Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Onderzoek naar flagella-gedreven beweeglijkheid in Escherichia coli door drie gevestigde technieken in een serie toe te passen

8.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61364

⸱

10 mei 2020

 , 
1Department of Molecular Biosciences, The University of Texas at Austin

In dit artikel

Samenvatting

Veel bacteriën gebruiken flagella-gedreven beweeglijkheid om door hun omgeving te navigeren en gunstige omgevingen te koloniseren, zowel individueel als als collectief. Hier wordt het gebruik aangetoond van drie gevestigde methoden die motiliteit als selectietool gebruiken om componenten / paden te identificeren die bijdragen aan zwem- en zwermmotiliteit.

Samenvatting

Beweeglijkheid is cruciaal voor het overleven en succes van veel bacteriesoorten. Er bestaan veel methoden om de beweeglijkheid te benutten om signaleringsroutes te begrijpen, om de functie en assemblage van flagellar-onderdelen op te helderen en om bewegingspatronen te onderzoeken en te begrijpen. Hier demonstreren we een combinatie van drie van deze methodieken. Motiliteit in zachte agar is de oudste en biedt een sterke selectie voor het isoleren van gain-of-function suppressor mutaties in motiliteit-aangetaste stammen, waar motiliteit wordt hersteld door een tweede mutatie. De cel-tethering techniek, eerst gebruikt om de roterende aard van de flagellar motor aan te tonen, kan worden gebruikt om de impact van signaleringseffectoren op de motorsnelheid en zijn vermogen om van draairichting te veranderen te beoordelen. De "grensovergang" test is recenter, waar zwemmende bacteriën kunnen worden klaargekmeld om over te schakelen naar collectief bewegen als een zwerm. In combinatie vertegenwoordigen deze protocollen een systematische en krachtige benadering van het identificeren van componenten van de motiliteitsmachines en het karakteriseren van hun rol in verschillende facetten van zwemmen en zwermen. Ze kunnen gemakkelijk worden aangepast om de beweeglijkheid bij andere bacteriesoorten te bestuderen.

Inleiding

Bacteriën gebruiken veel aanhangsels voor beweging en verspreiding in hun ecologischeniches 1. Flagella-gedreven beweeglijkheid is de snelste van deze, bevordert de kolonisatie van gunstige plaatsen als reactie op omgevingssignalen en draagt aanzienlijk bij aan het pathogene vermogen van sommige soorten2,3. Flagellated bacteriën kunnen individueel zwemmen in bulk vloeistof, of zwerm als een collectief over een semi-solide oppervlak4. Extracellulaire flagella hechten zich aan en worden aangedreven door roterende motoren ingebed in het membraan, die de kracht van ionengradiënten benutten om koppel te genereren dat rotatie1,2,4,5,6,7,8veroorzaakt. In E. coli, waarvan de motoren op een constant koppel9draaien, kan het motorvermogen worden gecategoriseerd in termen van rotatiesnelheid en schakelen van de rotor tussen de richting tegen de klok in (CCW) en de richting met de klok mee (CW). CCW-rotatie bevordert de vorming van een coherente flagellarbundel die de cel naar voren stuwt (lopen), terwijl een voorbijgaande schakelaar in rotatierichting (CW) ervoor zorgt dat de bundel gedeeltelijk of volledig wordt gedemonteerd10, en de cel zijn zwemrichting heroriënteert (tuimelen). E. coli loopt meestal een seconde en tuimelt voor een tiende van een seconde. De schakelfrequentie van de rotor of "tumble bias" wordt geregeld door het chemotaxis-signaleringssysteem, waarbij transmembrane chemoreceptoren externe chemische signalen detecteren en via fosforelay naar de flagellaire motor overbrengen om de runs uit te breiden als reactie op attractanten, of ze onderdrukken als reactie op giftige chemicaliën11,12. Zwemmotiliteit wordt uitgevoerd in 0,3% zachte agar.

Tijdens het zwermen navigeren bacteriën op een semi-vast oppervlak als een dicht collectief, waar groepen bacteriën in een continue wervelende beweging2,13,14,15stromen. E. coli zwermen vertonen veranderde chemosensorische fysiologie (lagere tumble bias), hogere snelheden en een hogere tolerantie voor antimicrobiële stoffen boven cellen zwemmen in bulk vloeistof16,17. Zwermers variëren in hun inzet van een overvloed aan strategieën die beweging helpen, waaronder oppervlakteactieve productie, hyperflagellatie en celverlenging2. Zwermen biedt bacteriën een concurrentievoordeel in zowel ecologische als klinische omgevingen18,19,20. Er zijn twee categorieën zwermbacteriën: gematigde zwermen, die alleen kunnen zwermen op media gestold met 0,5-0,8% agar, en robuuste zwermen, die over hogere agarconcentraties kunnen navigeren21.

