter zeer weinig bekend over hoe deze structurele en functionele stoornissen zich verhouden tot latere stadia van ziekteprogressie. Drosophila heeft bewezen een nuttig modelsysteem te zijn voor het begrijpen van synapsgroei en -ontwikkeling met larve NMJ's7,8,9. Echter, de derde larve instar stadium duurt slechts een paar dagen, het beperken van hun nut in het bestuderen van progressieve, leeftijd-afhankelijke neurodegeneratie. Een alternatief voor de beoordeling van larve NMJs is het onderzoeken van synaptische structuren bij volwassen Drosophila, zoals de synapsen gevormd op de Dorsale Longitudinale Spieren (DDL's) die nodig zijn voor vlucht10,11,12,13,14,15,16. Deze tripartiete synapsen zijn structureel georganiseerd op een vergelijkbare manier als zoogdier synapsen17, het verstrekken van een uniek voordeel voor de beoordeling van modellen van neurodegeneratieve ziekten.

Hier beschrijven we een eenvoudige methode voor het analyseren van de structurele integriteit van volwassen NMJ's in een Drosophila-model van neurodegeneratie. Eerdere DLM-dissectiemethoden en studies hebben het belang benadrukt van het behoud van spierweefsel voor een verscheidenheid aan toepassingen18,19,20,21,22,23. Ons protocol biedt een uitgebreide methode om zowel neuronaal als spierweefsel te behouden om neurodegeneratieve ziekten te onderzoeken. Een andere belangrijke component van het bestuderen van deze ziekten is het vermogen om neuronale verlies te begrijpen in een leeftijd afhankelijke manier. Eerder werk geeft een kritisch en diepgaand inzicht in hoe de DLM NMJs worden gevormd tijdens de metamorfose in de vroege volwassenheid11,12,14,15,16,24. Ons protocol stelt een methode om voort te bouwen op dit werk om DLM NMJs te onderzoeken op een leeftijdsafhankelijke manier bij veroudering en neurodegeneratieve ziekten.

Protocol

1. Generatie van transgene vliegen

  1. Om transgene vliegen te genereren voor dit experiment, verzamelen OK371-Gal425 maagdelijke vrouwelijke vliegen en mannetjes van UAS-TDP-43M337V 26 (Figuur 1A) door het verdoven van vliegen met CO2 op een pad te sorteren.
  2. Sorteer verdoofde vliegen in flesjes met standaard Drosophila media voor het kruis. Plaats gelabelde flesjes op 25 °C voor de volgende generatie te voorschijn komen.
    OPMERKING: Duidelijk de volwassenen uit de flesjes voordat het nageslacht ontstaan om de juiste genotype te garanderen.
  3. Zodra nakomelingen ontstaan, verzamel de transgene vliegen in flesjes en sorteren op geslacht om te beginnen met veroudering voor experimentele omstandigheden.
  4. Zodra vliegen worden verzameld, transfer vliegen om vers voedsel om de 2 dagen tot de vliegen zijn 21 dagen oud.

2. Dissectie prep

  1. Om voor te bereiden op dissecties, verkrijgen kamertemperatuur fosfaat gebufferde zoutoplossing (1x PBS), een 10 cm dissectie schotel bekleed met een siliconen elastomeer, rechte rand ontleden schaar, een set van stompe dissectie tangen, een P200 pipet en pipet tips, 2,0 mL microcentrifuge buizen, standaard kantoor schaar, 70% ethanol, een 6 cm petrischaal, en 32% formaldehyde verdund tot 4% met 1x PBS.
  2. Label buizen voor elk genotype of conditie en voeg 900 μL 1x PBS (kamertemperatuur) en 150 μL van 32% formaldehyde toe aan elke buis. Draag handschoenen en veiligheidsbrillen bij de voorbereiding van de 4% formaldehyde fixatief.
  3. Verdoes 6\u201210 vliegt per groep rechtstreeks uit de flacon met CO2 en dompel vliegt onder in een petrischaaltje van 6 cm met 70% ethanol. Druk op vliegen naar beneden in de ethanol met behulp van een verfborstel om ervoor te zorgen dat specimens volledig worden ondergedompeld. Dit zal de laag olie op de buitenste cuticula verwijderen.

