Methodenartikel

Live-Cell Forward Genetische Benadering voor identificeren en isoleren developmental mutanten in Chlamydia trachomatis

DOI:

10.3791/61365

⸱

10 juni 2020

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Idaho

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol maakt gebruik van fluorescerende promotor-verslaggevers, live-cel microscopie, en individuele opname extractie in een gerichte voorwaartse genetische benadering te identificeren en isoleren van ontwikkelingsmutanten van Chlamydia trachomatis.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De intracellulaire bacteriële ziekteverwekker Chlamydia trachomatis ondergaat een ontwikkelingscyclus bestaande uit twee morfologisch discrete ontwikkelingsvormen. Het niet-replicante elementaire lichaam (EB) initieert infectie van de gastheer. Eenmaal binnen onderscheidt de EB zich in het reticulerende lichaam (RB). De RB ondergaat vervolgens meerdere replicatierondes, voordat het zich onderscheidt van de besmettelijke EB-vorm. Deze cyclus is essentieel voor chlamydial overleving als het niet schakelen tussen celtypen voorkomt dat gastheer invasie of replicatie.

Beperkingen in genetische technieken als gevolg van de obligate intracellulaire aard van Chlamydia hebben belemmerd identificatie van de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de cel-type ontwikkeling. We ontwierpen een nieuwe dual promoter-reporter plasmid systeem dat, in combinatie met live-cel microscopie, zorgt voor de visualisatie van celtype schakelen in real time. Om genen te identificeren die betrokken zijn bij de regulering van de ontwikkeling van het celtype, werd het live-cel promotor-reporter systeem ingezet voor de ontwikkeling van een voorwaartse genetische benadering door chemische mutagenese van de dubbele reporter stam, beeldvorming en tracking van Chlamydia te combineren met veranderde ontwikkelingskinetiek, gevolgd door kloonisolatie van mutanten. Deze voorwaartse genetische workflow is een flexibel instrument dat kan worden aangepast voor gerichte ondervraging in een breed scala van genetische trajecten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chlamydia trachomatis (Ctr) is een obligate intracellulaire ziekteverwekker die vordert door middel van een bifasische ontwikkelingscyclus die essentieel is voor zijn voortbestaan en proliferatie1. Deze cyclus bestaat uit twee ontwikkelingsvormen, het elementaire lichaam (EB) en het reticulate lichaam (RB). De EB is replicatie incompetent, maar bemiddelt celinvasie door middel van effector geïnduceerde endocytose2. Eenmaal in de gastheer, de EB rijpt om de replicative RB. De RB voert meerdere rondes van replicatie voorafgaand aan het omzetten terug naar de EB om latere rondes van infectie te starten.

De beperkte reeks van genetische hulpmiddelen heeft beperkt het grootste deel van het chlamydial onderzoek tot biochemische studies of het gebruik van surrogaatsystemen. Als gevolg daarvan was de opheldering van de genregulatie en de controle van de ontwikkelingscyclus moeilijk3,4. Een van de belangrijkste uitdagingen op chlamydial gebied is de hoge resolutie temporele tracking van de chlamydial ontwikkelingscyclus en de identificatie van de eiwitten die betrokken zijn bij de regelgeving. Genexpressie tijdens de chlamydial ontwikkelingscyclus wordt traditioneel uitgevoerd door destructieve "eindpunt"-methoden, waaronder RNAseq, qPCR en vaste celmicroscopie5,6. Hoewel deze methoden waardevolle informatie hebben verstrekt, zijn de gebruikte technieken moeizaam en hebben ze een lage temporele resolutie5,6.