Er bestaan verschillende testtesten om de zwemmotiliteit en de regelgeving ervan te ondervragen. Wanneer aangetast door mutaties of omgevingsomstandigheden, biedt de beweeglijkheid zelf een sterke selectie voor het identificeren van gain-of-function suppressor mutaties. Deze suppressors kunnen echte revertanten van de oorspronkelijke mutatie zijn, of pseudo-revertanten, waarbij een tweede mutatie de functionaliteit herstelt. Dergelijke mutanten kunnen worden geïdentificeerd door hele genoomsequencing (WGS). Een alternatief voor onbevooroordeelde suppressorselectie is een bevooroordeelde gerichte mutagenesestrategie (bijv. PCR mutagenese). Deze methoden werpen vaak licht op de functie of milieuregelgeving van het motiliteitsapparaat. Als het doel is om de motorische functie te bestuderen, dan is het herstel van wild-type motiliteit zoals gemeten in zachte agar mogelijk niet noodzakelijkerwijs wijzen op herstel van wild-type motor output. De cel-tethering assay, waarbij cellen door een enkel flagellum aan een glasoppervlak worden bevestigd en de rotatie van het cellichaam vervolgens wordt gecontroleerd, kan de eerste keuzetest zijn voor het beoordelen van motorisch gedrag. Hoewel er nu meer geavanceerde methodologieën beschikbaar zijn om motorische eigenschappen te monitoren , beperken de vereiste opstelling en toepassing van softwarepakketten voor bewegingsanalyse het wijdverbreide gebruik ervan22,23,24,25. De cel-tethering assay vereist alleen dat de flagella wordt geschoren, waardoor de korte filamenten aan een glazen dia kunnen worden gehecht, gevolgd door het filmen van de rotatie van het cellichaam. Hoewel de geregistreerde motorische snelheden laag zijn in deze test vanwege de hoge belasting die het cellichaam uitoefent op het flagellum, heeft deze test niettemin bijgedragen aan waardevolle inzichten in chemotactische reacties26,27,28,29, en blijft een geldig onderzoeksinstrument zoals hieronder besproken.

Zwermmotiliteit stelt onderzoekers voor een andere uitdaging. Selectie van gain-of-function suppressors werkt alleen in zwermen die overvloedige oppervlakteactieve stoffen produceren en gemakkelijkzwermen 13. Oppervlakteactieve niet-producenten zoals E. coli zijn kieskeurig met betrekking tot de keuze van agar, mediasamenstelling en vochtigheid van het milieu2,13,14,21. Zodra zwermcondities zijn vastgesteld, is de grensovergangstest17 een nuttige methodologie om het vermogen van een zwerm te ondervragen om door nieuwe / zware omstandigheden te navigeren. Hoewel de onderstaande protocollen betrekking hebben op E. coli, kunnen ze gemakkelijk worden aangepast voor toepassing bij andere soorten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Isolatie van suppressor mutanten in motiliteit-deficiënte stammen

OPMERKING: Gebruik deze methode als een brede 'catch-all' om de algemene aard van het motiliteitsdefect te identificeren.