3. Thoraxisolatie en fixatie

  1. Voeg voor het ontleden van elk exemplaar ongeveer 7\u201210 mL 1x PBS toe aan de dissectieschotel bedekt met siliconenelastomeen. Dit volume moet ervoor zorgen dat de weefselmonsters volledig onder water staan.
  2. Breng een vlieg naar de dissectie schotel van de 70% ethanol met behulp van stompe tangen en grijpen ofwel de vleugels of de benen.
  3. Focus het monster in de dissectie schotel onder een ontleden microscoop. Vervolgens dompel het monster in 1x PBS, en verwijder voorzichtig de vleugels met behulp van stompe Dumont #5 fijne tangen.
  4. Met behulp van Vannas rechte rand veer dissectie schaar, verwijder de benen door het creëren van een kleine incisie in de ventrale kant van de cuticula. In stap 3.8 zal deze incisie het formaldehyde in staat stellen om het weefsel binnen te dringen.
  5. Neem de schaar in de ene hand en houd de tang in de andere om de fly ventrale kant omhoog te plaatsen. Terwijl u het monster op zijn plaats houdt met de stompe tangen, verwijdert u het hoofd en de buik met de dissectieschaar.
  6. Breng de geïsoleerde thorax met behulp van de gemodificeerde pipetpunt vanaf stap 3.2 in de gelabelde buis.
    LET OP: Stel de pipet in op 40 μL om te voorkomen dat er extra 1x PBS aan de fixatieve.
  7. Herhaal stap 3.2\u20123.6 hierboven voor elk exemplaar.
  8. Fix monsters voor 30 min op kamertemperatuur.
  9. Verwijder de fix met behulp van een Pasteur pipet en gooi het in de juiste afvalcontainer onder de rookkap. Spoel monsters drie keer met 1,5 mL 1x PBS elk met behulp van een Pasteur pipet. Voltooi een vierde spoeling met slechts 750 μL en laat weefsels in 1x PBS achter.
    OPMERKING: Op dit punt kunnen weefselmonsters tot 3 dagen op 4 °C blijven voordat ze naar de volgende stappen gaan.

4. Flash bevriezing en thorax bisection

  1. Voordat u met de bisections begint, vult u een Dewar-kolf met vloeibare stikstof met de juiste cryo-beschermende handschoenen en veiligheidsbril. Verkrijg een bladbreker, veerbladen, een paar fijne tangen, ijs, ijskoude 1x PBS en cryogene pincet.
  2. Bereid een ijsemmer voor om 1x PBS ijskoud te houden.
  3. Gebruik de bladbreker om het veerblad onder een hoek te grijpen en buig het blad om een klein stukje af te breken. De blade breaker kan dan vergrendelen het blad in positie voor gebruik als een kleine scalpel.
    OPMERKING: Voor alle groepen moet één mes meegaan. Schakel als het mes breekt of saai wordt.
  4. Voeg een schone pipettip toe aan de P200 en verwijder 1/5van de tip om monsters te vervoeren.
  5. Bereid voor elke groep een nieuwe microcentrifugebuis voor en voeg 200 μL 1x PBS toe aan elke buis. Deze tweede buis zal worden gebruikt om de laatste DLM preps te verzamelen.
  6. Verwijder alle 1x PBS uit buizen met behulp van een Pasteur pipet.
  7. Het dragen van de juiste beschermende apparatuur, dompel de buis in de vloeibare stikstof kolf voor 10 s met de cryogene pincet.
    LET OP: De buizen moeten goed worden gesloten om te voorkomen dat de buis explodeert.
  8. Haal de buis uit de vloeibare stikstof en voeg ongeveer 300 μL ijskoude 1x PBS toe aan de monsters met een Pasteur pipet. Hou de monsters op ijs.
  9. Voeg ijskoude 1x PBS toe aan de 10 cm dissectieschotel bekleed met siliconen elastomeer en doseer de eerste thorax met de gemodificeerde 200 μL pipet.
  10. Plaats de thorax ventrale kant omhoog. In de ene hand gebruik maken van een doffe tang om de thorax positie en in de andere gebruik maken van een fijn paar tangen om een aantal van de thoracale ganglion te verwijderen om de middellijn van de thorax bloot te leggen.
  11. Gebruik de middellijn van de thorax als een gids om een ondiepe snede door 1/3rd van de thorax met het blad te maken.
  12. Haal het mes uit de thorax en plaats de thorax onder een hoek van 45° met de stompe tangen. Plaats het mes opnieuw en snijd recht door de middellijn van de thorax. Dit zal resulteren in twee hemithoraces.
  13. Neem een hemithorax per keer en verwijder het overtollige weefsel onder DLM spiervezel F (Figuur 1B), de meest ventrale vezel. Gebruik het mes om zorgvuldig een of twee sneden te maken om het overtollige weefsel te verwijderen zonder de DDL's te beschadigen.
  14. Eenmaal geïsoleerd, breng de hemithorax naar de juiste buis met 1x PBS.
  15. Herhaal stappen 4.6\u20124.14 tot 10 ontleed hemithoraces per groep worden gemaakt.