In het afgelopen decennium is de genetische manipulatie van Ctr gevorderd met de invoering van plasmidetransformatie en methoden voor mutagenesis7,8,9. Voor deze studie werd een plasmidengebaseerd systeem ontwikkeld om de chlamydial ontwikkeling in individuele insluitsels in real time in de loop van een infectie te monitoren. Er werd een chlamydial transformant gecreëerd die zowel een RB als een EB-celtype specifieke promotor-reporter uitdrukte. De RB specifieke verslaggever werd gebouwd door het fuseren van de promotor van de vroege RB gen euo stroomopwaarts van het fluorescerende eiwit Clover. EUO is een transcriptie regulator die onderdrukt een subset van late EB geassocieerde genen10. De promotor van hctB, die codeert een histone-achtige eiwit betrokken bij EB nucleoïde condensatie, werd gekloond direct stroomopwaarts van mKate2 (RFP) om de EB specifieke verslaggever11te creëren . De ruggengraat voor hctBprom-mKate2/euoprom-Clover was p2TK2SW27. De hctB en euo promotors werden versterkt uit Ctr-L2 genomic DNA. Elke promotor sequentie bestond uit ~ 100 basisparen stroomopwaarts van de voorspelde transcriptie startplaats voor het opgegeven chlamydial gen plus de eerste 30 nucleotide (10 aminozuren) van de respectieve ORF. De fluorescerende FP varianten werden commercieel verkregen als Ctr codon geoptimaliseerde genblokken en gekloond in frame met de eerste 30 nucleotide van elk chlamydial gen en promotor. De incD terminator werd gekloond direct stroomafwaarts van mKate2. De tweede promotor-verslaggever werd ingevoegd stroomafwaarts van de incD terminator. Het ampicilline resistentiegen(bla)in p2TK2SW2 werd vervangen door het aadA-gen (Spectinomycin resistance) van pBam4. Dit resulteerde in de uiteindelijke construct p2TK2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover (Figuur 1A) die werd omgezet in Ctr-L27. Deze RB/EB reporter stam zorgde voor de observatie van de ontwikkelingscyclus binnen enkele insluitsels met behulp van live-cel microscopie (figuur 1B,C).

Met behulp van onze promotor-reporter constructie in combinatie met chemische mutagenese, werd een protocol bedacht om individuele klonen te volgen en te isoleren die ontwikkelingsafwijkingen vertoonden van gemutagenized populaties van Ctr serovar L2. Dit protocol maakt het mogelijk voor de directe monitoring van individuele chlamydia-opnemingen, het bijhouden van de genexpressieprofielen in de tijd, het identificeren van chlamydia klonen die een veranderd ontwikkelingsgenexpressiepatroon uitdrukken, en kloonisolatie van Chlamydia van individuele insluitsels.

Hoewel dit protocol speciaal is gemaakt voor de identificatie van genen die betrokken zijn bij chlamydial ontwikkeling, kan het gemakkelijk worden aangepast om een willekeurig aantal chlamydial genetische trajecten te ondervragen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Python-scripts die in dit protocol worden gebruikt, zijn beschikbaar op Github https://github.com/SGrasshopper/Live-cell-data-processing

1. Mutagenize Reporter Chlamydia

OPMERKING: Ctr-L2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover EBs werden direct gemutageniseerd met behulp van ethylmethaansulfonaat (EMS) in de axenic media CIP-1 omdat deze media het EB-metabolisme en het onderhoud van EB-infectiviteit12ondersteunt.

  1. Ontdooi een chlamydial voorraad op ijs met ~3 x 107 EB's getransformeerd met de p2TK2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover reporter plasmid en pellet bij >14.000 x g voor 30 min bij 4 °C.
    OPMERKING: Chlamydia-organismen die voor deze experimenten werden gebruikt, waren 30% renografinedichtheid gezuiverd en bevroren bij -80 °C in 1x sacharose-fosfaat-glutamaat buffer (SPG).
  2. Gooi de supernatant weg en verleg de EB-pellet in 100 μL CIP-1-buffer met sonicatie op ijs op 10% vermogen voor 10 s. Verdeel de 100 μL EB-suspensie in twee 50 μL aliquots voor gedempte en bespotte monsters.
  3. Bereid 20 mg/mL EMS-CIP-1 oplossing voor in een aparte 1,5 mL microcentrifugebuis. Voeg hiervoor 6,8 μL EMS toe in een totaal volume van 375 μL.
  4. Voeg 50 μL van de EMS-CIP-1 oplossing toe aan een van de chlamydial aliquots voor mutagenesis en 50 μL CIP-1 alleen aan de andere chlamydial aliquot voor mock mutagenesis.
    LET OP: De uiteindelijke EMS-concentratie is 10 mg/mL. De chlamydial titer, EMS concentratie, en de tijd van blootstelling gebruikt in dit protocol leiden tot ongeveer een 60-80% vermindering van besmettelijke nakomelingen. Dit niveau van vermindering komt overeen met ~5-20 DNA-laesies per chlamydial genoom8.
  5. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. De gemutageniseerde EB's worden rechtstreeks gebruikt om monolagen in punt 2 te infecteren.
    LET OP: EMS is een bekende kankerverwekkende stof. Alle apparatuur en materialen die in contact komen met EMS moeten 24 uur voor verwijdering in 1 M NaOH worden geweekt, handschoenen moeten te allen tijde worden gebruikt tijdens het protocol en het opruimen van EMS-materialen.