  1. Zacht-agar plaatvoorbereiding
    OPMERKING: Soft-agar, ook wel motiliteit- of zwem-agar genoemd, is een laag percentage agar (~0,2-0,35% w/v), lang gebruikt om chemotaxis31,32te meten.
    1. Voeg 3 g bacto-agar (0,3% w/v) en 20 g LB toe aan een maatkolf met ronde bodem van 2 L. Voeg 1 L ddH2O (dubbel gedestilleerd water) toe aan de kolf en meng de suspensie gelijkmatig met behulp van een roerstaaf en een magneetroerplaat.
    2. Autoclaaf gedurende 20 min bij 121 °C.
    3. Laat afkoelen met zachte agitatie met behulp van de staaf/plaat zoals hierboven. Wanneer de temperatuur ongeveer 50 °C bereikt, giet dan 25 ml in steriele petrischalen (100 mm x 15 mm) en laat de gesmolten agar ten minste 1 uur op zijn plaats zetten met deksel, voor gebruik binnen 16 uur.
  2. Kweekvoorbereiding, inenting en isolatie van suppressormutanten
    OPMERKING: E. coli ingeënt in het centrum van voedingsrijke media gestold met zachte agar consumeren voedingsstoffen lokaal, waardoor een nutriëntengradiënt ontstaat die ze volgen. Als ze naar buiten bewegen, verschijnen gedefinieerde 'ringen' (figuur 1A), die gerelateerd zijn aan specifieke chemoattractanten waarop de bacteriën reageren. Defecten in het chemotaxis-systeem of structurele componenten van de flagellamotor kunnen de prestaties in deze test in gevaar brengen. Vaak ontstaan mutanten met een motiliteitsvoordeel tijdens de screening en kunnen ze worden gezien vanaf enkele of meerdere punten langs de rand van de ring, van waaruit ze 'uitfakkelen' (figuur 1C). Men zal merken dat de buitenste rand van het zwemfront gemakkelijk contrasteert met de ongekoloniseerde maagdelijke zachte agar.
    1. Kweek 's nachts culturen van de gewenste motiliteitsdeficiënte stam in 5 ml Lennox Bouillon (LB; 10 g/L tryptone, 5 g/L gistextract en 5 g/L NaCl, Tafel van Materialen) bij 30 °C met horizontaal schudden (220 r.p.m.). De volgende dag, subcultuur (1:100 verdunning) in verse LB, groeiend onder dezelfde omstandigheden tot exponentiële fase (OD600 van 0,6).
    2. Ent 6 μL van de cultuur in het midden van een zachtzwamplaat (1.1) met behulp van een pipet en duw de geladen steriele punt in de agar om de inhoud voorzichtig te verdrijven. Breng over naar 30 °C en incubeer (figuur 1B), totdat de beweeglijkheid "flares" zichtbaar is, afkomstig van het inentingspunt of de periferie van de motiliteitsringen, meestal in 24-36 uur (figuur 1C).
      OPMERKING: Bij motiliteitstesten moet een wilde stam naast de mutante isolaten worden ingeënt ter vergelijking. Deze wilde stam toont de karakteristieke concentrische chemotactische ringen(figuur 1A)en vult de plaat binnen 8-10 uur.
    3. Gebruik een steriele draadlus om de cellen uit het 'flare'-gebied te tillen en streep om enkele kolonies te zuiveren op een LB harde agarplaat (LB bereid zoals hierboven, gestold met 15 g/L bacto-agar).
    4. Pluk enkele kolonies uit de streepplaat met behulp van een steriele draadlus en zuiver opnieuw door strepen voor enkele kolonies om isolatie van een 'zuiver' kolonieisolaat te garanderen.
  3. Bevestiging en karakterisering van suppressor mutanten
    1. Bevestig dat de geïsoleerde suppressor mutant(en) de beweeglijkheid hebben hersteld. Bereid zachte agarplaten (1.1) en culturen voor op soorten van belang (zoals in 1.2.1), met inbegrip van wilde-type en de beginnende 'motility-deficiënte' stam ter vergelijking.
    2. Ent de platen (zoals in 1.2.2) en incubeer bij 30 °C gedurende 8-10 uur.
    3. Noteer de diameter van de buitenste ring (rand van de cirkel) en vergelijk om vast te stellen welke van de isolaten de beweeglijkheid aanzienlijk hebben hersteld.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om platen te fotograferen tijdens het verloop van het experiment. Gebruik voor het beste resultaat een "emmer licht" apparaat30, waarbij een digitale camera boven een lichtbron is gemonteerd voor een betere verlichting om de diameter van de zwemkolonie te meten en te onderscheiden van niet-colonized agar.
    4. Onderworpen geverifieerde isolaten naar WGS indien nodig, waardoor voldoende 'sequentiedekking' mogelijk is om de mutaties die de wild-type functie herstelden positief te identificeren.

2. Kwantificeren van flagella motorisch gedrag via celgebonden

OPMERKING: Gebruik deze methode wanneer normaal loopgedrag (chemotaxis) in gevaar blijkt te zijn.