5. Structurele kleuring

  1. Na het doorsnijden van de thoraxmonsters plaatst u het weefsel in de blokkeerbuffer (1x PBS met 0,1% normaal geitenserum en 0,2% Triton X-100 bij pH 7.4) om het weefsel te doordrenabiliseren en niet-specifieke vlekken te voorkomen. Gebruik een Pasteur pipet om overtollige 1x PBS te verwijderen en voeg 1,5 mL blokkeerbuffer toe aan elke buis. Blokkeer weefsels gedurende ten minste 1 uur bij 4 °C.
  2. Bereid de monsters voor structurele vlekken met behulp van een fluorescerend geconjugeerd antilichaam, mierikswortel peroxidase 488 (anti-HRP-488) bij een verdunning van 1:200 en Phalloidin-647 bij een verdunning van 1:1000 bij het blokkeren van buffer om motorneuronen en spierweefsel te bevlekken, respectievelijk. Maak voldoende vlek om 150 μL per buis te hebben. Bewaar de vlek op 4 °C bedekt met folie of in een donkere doos tot ze klaar zijn voor vlekken.
  3. Verwijder na het blokkeren de overtollige blokkeringsbuffer met een glazen Pasteurpipet.
  4. Voordat u de structurele vlek, vortex de vlek. Voeg 150 μL van de vlek toe aan elke buis. Plaats de monsters in een donkere doos op de rotator op kamertemperatuur voor 2 uur.
  5. Verwijder de vlek en was de weefsels vier keer in 1,5 mL van kamertemperatuur 1x PBS met 0,3% Triton X-100 gedurende 5 minuten op de rotator in een donkere doos. De monsters zijn nu klaar om te monteren op een dia.

6. Montageweefsel

  1. Na het wassen monsters in PBST, bereiden een microscoop dia om weefsel te monteren voor vlekken. Bereid extra benodigdheden voor, waaronder glazen afdekbonnen, een P200 pipet, 200 μL pipettips, schaar, duidelijke wapeningen, rechte randforceps, anti-fade tl-montagemedia, nagellak en een donkere doos om de dia's te bedekken.
  2. Label de dia om de monsters te identificeren en maak de dia schoon met kimwipes om ervoor te zorgen dat er geen vlekken zijn.
  3. Om ervoor te zorgen dat de hemithorax monsters niet worden beschadigd door de cover slip, bouwen van een "brug" met behulp van wapening labels. Neem een wapeningslabel, snijd het in tweeën, en plaats elke helft ongeveer 15 mm uit elkaar. Deze afstand moet kleiner zijn dan de breedte van de afdekslip. Herhaal deze stap vier keer om een "brug" te voltooien die 5 labels hoog is.
  4. Neem de P200 pipet en wijzig een tip door 1/5van de tip af te snijden om de monsters naar de glijbaan over te brengen. Monsters moeten worden overgebracht naar de dia in het midden van de brug.
  5. Neem de rand van een lab veeg en verwijder overtollige PBST. Met behulp van tangen, schik de DDLM's zodanig dat alle monsters worden geconfronteerd spierzijde omhoog en cuticula kant naar beneden.
  6. Breng met behulp van een standaard P200 pipettip 70 μL montagemedia aan op de glijbaan, waardoor luchtbellen worden vermeden. Doe de media in een cirkelvormig patroon binnen de versterkingen die van de buitenkant in het centrum beginnen.
  7. Plaats een cover slip over de versterkingen.
  8. Gebruik nagellak om de buitenranden rond de omtrek van de coverslip te coaten. Breng royaal aan om een volledige afdichting van het weefsel te vormen.
  9. Plaats de glijbaan op een vlakke ondergrond in het donker, waardoor ten minste 10 minuten te drogen en te voorkomen dat foto-bleken of verlies van fluorescentie. Dia's kunnen nu worden gebruikt voor beeldvorming onmiddellijk, of anderszins opgeslagen in een diamap op -20 °C voor latere weergave.