2. Beeldvorming van mutant Ctr

  1. Host cel cultuur voor beeldvorming en isolatie van mutagenized Ctr
    1. Zaad een 6 goed glazen bodemplaat met 6 x 105 Cos-7 cellen (ATCC) per put in 2 mL van complete media (RPMI-1640 aangevuld met 10% foetale runderserum en 10 mg/mL gentamicine). Gebruik deze glazen bodemplaat voor beeldvorming van verminkte Ctr.
    2. Zaad een 24 put polystyreen plaat met 1 x 105 Cos-7 cellen (ATCC) per put in 1 mL complete media. Gebruik deze polystyreen plaat voor herinfectie van geïsoleerde Chlamydia van belang.
    3. Broed beide platen uit op 5% CO2, 37 °C voor ongeveer 18 uur. Zodra cellen samenvloeiing bereiken, vervang media door volledige media aangevuld met 1 μg/mL cycloheximide en incubaat 's nachts.
  2. Het infecteren van de gastheercelcultuur met verminkte Ctr
    1. Infecteer 5 putten van de glazen bodemplaat met ~6 x 105 van gemuteerde EB's in 1,5 mL/goed ijskoud HBSS. Dit zal resulteren in de MOI van ~ 0,3 als ~ 70% sterftecijfer wordt verwacht als gevolg van mutagenese.
    2. Infecteer de resterende goed met ~ 2 x 105 mock mutagenized EBs in 1,5 mL / goed ijskoud HBSS. Zonder mutagenesis, verwachten minder sterfte, dus een derde van het entmateriaal wordt gebruikt om de MOI van ~ 0,3 te bereiken.
      OPMERKING: MOI van ~0.3 zorgt ervoor dat hostcellen worden geïnfecteerd door een enkele EB en zorgt voor voldoende scheiding tussen geïnfecteerde cellen voor kloonisolatie.
    3. Broed de plaat 15 min, met schommelen, bij 37 °C.
    4. Was de geïnfecteerde gastheercellen met voorverwarmde (37 °C) HBSS met 1 mg/mL heparine, onmiddellijk gevolgd door een HBSS-spoeling. Herhaal heparine wassen, onmiddellijk spoelen 2x met HBSS om ervoor te zorgen dat de heparine wordt verwijderd.
      OPMERKING: Heparine remt en kan de vroege elektrostatische interacties tussen de hostcel en EBs13omkeren. De heparine wast verwijderen EBs die nog niet in de gastheercellen, het synchroniseren van de infectie. Bij het wassen cellen doen voorzichtig om te voorkomen dat losmaken van de cellen van het oppervlak van de putten. HBSS- en heparineoplossingen bevatten rest-EMS en moeten vóór verwijdering in een beker met 1 M NaOH worden geplaatst.
    5. Vervang HBSS door 4 mL/put van voorverwarmde (37 °C) beeldvormingsmedia (complete media, 1 μg/mL cycloheximide, 20 mM HEPES en geen fenolrood).
    6. Vul de interwell ruimtes met voorverwarmde (37 °C) gedeïioniseerde H2O om de temperatuurregeling te helpen en verdamping te verminderen. Incubeer de plaat bij 37 °C incubator met 5% CO2 gedurende 10 uur.
  3. Microscoop opgezet en beeldvorming
    OPMERKING: Multicolor multiposition automated live-cell fluorescent imaging is used to collect time-lapse images to identify chlamydial mutants that differ in the developmental gene expression dynamics. Dit protocol maakt gebruik van het open source μManager softwarepakket voor geautomatiseerde microscoopcontrole14.
    1. Begin de microscoop setup 10 uur na infectie. Stel de microscoopfase incubator in op 5% CO2, 37 °C. Plaats de geïnfecteerde 6 goed glazen bodemplaat in de fase incubator en steek het monster thermistor in de interwell H2O.
    2. Kalibreer de XY-fase met behulp van de Plug-in High Content Screening(HCS). Klik op Plug-ins | Aankoopinstrumenten | HCS Site Generator in de μManager microscoop besturingssoftware(JoVE61365_screenfile1, JoVE61365_screenfile2).
    3. Selecteer de 6-well plaatsjabloon en genereer een beeldpositielijst bestaande uit 12 HCS viewgebieden (FOV) per ruim binnen de HCS-plug-in(JoVE61365_screenfile3, JoVE61365_screenfile4). Open de lijst met stageposities en focus handmatig en stel de initiële Z-positie voor elke FOV in met de plug-in Stage Control(JoVE61365_screenfile5, JoVE61365_screenfile6). Pas de XY-coördinaten aan van een FOV die ontbrekende cellen heeft of geen uniforme monolaag bevat.
      OPMERKING: Vanwege de tijd die nodig is om elke afbeelding te laten vastleggen, kan een maximum aantal van 72 FOV per interval van 30 minuten worden genomen.
