Veel bacteriën gebruiken flagella-gedreven beweeglijkheid om door hun omgeving te navigeren en gunstige omgevingen te koloniseren, zowel individueel als als collectief. Hier wordt het gebruik aangetoond van drie gevestigde methoden die motiliteit als selectietool gebruiken om componenten / paden te identificeren die bijdragen aan zwem- en zwermmotiliteit.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Onderzoek naar flagella-gedreven beweeglijkheid in Escherichia coli door drie gevestigde technieken in een serie toe te passen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Beweeglijkheid is cruciaal voor het overleven en succes van veel bacteriesoorten. Er bestaan veel methoden om de beweeglijkheid te benutten om signaleringsroutes te begrijpen, om de functie en assemblage van flagellar-onderdelen op te helderen en om bewegingspatronen te onderzoeken en te begrijpen. Hier demonstreren we een combinatie van drie van deze methodieken. Motiliteit in zachte agar is de oudste en biedt een sterke selectie voor het isoleren van gain-of-function suppressor mutaties in motiliteit-aangetaste stammen, waar motiliteit wordt hersteld door een tweede mutatie. De cel-tethering techniek, eerst gebruikt om de roterende aard van de flagellar motor aan te tonen, kan worden gebruikt om de impact van signaleringseffectoren op de motorsnelheid en zijn vermogen om van draairichting te veranderen te beoordelen. De "grensovergang" test is recenter, waar zwemmende bacteriën kunnen worden klaargekmeld om over te schakelen naar collectief bewegen als een zwerm. In combinatie vertegenwoordigen deze protocollen een systematische en krachtige benadering van het identificeren van componenten van de motiliteitsmachines en het karakteriseren van hun rol in verschillende facetten van zwemmen en zwermen. Ze kunnen gemakkelijk worden aangepast om de beweeglijkheid bij andere bacteriesoorten te bestuderen.
Inleiding
Bacteriën gebruiken veel aanhangsels voor beweging en verspreiding in hun ecologischeniches 1. Flagella-gedreven beweeglijkheid is de snelste van deze, bevordert de kolonisatie van gunstige plaatsen als reactie op omgevingssignalen en draagt aanzienlijk bij aan het pathogene vermogen van sommige soorten2,3. Flagellated bacteriën kunnen individueel zwemmen in bulk vloeistof, of zwerm als een collectief over een semi-solide oppervlak4. Extracellulaire flagella hechten zich aan en worden aangedreven door roterende motoren ingebed in het membraan, die de kracht van i....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Isolatie van suppressor mutanten in motiliteit-deficiënte stammen
OPMERKING: Gebruik deze methode als een brede 'catch-all' om de algemene aard van het motiliteitsdefect te identificeren.
- Zacht-agar plaatvoorbereiding
OPMERKING: Soft-agar, ook wel motiliteit- of zwem-agar genoemd, is een laag percentage agar (~0,2-0,35% w/v), lang gebruikt om chemotaxis31,32te meten.- Voeg 3 g bacto-agar (0,3% w/v) en 20 g LB toe aan een maatkolf met ronde bodem van 2 L. Voeg 1 L ddH2O (dubbel gedestilleerd water) toe aan de kolf en meng de suspensi....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De isolatie van pseudo-revertanten in een E. coli stam waarvan de beweeglijkheid wordt aangetast door hoge niveaus van het signaalmolecuul c-di-GMP, werd gedetailleerd beschreven in recent werk van ons lab34. Deze stam (JP1442) had twee mutaties: ΔyhjH en ΔycgR. YhjH is het meest actieve fosfodiësterase dat c-di-GMP in E. coliafbreekt. Afwezigheid van YhjH leidt tot verhoogde c-di-GMP niveaus en remming van de beweeglijkheid. YcgR is een c-di-GMP effector. In co.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De isolatie en karakterisering van suppressormutaties hebben met succes bijgedragen tot het identificeren van belangrijke componenten van het chemotaxis-systeem35,36,37, evenals de motormachines zelf38,39,40. Tijdens het gebruik van Protocol 1 is het belangrijk om meerdere onafhankelijke replica's op te nemen om de isolatie van een groo.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health grant GM118085 en gedeeltelijk door de Robert Welch Foundation (subsidie F-1811 aan R.M.H.).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| Bacto Dehydrated Agar | Fisher Scientific | DF0140-15-4 | |
| EDTA Disodium Salt, Dihydrate | Fisher Scientific | 02-002-786 | |
| Eiken agar | Eiken Chemical Co. Japan | E-MJ00 | Essential voor E. coli swarming |
| Glucose D (+) | Fisher Scientific | 410955000 | |
| LB (Lennox) Broth | Fisher Scientific | BP1427-500 | |
| Poly-L-lysine Solution (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | 18-605-496 | |
| Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Materials en apparatuur | |||
| CellSense microscoopbeeldsoftware (V. 1.6) | Olympus | Of gelijkwaardige software voor gebruikte microscoop | |
| Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Dubbelzijdig plakband | Fisher | 50-285-28 | |
| Frosted microscoopglazen 3x1x1mm | Fisher | 12-550-343 | |
| Olympus BX53 microscoop | Olympus | BX53 | Elke rechtopstaande of omgekeerde fasemicroscoop kan worden gebruikt |
| Petrischalen (100 mm diameter) | Fisher Scientific | FB0875712 | Voor zachte-agar-tests |
| Polyethyleen Nebulizer capillaire buis (0.58mm x 99mm 3.0m) | Perkin Elmer | 9908265 | |
| Ronde Petrischaal met 2 compartimenten | VWR | 89200-944 | Voor grensoverschrijdende tests |
| Veiligheidshypodermische naalden (23G) | Fisher Scientific | 14-826A | |
| Steriele spuit - 1 mL | Fisher scientific | 14-955-450 | |
| Task/weefseldoekjes | Fisher scientific | 06-666 | Of gelijkwaardige wegwerp weefseldoekjes |
| VWR micro dekglas 18x18mm | VWR | 48366205 | |
| XM10 camera | Olympus | XM10 | Of gelijkwaardige microscoopcamera |
Referenties
- Jarrell, K. F., McBride, M. J. The surprisingly diverse ways that prokaryotes move. Nature Reviews in Microbiology. 6 (6), 466-476 (2008).
- Harshey, R. M. Bacterial motility on a surface: many ways to a common goal. Annual Reviews Microbiology. 57
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