7. Alternatief: Kleuring met primaire antilichamen

LET OP: Deze sectie is optioneel en moet indien gewenst direct tussen de secties 4 en 5 worden gebruikt.

  1. Om weefsel met primaire antilichamen te bevlekken, dompel weefsel onder in het blokkeren van buffer voor ten minste 1 uur.
  2. Bereid primaire antilichaam met de juiste verdunning in het blokkeren van buffer. Bereid minimaal voldoende antilichaammengsel voor om 150 μL per groep te hebben. Houd er rekening mee dat de monsters nog steeds worden bewaard. Bewaar op 4 °C tot klaar voor gebruik.
  3. Verwijder overtollige blokkeringsbuffer met een Pasteur pipet. Laat het primaire antilichaam kort worden gecontexseerd en voeg 150 μL antilichaammengsel toe aan elke groep en plaats monsters 's nachts op 4 °C.
  4. Op de volgende dag, verwijder primaire antilichaam en was weefsel 4 keer met PBST gedurende 5 min elk op een rotator.
  5. Bereid secundaire vlek in het blokkeren van buffer. Voeg de secundaire vlek toe aan het monster en bewaar deze vervolgens 2 uur op kamertemperatuur in een donkere doos op de rotator.
    LET OP: De secundaire kleuring kan ook HRP en phalloidin bevatten.
  6. Na de 2 uur incubatie, om de secundaire vlek wassen weefsel te verwijderen 4 keer gedurende 5 min met PBST en ga naar de montage.

Resultaten

De generatie transgene vliegen die menselijk Tar-Binding Protein van 43 kDa mutant (TDP-43M337V)uitdrukken, wordt vertegenwoordigd door het schema (Figuur 1A). Dit toont de toepassing aan van het binaire Gal4/UAS-systeem in Drosophila27. De illustratie toont een hemithorax met zes spiervezels, A\u2012F gaande van de meest dorsale vezel A naar de meest ventrale F (Figuur 1B)11,12. Om de synaptische integriteit te beoordelen, werden NMJ's bevlekt met HRP en Phalloidin (Figuur 1C\u2012E). Motorneuronen in TDP-43M337V mutanten(figuur 1F)hebben weinig tot geen HRP-kleuring op dag 21, terwijl WT (Oregon-R) intact blijft(figuur 1C). Er zijn geen zichtbare verschillen in spiervlekken(figuur 1D,G). De veranderingen in de bruto morfologie waargenomen bij TDP-43M337V mutanten toont aan hoe synaptische integriteit kan worden betrokken bij een neurodegeneratieve ziekte model van amyotrofische laterale sclerose (ALS) met behulp van de volwassen DLM model. Naast structurele kleuring, kleuring van de DLM NMJs kan ook een beoordeling van synaptische integriteit met presynaptic (Figuur 2A\u2012R) en post synaptic (Figuur 2S\u2012X) markers. Samen illustreren deze resultaten hoe dit dissectieprotocol kan worden toegepast op het bestuderen van DLM-weefsel bij neurodegeneratieve ziekten.

Een belangrijk aspect van deze dissectie is de toepassing van vloeibare stikstof te knipperen bevriezen van het weefsel om de bissectie gemakkelijker te maken. Het nut van de vloeibare stikstof wordt aangetoond in WT-vliegen met vloeibare stikstof waar spierweefsel geen schade of gejat vezels heeft(figuur 3A\u2012C). Zonder vloeibare stikstof kan het weefsel moeilijker te ontleden zijn. Bijvoorbeeld, na dit protocol en het overslaan van de vloeibare stikstof flash bevriezing stap kan het weefsel gevoeliger zijn voor schade door de dissectie tools zoals beschadigde neuronen(Figuur 3D) of beschadigde spiervezels (Figuur 3E). De toepassing van vloeibare stikstof helpt weefselschade te voorkomen die kan optreden bij het werken met DLM-weefsel, ongeacht het genotype van het monster(figuur 3C en 3F).