    4. Gebruik een 20x objectieve lens voor beeldvorming. Deze vergroting maakt het mogelijk ~ 8 insluitsels worden afgebeeld per FOV, terwijl nog steeds het verstrekken van de gewenste resolutie.
    5. Sla de positieslijst op, want deze wordt gebruikt om de insluitsels van belang te lokaliseren na gegevensanalyse(JoVE61365_screenfile7).
    6. Gebruik de optie Autofocus in de beeldsoftware om de focus te leggen op geautomatiseerde beeldvorming(JoVE61365_screenfile8).
    7. Gebruik de volgende selecties en waarden om de meest consistente focusresultaten te produceren met behulp van op afbeeldingen gebaseerde autofocus in μManager. Selecteer in het venster Autofocus-eigenschappen OughtaFocus in het vervolgkeuzemenu en gebruik de volgende instellingen. OughtaFocus-SearchRange_μm: 350, OughtaFocus-Tolerance_μm: 0,5, OughtaFocusCropFactor: 0,3, OughtaFocus-Exposure: 20, OughtaFocus-FFTLowerCutoff(%): 2,5, OughtaFocus-FFTUpperCutoff(%): 14, OughtaFocus-ShowImages: Ja, OughtaFocus-Maximize: SharpEdges, OughtaFocus-Channel: DIC.
      OPMERKING: Het verminderen van de autofocus imaging venster door het verminderen van de crop factor zorgt voor meer consistente auto scherpstellen. Als u Ja voor OughtaFocus-ShowImages selecteert, kan de gebruiker de autofocusafbeelding bekijken.
    8. Leg de kinetiek van de ontwikkelingscyclus vast door 24 uur met tijdsintervallen(JoVE61365_screenfile9)de kinetiek van de ontwikkelingscyclus vast te leggen. Imaging tussen 12-36 HPI zorgt ervoor dat Chlamydia de ontwikkelingscyclus voltooit, maar de hostcel niet lyse.
    9. Beeld de celmonolagen met een blootstelling van 250 ms met een intensiteit van 4% en 18% in respectievelijk de GFP- en RFP-kanalen (JoVE61365_screenfile10). Detecteer het Clover -signaal (GFP) door excitatie op 470 nm met een 514/30 nm bandpass-emissiefilter. Detecteer het mKate2 (RFP) signaal door excitatie op 595 nm en met een 641/75 nm bandpass emissiefilter.
      OPMERKING: Het minimaliseren van de excitatieintensiteit is van cruciaal belang voor het minimaliseren van fluorofofolaat en fototoxiciteit voor Chlamydia. De minimale excitatieintensiteit om een opgelost beeld te genereren met een blootstelling van 200-300 ms moet empirisch worden bepaald in pilotstudies.
    10. Leg meerdere Z-segmenten vast met een reeks focuspunten die aan weerszijden van het in-focussegment eindigen. In dit experiment, bij 20x vergroting, werd dit bereikt met 4 segmenten op 10 μm stappen (JoVE61365_screenfile11).
    11. Selecteer Relatieve Z voor het beeldvorming van meerdere segmenten in het acquisitievenster. De optie relatieve Z gebruikt de locatie van het Z-vlak die is opgeslagen in de lijst met beeldvormingsposities als uitgangspunt voor het volgende tijdsinterval. Voer de juiste Z-offsetwaarden in voor fluorescentiebeeldvormingskanalen (JoVE61365_screenfile12).
      OPMERKING: Het beeld gebaseerde scherpstelsysteem is onvolmaakt en over een 24 uur beeldvorming periode leidt dit tot focus drift. Men vond dat door 3-4 Z brandpuntsvlakken voor elk keer punt een in-nadrukbeeld werd gehandhaafd. Z-offset is nodig om de verschillen in brandpuntsvlakken tussen de fluorescerende beeldkanalen en het DIC-kanaal te corrigeren. Empirische bepaling van deze Z-offset zal nodig zijn.
    12. Sla afbeeldingen op door de hoofdmap te selecteren en het experiment een naam te geven. Gebruik de optie μManager-afbeeldingsstapelbestand om afbeeldingen op te slaan als tiff-stackbestanden (JoVE61365_screenfile13). image stack file
    13. Neem de experimentele details op in het vak Opmerkingen over acquisities in het venster MultiD-acquisitie(JoVE61365_screenfile13). dat wil zeggen, Goed A1: Onbehandelde controle. Nou A2-3 en B1-3: EMS Mutants. Beeldvorming: 12-36HPI. Start de beeldacquisitie bij 12 HPI.
      OPMERKING: Als u μManager gebruikt, laat u het programma, de experimentele installatie en de microscoophardware draaien nadat het experiment is voltooid. De beeldvorming sites zullen worden herzien voor inclusie isolatie zodra de analyse van de gemutagenized bevolking is voltooid.