  1. Cultuurvoorbereiding en flagella scheren
    1. Bereid een exponentiële fasecultuur voor van de interessestam zoals beschreven in stap 1.2.1.
    2. Pellet 10 ml cellen door centrifugeren bij 2.000 x g gedurende 3 minuten voordat u deze in 10 ml met filter gesteriliseerde motiliteitsbuffer (MB; 10 mM kaliumfosfaatbuffer [0,0935 M K2HPO 4 , 0,0065 M KH 2 PO 4 , pH 7,0], 0,1 m MH [0,0935 M K 2 HPO4,0,0065 M KH2PO4, pH 7,0]
      OPMERKING: MB ondersteunt beweeglijkheid, maar ondersteunt geen bacteriële groei
    3. Herhaal stap 2.1.2 nog twee keer voordat u de uiteindelijke pellet in 1 ml MB opnieuw opgeeft.
    4. Breng de celsuspensie over in een spuit van 1 ml en bevestig een 23G-naald aan het uiteinde. Monteer een identiek spuit-/naaldapparaat en bevestig de twee aan elkaar via 6 inch polyethyleen buizen (binnendiameter van 0,58 mm) strak omhuld over elke naaldpunt.
    5. Scheer de flagella (ze zijn breekbaar en breken gemakkelijk) door de celsuspensie voorzichtig 50x heen en weer van de ene spuit naar de andere te brengen, met 1 minuut pauzes tussen elke 10 passen.
    6. Centrifugeer de geschoren cellen gedurende 3 minuten op 2.000 x g en resuspend in een eindvolume van 500 μL MB.
  2. Diavoorbereiding en celgebonden
    1. Bereid een celfixatiekamer voor door een afdeklip van 18 mm x 18 mm over een glazen microscoopschuif van 3 inch x 1 inch x 1 mm te stapelen, gescheiden door dubbelzijdige tape (afbeelding S1).
    2. Spoel de kamer door met 0,01% (m/v) polylysineoplossing door op de bovenkant van de kamer aan te brengen. Kantel de onderrand (de afdeklip vlak met de microscoopschuif) op een taakwisser (tissuepapier) om de oplossing door de kamer te trekken (afbeelding S1). Incubeer vervolgens 10 minuten op kamertemperatuur.
    3. Was de kamer driemaal met 40 μL MB met behulp van zoals beschreven in stap 2.2.2
    4. Voeg 40 μL van de geschoren celsuspensie (hierboven voorbereid) toe aan de bovenkant van de kamer en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om cellen aan de afdeklip te laten hechten.
    5. Spoel de kamer voorzichtig door met 40 μL MB zoals in 2.2.3 om niet-vastgemaakte cellen te verwijderen.
  3. Celrotatieregistratie en kwantificering
    1. Breng de microscoopschuif geladen met vastgebonden cellen over naar het microscoopstadium.
    2. Scan met behulp van fasecontrastmicroscopie en een 100x-doelstelling de populatie op cellen die op hun plaats zijn bevestigd en roteren op een enkele as, d.w.z. vloeiende rotaties op een vast punt in plaats van te presenteren onder een hoek waarin de cel in en uit focus beweegt (Video 1).
    3. Gebruik een commerciële microscoop en bijbehorende camera. Open de bijbehorende software, zorg ervoor dat cellen van belang scherp zijn en klik op video-acquisitie om de celrotatie gedurende één minuut op te nemen (met 10 frames per seconde of hoger).
    4. Kwantificeer bij het afspelen van video het aantal volledige rotaties per minuut en het aantal keren dat de cel van richting verandert (schakelfrequentie).
      OPMERKING: Rotatiesnelheden en schakelfrequentie kunnen te snel zijn om met het oog te meten, dus het wordt aanbevolen om videosoftware te gebruiken die langzame / fijne weergave biedt, of een geautomatiseerd softwaresysteem gebruikt om rotatiepatronen te kwantificeren33. Een alternatief zou zijn om de viscositeit van de MB te verhogen met behulp van methylcellulose (of een soortgelijk middel) om de rotatie van snellere bacteriën te vertragen en op te lossen of te compenseren wanneer camera's met lage framerates in gebruik zijn.
    5. Herhaal stap 2.3.2 met biologische replica's om een weergave van de populatie van belang samen te stellen.

3. Voorbereiding van zwermen in een grensoverschrijdingstest

OPMERKING: Gebruik deze methode om de impact van een mutatie of aandoening op de beweeglijkheid van de groep te beoordelen. Zwerm-agar verwijst naar agar waar het percentage meestal hoger is dan dat van soft-agar. In zachte agar (0,3 %) zwemmen cellen individueel in de agar. In zwermzwam (0,5% en hoger) bewegen cellen als een groep op het oppervlak. Hoewel zwermplaten hier moeten worden gebruikt, hebben zwemplaten een langere houdbaarheid en kunnen ze meerdere dagen worden gebruikt. Onze persoonlijke voorkeur is om te gebruiken in 1-2 dagen.