figure-results-1
Figuur 1: Progressieve denervation van DLM synapsen in een Drosophila model van ALS. (A) De generatie van ALS transgene vliegen die een menselijke mutantvorm van Tar-Binding Protein van 43 kDa (TDP-43) uitdrukken, wordt weergegeven in het schema. (B) De illustratie toont de vorm en oriëntatie van een hemithorax in een volwassen Drosophila. Met behulp van het protocol kunnen we het progressieve verlies van synaptische integriteit van DLM NMJ-synapsen waarnemen door structurele kleuring van motorneuronen met HRP (groen) en spierweefsel met Phalloidin (magenta). Ons model toont het verlies van synaptische integriteit in een volwassen model van ALS door de generatie van volwassen vliegen uitdrukken van een mutant van menselijke TDP-43M337V in motorneuronen (Figuur 1F\u2012H) in vergelijking met WT (Figuur 1C \u2012E) vliegt in spiervezel C. Pijlen markeren voorbeelden van een WT-synaps(figuur 1C)en een voorbeeld van verlies van synaptische integriteit. Schaalbalk =20 μm bij 63x vergroting. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Beoordelen van synaptische integriteit met behulp van presynaptische markers bij volwassen NMJ's. Synaptische integriteit kan ook worden beoordeeld met behulp van presynaptische en postsynaptische markers in WT vliegen die 14 dagen oud zijn in spiervezel C. De presynaptische markers Synapsin (B), Syntaxin (H) en Bruchpilot (BRP) (N) zijn co-bevlekt met HRP (A, G, M). De kleuring toont de lokalisatie van deze markers op de presynaptische terminals (C, I, O). Bij een hogere vergroting illustreren de afbeeldingen de lokalisatie van Synapsin (E), Syntaxin (K) en BRP (Q) met HRP (D, Jen P) in meer detail(figuur F, Len R). We tonen ook een postsynaptische marker Glutamaat Receptor III (GluRIII) (T) co-bevlekt met HRP (S). De co-kleuring toont het nut van deze markers (U). Bij een hogere vergroting illustreren de representatieve afbeeldingen de lokalisatie(X)van GluRIII(W)en HRP(V)op respectievelijk het postsynaptische spierweefsel en de presynaptische terminals. Schaalbalk voor panelen A\u2012C, G-I, M\u2012O, S\u2012U vertegenwoordigen 20 μm bij 63x vergroting. Schaalbalk voor panelen D\u2012F, 2J-2L, 2P-2R en 2V-2X vertegenwoordigen 10 μm bij 63x vergroting. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Nut van vloeibare stikstof voor DLM-dissecties. Om het nut van vloeibare stikstof voor de DLM-dissecties aan te tonen, tonen we een vergelijking van dag 21 WT-vliegen met en zonder vloeibare stikstof uit spiervezel C. Met vloeibare stikstof blijft Phalloidin (B)intact en brengt de HST-kleuring(A, C) niet in gevaar. Zonder vloeibare stikstof wordt spierweefsel vezelig en moeilijk te snijden(E)en HRP-kleuring(D, F)wordt aangetast door technische fouten. Witte pijlen tonen een gebied zonder spierschade in met vloeibare stikstof(B) en beschadigd spierweefsel(E). Schaalbalk = 20 μm bij 63x vergroting. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussie

Met behulp van de methoden beschreven in dit protocol, bieden we een eenvoudige aanpak voor dissectie van het DLM-weefsel en laten we zien hoe dit kan worden toegepast om synaptische integriteit te beoordelen door middel van structurele kleuring en synaptische markers in volwassen Drosophila. Een cruciale stap in het protocol dat het DLM weefsel gemakkelijker te ontleden maakt is de flitser bevriezen met vloeibare stikstof. Zonder deze stap is het weefsel minder stevig en moeilijker om precies te snijden zoals waargenomen in figuur 3. Dit protocol bouwt voort op eerdere dissectiemethoden om het behoud van zowel motorneuronen als spierweefsel mogelijk te maken18,19,20,21,22,23. Een beperking van dit protocol is dat bij het maken van de cut down de middellijn voor de bisection, kan het moeilijk zijn om twee schone preps per thorax te krijgen. Een manier om te zorgen voor ten minste een hemithorax per vlieg, u met opzet afgesneden aan de ene kant van de thorax om een schone prep te krijgen. Met deze wijziging kan het ook nodig zijn om extra overtollig weefsel uit de snede te verwijderen om het monster op te ruimen met de blade breaker. Voor degenen die nieuw zijn in deze techniek, met voortdurende praktijk, zal de nauwkeurigheid van de bissectie toenemen.