3. Identificeren en isoleren van mutagenized Chlamydia met gewijzigde ontwikkelingsfenotypen

  1. Een focus-afbeeldingsstack maken
    1. Haal de meest scherpzinnige afbeelding uit de Z-stacks met de opgeslagen afbeeldingsgegevens die 4 Z-segmenten per tijdspunt bevatten. Gebruik de optie kurtosismeting (Analyseren | Meet)in ImageJ/FIJI om automatisch het meest in focus Z-segment te identificeren (hoogste kurtosisscore) en een nieuwe beeldstack te maken met alleen deze in-focus beelden. Een Python-script is opgenomen als een aanvullend bestand(Reduce_Z_kertosis_2ch_JOVE.py)om dit proces te automatiseren.
  2. Kwantificeren van fluorescentieuitdrukking bij individuele insluitsels
    OPMERKING: Om de expressiekinetiek van de twee verslaggevers te kwantificeren, gebruiken we de open source image analysis applicatie ImageJ/FIJI en de plugin Trackmate15. Trackmate identificeert 'spots' (die in dit geval overeenkomen met insluitsels) en volgt ze door middel van een time-lapse beeldstack die de X,Y-locatie en signaalintensiteit registreert voor elke opname in de tijd(JoVE61365_screenfile14). Deze informatie wordt opgeslagen als een CSV-bestand en wordt geïmporteerd in een aangepast Python-notitieblok voor analyse.
    1. Open de in-focus Z-gereduceerde afbeeldingsstack in ImageJ/FIJI met behulp van Bio-formaten Importer door op Plug-ins te klikken | Bio-formaten | Importeur van bioformaten. Selecteer Hyperstack en Composiet (JoVE61365_screenfile15, JoVE61365_screenfile16).
    2. Trek de achtergrond van de afbeelding af door op Proces te klikken | Trek Achtergrond af met een straal van 50,0 pixels en verbeter het afbeeldingscontrast tot 0,3% voor verzadigde pixels (Proces | Contrast verbeteren). Vermenigvuldig de afbeeldingswaarden met 10,0 (Proces | Wiskunde | Vermenigvuldigen) (JoVE61365_screenfile17 - JoVE61365_screenfile22).
    3. In Trackmate (Plug-ins | Volgen | Trackmate), selecteer een geschatte blobdiameter van 48 pixels (empirisch bepaald op basis van de grootte van de opname aan het einde van de beeldvorming). Produceer niet-gefragmenteerde inclusietracks door een koppelingsafstand en gap-sluitende max-afstand van 8,0 pixels en Gap-closing max frame gap van 1 (JoVE61365_screenfile23 - JoVE61365_screenfile25)te selecteren.
      OPMERKING: Om trackmate's vermogen om insluitsels over de hele cyclus te euoidentificeren en bij te houden, wordt een apart afbeeldingskanaal gemaakt door de euo-prom- en hctB-prom-kanalensamen toe te voegen met behulp van de beeldwiskundefunctie in ImageJ/FIJI. Dit kanaal wordt vervolgens gebruikt door Trackmate om insluitsels in de loop van de tijd te identificeren en te volgen. De fluorescerende waarden van de euoprom en hctBprom kanalen worden vervolgens opgenomen in kanalen 2 en 3.
    4. Neem tracks op die voldoen aan een minimale continue duur: Duur van het spoor: 20 (JoVE61365_screenfile26). Analyseer de tracks en sla de spots op in trackstatistieken als een CSV-bestand(JoVE61365_screenfile27).
      OPMERKING: Dit proces is geautomatiseerd met behulp van een aangepast Python-script dat wordt geleverd in de aanvullende gegevens(TrackMate_Zreduced_JOVE.py).
  3. Inclusietracks identificeren met gewijzigde ontwikkelingsprofielen
    OPMERKING: Om insluitsels te identificeren die Chlamydia met gewijzigde ontwikkelingsprofielen werd elke inclusietrack gevisualiseerd met behulp van Python-notebook. Deze visualisaties maken het mogelijk om opnemingen te identificeren met kinetische genexpressieprofielen die verschilden van de bespottelijke populatie. De Python notebook die wordt gebruikt voor de identificatie van insluitsels met gewijzigde ontwikkelingsprogrammering wordt geleverd in de aanvullende gegevens (EMS_Screen-markdown).