  1. Voorbereiding van zwermzwam
    1. Voeg 5 g Eiken agar (0,5% w/v) en 20 g LB toe aan een ronde bodemkolf van 2 L. Voeg 1 L ddH2O toe aan de kolf en meng de suspensie gelijkmatig met behulp van een roerstaaf en een magneetroerplaat.
    2. Autoclaaf gedurende 20 min bij 121 °C.
    3. Laat afkoelen met zachte agitatie om luchtbellen te voorkomen met behulp van de staaf / plaat zoals hierboven. Voeg bij ongeveer 50 °C met filtersterilisatie gesteriliseerde glucose toe voor een eindconcentratie van 0,5 %.
    4. Giet 25 ml in steriele petrischalen (100 mm x 15 mm) en laat het op kamertemperatuur gedurende ten minste 14 uur en niet meer dan 20 uur instellen. Niet bewaren voor toekomstig gebruik.
  2. Inenting en incubatie van zwermplaten
    1. Ent 6 μL van een mid-exponentiële cultuur (bereid zoals in 1.2) door bovenop de agar te spotten.
    2. Laat het deksel 5-10 minuten staan en vervang wanneer het entmateriaal in het agaroppervlak is opgedroogd.
    3. Incubeer bij 30 °C gedurende 8 uur. Vermijd de verleiding om de zwermvoortgang te inspecteren door het deksel te verwijderen, omdat dit zal bijdragen aan het drogen van de agar en zwermen zal verminderen.
      OPMERKING: De incubatietijd kan variëren afhankelijk van het fenotype van de stam. Sommige geïsoleerde mutaties kunnen het zwermvermogen belemmeren en vereisen een verminderd percentage agar of een langere incubatieperiode.
  3. Voorbereiding van grensoverschrijdende testplaten
    OPMERKING: Deze test maakt gebruik van een gemodificeerde petrischaal, waarbij een plastic scheiding (rand) twee kamers creëert in plaats van één (figuur 2A). Elke kamer kan onafhankelijk van de andere worden voorbereid en biedt verschillende voorwaarden voor zwermen, voordat de twee worden 'verbonden'. Afhankelijk van het experimentele ontwerp kan de eerste kamer (links aangeduid) worden bereid met zwemagar (0,3% w/v) of zwermagar (0,5% w/v) van waaruit de bacteriën over de grens kunnen migreren naar de rechterkamer met zwermagar +/- elk vereist supplement of uitdaging (bijv. antibiotica). Migratie op een van beide agars wordt meestal gemeten / vergeleken door de breedste diameter van bacteriële kolonisatie (van rand tot rand) vanaf het oorspronkelijke punt van inenting vast te houden.
    1. Bereid zwem agar voor zoals beschreven in 1.1 indien nodig.
    2. Bereid zwermzwam voor zoals beschreven in 3.1.
    3. Giet ~30 ml zwermzwam (eventueel met de gewenste suppletie) in de rechterkamer van een petrischaal met twee compartimenten (100 mm x 15 mm), tot het punt waar het waterpas staat met de plastic scheidingswand tussen de kamers, maar niet naar links overloopt (Afbeelding 2B).
    4. Nadat de agar is uitgehard, vult u de linkerkamer met ~30 ml zwem- of zwermagar, opnieuw tot het contactpunt met de plastic scheiding (figuur 2C). Voordat de agar wordt ingesteld, gebruikt u een steriele pipetpunt om de agar voorzichtig over de rand te slepen om de twee zijden te verbinden met een ~ 1 mm hoge agarbrug die de hele lengte van de scheiding overspant (Afbeelding 2D).
    5. Laat de plaat drogen bij kamertemperatuur (3.1).