De hier beschreven methode stelt onderzoekers in staat om de structurele integriteit van volwassen DLM-NMJ's op elk moment gedurende hun levensduur eenvoudig te beoordelen. Een groot voordeel van dit protocol is de mogelijkheid om synaptische integriteit in neurodegeneratieve ziektemodellen te openen met behulp van synaptische markers. We tonen aan dat deze toepassing kan helpen bij het visualiseren van veranderingen in de bruto morfologie met structurele kleuring(figuur 1C\u2012H). Bovendien kan synaptische integriteit worden beoordeeld met kleuring van presynaptische markers, waaronder maar niet beperkt tot Synapsin28 (Figuur 2A\u2012F), Syntaxin29 (Figuur 2G\u2012L) en BRP30 (Figuur 2M\u2012R). Het postsynaptische spierweefsel kan ook worden beoordeeld met behulp van de Glutamate Receptor III subunit antilichaam31 (Figuur 2S\u2012X), waaruit het nut van dit protocol.

Onderzoekers kunnen deze dissectiemethode ook gebruiken om functionele gegevens aan te vullen om de structurele integriteit van synapsen in verband met een breed scala aan ziekten grondig te onderzoeken. Deze synapsen maken ook functionele analyse mogelijk door middel van elektrofysiologische opnamen32,33,34 en de vluchttest10. Dit protocol kan ook gemakkelijk toegang tot het weefsel voor vele toepassingen en testen. Toekomstige studies kunnen dit protocol bijvoorbeeld gebruiken om synaptische veranderingen te kwantificeren door kwantificering van de dichtheid en het aantal synapsen15,16. Terwijl het hier beschreven protocol specifiek synaptische integriteit van motorneuronen onderzoekt, kunnen aanvullende protocollen voor het beoordelen van spiercelverlies ook met deze dissectie met behulp van TUNEL-kleuring35worden uitgevoerd. Om neuronale verlies te onderzoeken, dissectie van de thoracale ganglion36 kan ook worden gebruikt met TUNEL kleuring. We verwachten dat de hier beschreven dissectie meer toepassingen zal hebben voor toekomstige studies die leeftijdsgerelateerde pathologieën en neurodegeneratieve ziekten beoordelen.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (R01 NS110727) aan D.T.B.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
32% FormaldehydeElectron Microscopy Sciences15714Weefselbehoud
Alexa Fluor 568 goat anti mouseFisher ScientificA11031Labels primaire antilichamen. Gebruikt in 1:200 concentratie.
Alexa Fluor 568 goat anti rabbitFisher ScientificA11036Labels primaire antilichamen. Gebruikt in 1:200 concentratie.
anti- Bruchpilot (BRP) antibodyDevelopmental Studies Hybridoma BankNC82Kleurt de actieve zones in presynaptische neuronen. Gebruikt in 1:25 concentratie.
anti-GluRIII antibodyGift from Aaron DiAntonioN/ALabels glutamaatreceptorsubeenheden. Gebruikt in 1:1000 concentratie.
anti-Synapsin antibodyDevelopmental Studies Hybridoma Bank3C11Labels het synaptische eiwit synapsine. Gebruikt in 1:50 concentratie.
anti-Syntaxin antibodyDevelopmental Studies Hybridoma Bank8C3Labels het synaptische eiwit syntaxine. Gebruikt in 1:10 concentratie.
BenchRockerGenesee Scientific31-302Roterende monsters tijdens het kleuren
Blade BreakerFine Science Tools10053-09Gebreik voor het vasthouden van veerbladen
cover slipsFisher Scientific12548AVoor het monteren van weefsel
cryogenic glovesVWR97008-198Beschermt handen tegen vloeibare stikstof
cryogenic tweezersVWR82027-432Houdt 2,0 mL buisje in vloeibare stikstof
dewar flask-1900 mLThomas Scientific5028M54Houdt vloeibare stikstof
Feather BladesElectron Microscopy Sciences72002-01Mesjes voor scalpel
Fine Forecps x 2Fine Science Tools11252-20Een fijn paar voor het verwijderen van de middenlijn van de thorax. Het andere paar kan worden afgedempt met een slijpsteen.
FITC-conjugated anti HRPJackson Laboratories123-545-021Kleurt motorische neuronen. Gebruikt in 1:100 concentratie
freezer box (Black)Fisher Scientific14100FBeschermt monsters tegen licht
glass pasteur pipettesVWR14637-010Gebreik om monsters over te brengen
glass slidesFisher Scientific12550143Voor het monteren van weefsel
mounting media (vectashield) anti-fadeVWR101098-042Montagemedia behoudt fluorescerende signalering
nail polishElectron Microscopy Sciences72180Verzegelt microscoopglazen
normal goat serumFisher ScientificPCN5000Voorkomt niet-specifieke binding van antilichamen
paint brushGenesee Scientific59-204Overbrengen van vliegen
PBSFisher Scientific10-010-023Zoutoplossing voor disseceren en kleuren
Phalloidin 647AbcamAB176759Kleurt F-Actin in spierweefsel. Gebruikt in 1:1000 concentratie
plastic petri dish (100 mm)VWR25373-100Dissectiebakje
reinforcement labelsW.B. MasonAVE05722Biedt ondersteuning voor glasdeksel over het gemonteerde weefsel
sharpening blockGrainger1RDF5Fijne pincetten scherp houden en ook een apart paar doven
slide folderVWR10126-326Voorbeeldopslag
standard office scissorsW.B. MasonACM40618Versterkingslabels snijden
Sylgard 184Electron Microscopy Sciences24236-10Coating voor dissectiebakje
Triton-X-100Electron Microscopy Sciences22140Helpt bij het doorlaatbaar maken van weefsel
Vannas Disssection SissorsFine Science Tools1500-00Gebreik voor het verwijderen van vliegpoten en het maken van een incisie op de thorax