    1. Importeer de gegevens van het inclusiespoor uit de spots in het CSV-bestand bijhouden in CSV-bestanden in het gegevensframe van Pandas met behulp van de cel Importeren in het EMS_Screen-Markdown Python-notitieblok.
    2. Basislijn corrigeert elk spoor door de minimumwaarde van elk spoor af te trekken van de rest van de spoorwaarden met behulp van de cellen voor aftrekken van basislijn. Sla de resulterende waarden op als een augurkenbestand met de cel Opslaan als augurk. Hiermee worden de kanaalwaarden permanent opgeslagen na het aftrekken van de basislijn voor later ophalen.
      OPMERKING: Baseline aftrekken stelt de begintfluorescerende intensiteit van elke opname in op nul.
    3. Verwijder sporen van insluitsels in de buurt van de randen van de FOV met behulp van de cel Filterranden, omdat hun fluorescerende profielen mogelijk niet volledig worden vastgelegd; deze sporen kunnen vals-positieve ontwikkelingsprofielen opleveren.
    4. Kalibreer de waarden van het frame(totalFrames)van de afbeeldingssegmenten naar de tijd(startTime, interval)met de time-lapse kalibratiecel met behulp van het experimentele begintijd- en beeldtijdinterval. Deelopnamelees uitsluiten door sporen uit te filteren die zich niet uitstrekken gedurende de laatste 20 uur van het experiment (16-36 HPI) met behulp van de track duration filtercel.
    5. Afzonderlijke tracks in afzonderlijke gegevensframes door experimentele toestand met de cel Behandeling toewijzen. Filter voor insluitsels die voldoende groei vertonen met behulp van de cel Filter for Growth. Stel in de cel Filter for Growth empirisch de fluorescentieintensiteitsdrempel voor het euo-prom-kanaal in door de waarden binnen de laatste twee regels code te wijzigen. euo Dit zal filteren Chlamydia die niet groeide.
      OPMERKING: Wees voorzichtig bij het instellen van drempelfilters, als het filter te laag is, zullen de resulterende spreidingsplots luidruchtig zijn, maar als filtering te hoog is ingesteld, kunnen belangrijke mutanten worden geëlimineerd.
    6. Bereken de procentsterfte veroorzaakt door EMS door het aantal gemutagenized tracks /well te delen door het aantal nepbehandelde tracks/goed. Vermenigvuldig het aantal met de nep behandelde tracks met de initiële verdunningsfactor van 3 om het aantal bespottelijke tracks/goed te berekenen. Gebruik de gegevens met opname van tellingen en percentagesterftecellen berekenen om deze taak uit te voeren.
    7. Bereken de tijd tot half-maximale expressie voor zowel vroege als late verslaggevers voor elk nummer met behulp van de cel Berekenen. Deze waarden zullen worden gebruikt om mutagenized en mock populaties te vergelijken om ontwikkelingsmutanten te identificeren.
    8. Binnen de Half-Max Plot cel gebruik maken van de bokeh plotten pakket om de tijd te visualiseren om half-max expressie van elke promotor, grafiek van de euoprom tijd om half-maximale expressie tegen die van hctBprom. Identificeer insluitsels van de mutantpopulatie die buiten de bespotte scattercloud vallen met behulp van de bokeh interactieve track ID explorer. Noteer de FOV- en XY-coördinaten van de insluitsels van belang (figuur 2).
      OPMERKING: Kies kandidaat-insluitsels die visueel buiten de controlecloud vallen, omdat verificatie en statistische evaluatie van elke kloon later worden uitgevoerd.