      OPMERKING: Een alternatieve methode voor het maken van een brug is om de linkerkameragar te laten drogen en vervolgens langzaam ~ 100 μL gesmolten zwermzwam langs de plastic verdeler te pipetten om de twee kamers te overbruggen (3.4). Ent de platen op de linkerkamer zoals hierboven beschreven voor zwemmen (1.2.2) of zwerm (3.2) agar, voordat u gedurende 12-16 uur op 30 °C broedt, of totdat zwermen voldoende vooruitgang hebben geboekt boven de rechterkamer om vergelijkingen tussen interessestammen mogelijk te maken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De isolatie van pseudo-revertanten in een E. coli stam waarvan de beweeglijkheid wordt aangetast door hoge niveaus van het signaalmolecuul c-di-GMP, werd gedetailleerd beschreven in recent werk van ons lab34. Deze stam (JP1442) had twee mutaties: ΔyhjH en ΔycgR. YhjH is het meest actieve fosfodiësterase dat c-di-GMP in E. coliafbreekt. Afwezigheid van YhjH leidt tot verhoogde c-di-GMP niveaus en remming van de beweeglijkheid. YcgR is een c-di-GMP effector. In co...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De isolatie en karakterisering van suppressormutaties hebben met succes bijgedragen tot het identificeren van belangrijke componenten van het chemotaxis-systeem35,36,37, evenals de motormachines zelf38,39,40. Tijdens het gebruik van Protocol 1 is het belangrijk om meerdere onafhankelijke replica's op te nemen om de isolatie van een groo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health grant GM118085 en gedeeltelijk door de Robert Welch Foundation (subsidie F-1811 aan R.M.H.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagents
Bacto Dehydrated AgarFisher ScientificDF0140-15-4
EDTA Disodium Salt, DihydrateFisher Scientific02-002-786
Eiken agarEiken Chemical Co. JapanE-MJ00Essential voor E. coli swarming
Glucose D (+)Fisher Scientific410955000
LB (Lennox) BrothFisher ScientificBP1427-500
Poly-L-lysine Solution (0.1%)Sigma-AldrichP8920
Potassium chloride (KCl)Fisher Scientific18-605-496
Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4)Fisher ScientificBP362-500
Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4)Fisher ScientificBP363-500
Sodium chloride (NaCl)Fisher ScientificS271-500
Materials en apparatuur
CellSense microscoopbeeldsoftware (V. 1.6)OlympusOf gelijkwaardige software voor gebruikte microscoop
Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Dubbelzijdig plakbandFisher50-285-28
Frosted microscoopglazen 3x1x1mmFisher12-550-343
Olympus BX53 microscoopOlympusBX53Elke rechtopstaande of omgekeerde fasemicroscoop kan worden gebruikt
Petrischalen (100 mm diameter)Fisher ScientificFB0875712Voor zachte-agar-tests
Polyethyleen Nebulizer capillaire buis (0.58mm x 99mm 3.0m)Perkin Elmer9908265
Ronde Petrischaal met 2 compartimentenVWR89200-944Voor grensoverschrijdende tests
Veiligheidshypodermische naalden (23G)Fisher Scientific14-826A
Steriele spuit - 1 mLFisher scientific14-955-450
Task/weefseldoekjesFisher scientific06-666Of gelijkwaardige wegwerp weefseldoekjes
VWR micro dekglas 18x18mmVWR48366205
XM10 cameraOlympusXM10Of gelijkwaardige microscoopcamera