Referenties

  1. Casas, C., Manzano, R., Vaz, R., Osta, R., Brites, D. Synaptic failure: focus in an integrative view of ALS. Brain Plasticity. 1, 159-175 (2016).
  2. Lodato, M. A., et al. Aging and neurodegeneration are associated with increased mutations in single human neurons. Science. 359, 555-559 (2018).
  3. López-Erauskin, J., et al. ALS/FTD-linked mutation in FUS suppresses intra-axonal protein synthesis and drives disease without nuclear loss-of-function of FUS. Neuron. 100, 816-830 (2018).
  4. Munsie, L., et al. Retromer-dependent neurotransmitter receptor trafficking to synapses is altered by the Parkinson's disease VPS35 mutation p. D620N. Human Molecular Genetics. 24, 1691-1703 (2015).
  5. Oddo, S., et al. Triple-transgenic model of Alzheimer's disease with plaques and tangles: intracellular Aβ and synaptic dysfunction. Neuron. 39, 409-421 (2003).
  6. Selkoe, D. J. Alzheimer's disease is a synaptic failure. Science. 298, 789-791 (2002).
  7. Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Current Opinion in Neurobiology. 17, 35-42 (2007).
  8. Jan, L., Jan, Y. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. The Journal of Physiology. 262, 189-214 (1976).
  9. Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila. Neuron. 22, 719-729 (1999).
  10. Babcock, D. T., Ganetzky, B. An improved method for accurate and rapid measurement of flight performance in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. , e51223(2014).
  11. Fernandes, J., Bate, M., Vijayraghavan, K. Development of the indirect flight muscles of Drosophila. Development. 113, 67-77 (1991).
  12. Fernandes, J., VijayRaghavan, K. The development of indirect flight muscle innervation in Drosophila melanogaster. Development. 118, 215-227 (1993).
  13. Fernandes, J. J., Keshishian, H. Patterning the dorsal longitudinal flight muscles (DLM) of Drosophila: insights from the ablation of larval scaffolds. Development. 122, 3755-3763 (1996).
  14. Fernandes, J. J., Keshishian, H. Nerve-muscle interactions during flight muscle development in Drosophila. Development. 125, 1769-1779 (1998).
  15. Hebbar, S., Fernandes, J. J. Pruning of motor neuron branches establishes the DLM innervation pattern in Drosophila. Journal of Neurobiology. 60, 499-516 (2004).
  16. Hebbar, S., Fernandes, J. J. A role for Fas II in the stabilization of motor neuron branches during pruning in Drosophila. Developmental Biolology. 285, 185-199 (2005).
  17. Danjo, R., Kawasaki, F., Ordway, R. W. A tripartite synapse model in Drosophila. PloS One. 6, (2011).
  18. Hunt, L. C., Demontis, F. Whole-mount immunostaining of Drosophila skeletal muscle. Nature Protocols. 8, 2496-2501 (2013).
  19. Kucherenko, M. M., et al. Paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila adult muscles. Journal of Visualized Experiments. , e2438(2010).
  20. Llamusi, B., et al. BSF and TBPH are mislocalized in the muscle sarcomere of a Drosophila myotonic dystrophy model. Disease Models & Mechanisms. 6, 184-196 (2013).
  21. Pantoja, M., Fischer, K. A., Ieronimakis, N., Reyes, M., Ruohola-Baker, H. Genetic elevation of sphingosine 1-phosphate suppresses dystrophic muscle phenotypes in Drosophila. Development. 140, 136-146 (2013).