Referenties

  1. Jarrell, K. F., McBride, M. J. The surprisingly diverse ways that prokaryotes move. Nature Reviews in Microbiology. 6 (6), 466-476 (2008).
  2. Harshey, R. M. Bacterial motility on a surface: many ways to a common goal. Annual Reviews Microbiology. 57, 249-273 (2003).
  3. Duan, Q., Zhou, M., Zhu, L., Zhu, G. Flagella and bacterial pathogenicity. Journal of Basic Microbiology. 53 (1), 1-8 (2013).
  4. Nakamura, S., Minamino, T. Flagella-Driven Motility of Bacteria. Biomolecules. 9 (7), (2019).
  5. Haiko, J., Westerlund-Wikstrom, B. The role of the bacterial flagellum in adhesion and virulence. Biology (Basel). 2 (4), 1242-1267 (2013).
  6. Berg, H. C. E. coli in Motion. 1 edn. , Springer-Verlag. New York. (2004).
  7. Berg, H. C. The rotary motor of bacterial flagella. Annual Review of Biochemistry. 72, 19-54 (2003).
  8. Xing, J., Bai, F., Berry, R., Oster, G. Torque-speed relationship of the bacterial flagellar motor. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 103 (5), 1260-1265 (2006).
  9. Chen, X., Berg, H. C. Torque-speed relationship of the flagellar rotary motor of Escherichia coli. Biophysics Journal. 78 (2), 1036-1041 (2000).
  10. Turner, L., Ryu, W. S., Berg, H. C. Real-time imaging of fluorescent flagellar filaments. Journal of Bacteriology. 182 (10), 2793-2801 (2000).
  11. Brown, M. T., Delalez, N. J., Armitage, J. P. Protein dynamics and mechanisms controlling the rotational behaviour of the bacterial flagellar motor. Current Opinion in Microbiology. 14 (6), 734-740 (2011).
  12. Parkinson, J. S., Hazelbauer, G. L., Falke, J. J. Signaling and sensory adaptation in Escherichia coli chemoreceptors: 2015 update. Trends in Microbiology. 23 (5), 257-266 (2015).
  13. Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
  14. Harshey, R. M., Partridge, J. D. Shelter in a Swarm. Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3683-3694 (2015).
  15. Ariel, G., et al. Swarming bacteria migrate by Levy Walk. Nature Communications. 6, 8396(2015).
  16. Partridge, J. D., Nhu, N. T. Q., Dufour, Y. S., Harshey, R. M. Escherichia coli Remodels the Chemotaxis Pathway for Swarming. mBio. 10 (2), (2019).
  17. Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107 (8), 3776-3781 (2010).
  18. Mobley, H. L., Belas, R. Swarming and pathogenicity of Proteus mirabilis in the urinary tract. Trends in Microbiology. 3 (7), 280-284 (1995).
  19. Burall, L. S., et al. Proteus mirabilis genes that contribute to pathogenesis of urinary tract infection: identification of 25 signature-tagged mutants attenuated at least 100-fold. Infections and Immunity. 72 (5), 2922-2938 (2004).
  20. Mazzantini, D., et al. FlhF Is Required for Swarming Motility and Full Pathogenicity of Bacillus cereus. Frontiers in Microbiology. 7, 1644(2016).
  21. Partridge, J. D., Harshey, R. M. Swarming: flexible roaming plans. Journal of Bacteriology. 195 (5), 909-918 (2013).
  22. Yuan, J., Berg, H. C. Resurrection of the flagellar rotary motor near zero load. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 105 (4), 1182-1185 (2008).
  23. Yuan, J., Fahrner, K. A., Berg, H. C. Switching of the bacterial flagellar motor near zero load. Journal of Molecular Biology. 390 (3), 394-400 (2009).
  24. Terasawa, S., et al. Coordinated reversal of flagellar motors on a single Escherichia coli cell. Biophysics Journal. 100 (9), 2193-2200 (2011).
  25. Nord, A. L., Sowa, Y., Steel, B. C., Lo, C. J., Berry, R. M. Speed of the bacterial flagellar motor near zero load depends on the number of stator units. Proceedings of the National Academy of Science. 114 (44), 11603-11608 (2017).
  26. Block, S. M., Segall, J. E., Berg, H. C. Adaptation kinetics in bacterial chemotaxis. J Bacteriol. 154 (1), 312-323 (1983).
  27. Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 83 (23), 8987-8991 (1986).
  28. Wolfe, A. J., Conley, M. P., Kramer, T. J., Berg, H. C. Reconstitution of signaling in bacterial chemotaxis. Journal of Bacteriology. 169 (5), 1878-1885 (1987).
  29. Blair, D. F., Berg, H. C. Restoration of torque in defective flagellar motors. Science. 242 (4886), 1678-1681 (1988).
  30. Parkinson, J. S. A "bucket of light" for viewing bacterial colonies in soft agar. Methods Enzymol. 423, 432-435 (2007).
  31. Adler, J. Chemotaxis in bacteria. Science. 153 (3737), 708-716 (1966).
  32. Wolfe, A. J., Berg, H. C. Migration of bacteria in semisolid agar. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 86 (18), 6973-6977 (1989).
  33. Kojadinovic, M., Sirinelli, A., Wadhams, G. H., Armitage, J. P. New motion analysis system for characterization of the chemosensory response kinetics of Rhodobacter sphaeroides under different growth conditions. Applied and Environmental Microbiology. 77 (12), 4082-4088 (2011).