  22. Schnorrer, F., et al. Systematic genetic analysis of muscle morphogenesis and function in Drosophila. Nature. 464, 287-291 (2010).
  23. Viswanathan, M. C., Blice-Baum, A. C., Schmidt, W., Foster, D. B., Cammarato, A. Pseudo-acetylation of K326 and K328 of actin disrupts Drosophila melanogaster indirect flight muscle structure and performance. Frontiers in Physiology. 6, 116(2015).
  24. Hebbar, S., Fernandes, J. J. Glial remodeling during metamorphosis influences the stabilization of motor neuron branches in Drosophila. Developmental Biology. 340, 344-354 (2010).
  25. Mahr, A., Aberle, H. The expression pattern of the Drosophila vesicular glutamate transporter: a marker protein for motoneurons and glutamatergic centers in the brain. Gene Expression Patterns. 6, 299-309 (2006).
  26. Ritson, G. P., et al. TDP-43 mediates degeneration in a novel Drosophila model of disease caused by mutations in VCP/p97. Journal of Neuroscience. 30, 7729-7739 (2010).
  27. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  28. Klagges, B. R., et al. Invertebrate synapsins: a single gene codes for several isoforms in Drosophila. Journal of Neuroscience. 16, 3154-3165 (1996).
  29. Fujita, S. C., Zipursky, S. L., Benzer, S., Ferrus, A., Shotwell, S. L. Monoclonal antibodies against the Drosophila nervous system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 7929-7933 (1982).
  30. Wagh, D. A., et al. a protein with homology to ELKS/CAST, is required for structural integrity and function of synaptic active zones in Drosophila. Neuron. 49, 833-844 (2006).
  31. Marrus, S. B., DiAntonio, A. Preferential localization of glutamate receptors opposite sites of high presynaptic release. Current Biology. 14, 924-931 (2004).
  32. Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. Electrophysiological recordings from the giant fiber pathway of D. melanogaster. Journal of Visualized Experiments. , e2412(2011).
  33. Maccioni, R., et al. Standardized phytotherapic extracts rescue anomalous locomotion and electrophysiological responses of TDP-43 Drosophila melanogaster model of ALS. Scientific Reports. 8, 16002(2018).
  34. Siddiqi, O., Benzer, S. Neurophysiological defects in temperature-sensitive paralytic mutants of Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73, 3253-3257 (1976).
  35. Wang, Z. H., Clark, C., Geisbrecht, E. R. Drosophila clueless is involved in Parkin-dependent mitophagy by promoting VCP-mediated Marf degradation. Human Molecular Genetics. 25, 1946-1964 (2016).
  36. O'Sullivan, A., et al. Multifunctional Wing Motor Control of Song and Flight. Current Biology. 28, 2705-2717 (2018).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Synaptische degeneratie bij Drosophilaanalyse van de neuromusculaire overgangdorsale longitudinale spierbeoordeling van synaptische integriteitconfocale microscopieanalysefluorescente antilichaamskleuringprotocol voor weefseldissectieflash freezing met vloeibare stikstofmodel voor neurodegeneratieve ziektenleeftijdsafhankelijke evaluatie van synapsen
Synaptische degeneratie visualiseren bij volwassen drosofie in combinatie met neurodegeneratie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.