  34. Nieto, V., et al. Under Elevated c-di-GMP in Escherichia coli, YcgR Alters Flagellar Motor Bias and Speed Sequentially, with Additional Negative Control of the Flagellar Regulon via the Adaptor Protein RssB. Journal of Bacteriology. 202 (1), (2019).
  35. Parkinson, J. S., Parker, S. R., Talbert, P. B., Houts, S. E. Interactions between chemotaxis genes and flagellar genes in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 155 (1), 265-274 (1983).
  36. Roman, S. J., Meyers, M., Volz, K., Matsumura, P. A chemotactic signaling surface on CheY defined by suppressors of flagellar switch mutations. Journal of Bacteriology. 174 (19), 6247-6255 (1992).
  37. Sanna, M. G., Simon, M. I. Isolation and in vitro characterization of CheZ suppressors for the Escherichia coli chemotactic response regulator mutant CheYN23D. Journal of Biological Chemistry. 271 (13), 7357-7361 (1996).
  38. Sockett, H., Yamaguchi, S., Kihara, M., Irikura, V. M., Macnab, R. M. Molecular analysis of the flagellar switch protein FliM of Salmonella typhimurium. Journal of Bacteriology. 174 (3), 793-806 (1992).
  39. Irikura, V. M., Kihara, M., Yamaguchi, S., Sockett, H., Macnab, R. M. Salmonella typhimurium fliG and fliN mutations causing defects in assembly, rotation, and switching of the flagellar motor. Journal of Bacteriology. 175 (3), 802-810 (1993).
  40. Ishida, T., et al. Sodium-powered stators of the bacterial flagellar motor can generate torque in the presence of phenamil with mutations near the peptidoglycan-binding region. Molecular Microbiology. 111 (6), 1689-1699 (2019).
  41. Barker, C. S., Meshcheryakova, I. V., Kostyukova, A. S., Samatey, F. A. FliO regulation of FliP in the formation of the Salmonella enterica flagellum. PLoS Genetics. 6 (9), 1001143(2010).
  42. Paul, K., Nieto, V., Carlquist, W. C., Blair, D. F., Harshey, R. M. The c-di-GMP binding protein YcgR controls flagellar motor direction and speed to affect chemotaxis by a "backstop brake" mechanism. Molecular Cell. 38 (1), 128-139 (2010).
  43. Qian, C., Wong, C. C., Swarup, S., Chiam, K. H. Bacterial tethering analysis reveals a "run-reverse-turn" mechanism for Pseudomonas species motility. Applied and Environmental Microbiology. 79 (15), 4734-4743 (2013).
  44. Manson, M. D., Tedesco, P. M., Berg, H. C. Energetics of flagellar rotation in bacteria. Journal of Molecular Biology. 138 (3), 541-561 (1980).
  45. Kuwajima, G. Construction of a minimum-size functional flagellin of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 170 (7), 3305-3309 (1988).
  46. Kuhn, M. J., et al. Spatial arrangement of several flagellins within bacterial flagella improves motility in different environments. Nature Communication. 9 (1), 5369(2018).
  47. Hranitzky, K. W., Mulholland, A., Larson, A. D., Eubanks, E. R., Hart, L. T. Characterization of a flagellar sheath protein of Vibrio cholerae. Infections and Immun. 27 (2), 597-603 (1980).
  48. Wang, Q., Frye, J. G., McClelland, M., Harshey, R. M. Gene expression patterns during swarming in Salmonella typhimurium: genes specific to surface growth and putative new motility and pathogenicity genes. Molecular Microbiology. 52 (1), 169-187 (2004).
  49. Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Molecular Microbiology. 79 (1), 240-263 (2011).
  50. McCarter, L., Silverman, M. Surface-induced swarmer cell differentiation of Vibrio parahaemolyticus. Molecular Microbiology. 4 (7), 1057-1062 (1990).
  51. Pearson, M. M., Rasko, D. A., Smith, S. N., Mobley, H. L. Transcriptome of swarming Proteus mirabilis. Infections and Immunity. 78 (6), 2834-2845 (2010).
  52. Swiecicki, J. M., Sliusarenko, O., Weibel, D. B. From swimming to swarming: Escherichia coli cell motility in two-dimensions. Integrative Biology (Cambridge). 5 (12), 1490-1494 (2013).
  53. Colin, R., Drescher, K., Sourjik, V. Chemotactic behaviour of Escherichia coli at high cell density. Nature Communication. 10 (1), 5329(2019).
  54. Partridge, J. D., Harshey, R. M. More than motility: Salmonella flagella contribute to overriding friction and facilitating colony hydration during swarming. Journal Bacteriology. 195 (5), 919-929 (2013).
  55. Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal Visualized Experiment. (98), e52338(2015).
  56. Chawla, R., Ford, K. M., Lele, P. P. Torque, but not FliL, regulates mechanosensitive flagellar motor-function. Science Reports. 7 (1), 5565(2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Bacteri le mobiliteitsoft agar assaycel tetheringtechniekborder crossing assayfasecontrastmicroscopiecentrifugeringsprotocolbereiding van swarm agarbereiding van mobiliteitsbufferflagellen shearing
Onderzoek naar flagella-gedreven beweeglijkheid in Escherichia coli door drie gevestigde technieken in een serie toe te passen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.