    9. Binnen de Animated Plot cel visualiseren veranderingen in promotor expressie kinetiek dynamisch door de tijd door grafieken van de expressie intensiteit van euoprom tegen hctBprom met behulp van de plotting tool Plotly16. De scatterfunctie van Plotly wordt gebruikt om de genexpressie na verloop van tijd te animeren(Video 1).
    10. Visualiseer een momentopname van de plotten geanimeerde grafiek in de Inclusion Locator-cel, waarbij euoprom- en hctB-prom-expressieop een specifiek tijdstip (d.w.z. 28 HPI) worden uitgezet met behulp van het bokeh-pakket(figuur 3). Identificeer insluitsels van de mutantenpopulatie zoals beschreven in stap 3.3.8.
      OPMERKING: Deze analyse moet snel worden uitgevoerd (<4 h) omdat de insluitsels nog steeds uitbreiden en gastheercellen ~ 48 uur na infectie beginnen te lyse.
  4. Ontwikkelingsmutanten isoleren van insluitsels van belang
    OPMERKING: Om Chlamydia te isoleren van de insluitsels die vastbesloten waren om veranderde genregulatie weer te geven, werd een micromanipulator met capillaire naalden gebruikt. De Coördinaten Well ID, FOV en X,Y van insluitsels van belang werden bepaald aan de hand van de gegevensvisualisatie in punt 3.3.
    1. Bereid capillaire naalden door het midden van de capillaire buis in een vlam te houden en beide uiteinden van de capillaire buis te trekken totdat deze is gescheiden. Maak een opening in de getrokken capillaire naald door het breken van de getrokken punt op een microscoop dia. Om de naald te breken, plaats de gesloten punt op het matte gedeelte van de microscoop dia onder een hoek en druk uit te oefenen.
      OPMERKING: Capillaire buisspecificaties waren 1,0 mm O.D., 0,5 mm I.D.
    2. Controleer of de naald opening is ongeveer de grootte van een opname onder een microscoop, 20x doelstelling.
    3. Prepull ~ 25-30 capillaire naalden voor isolatie van kandidaat-insluitsels (een naald per opname).
    4. Vul de microinjector met minerale olie zodat er geen luchtbellen aanwezig zijn.
    5. Bevestig een glazen capillaire naald aan de microinjector en verdrijft olie naar het puntje van de naald, waardoor eventuele luchtbellen worden gewist. Plaats de capillaire naald in de volledige media en maak de media halverwege. Het vullen van de capillaire naald met media voorkomt olieverontreiniging in de put.
    6. Met behulp van de lijst met opgeslagen posities in μManager vanaf stap 2.3.5, migreer naar de put en FOV van een opname van belang geïdentificeerd in de Python visualisatie notebook.
    7. Gebruik de joystick van de micromanipulator om de capillaire naald te lokaliseren naar de XY-coördinaten van de opname van belang.
    8. Gebruik het 595 nm excitatiekanaal om EB's te visualiseren voor extractie en het fase/DIC wit lichtkanaal voor naaldvisualisatie. Manoeuvreer de capillaire naald naar de opname, scheur de opname en trek de EB's in de capillaire naald met behulp van de microinjector.
    9. Verdrijf de EBs van de capillaire naald in een enkele put van de voorbereide 24 put polystyreen plaat bereid in stap 2.1.2. Verwijder de capillaire naald en vervang met een verse capillaire naald voor de volgende opname extractie. Herhaal punt 3.4 voor alle kandidaat-insluitsels.
      OPMERKING: Voor expansie en om een hoog genoeg titer voor re-imaging te garanderen, isoleert mutanten in een CO2van 5% , 37 °C-incubator totdat de meerderheid van de gastheercellen geïnfecteerd is (~1 week). Putten moet nauwlettend worden gecontroleerd als verschillende isolaten kunnen vertonen verschillende groeicijfers.
  5. Oogst mutant isolaten
    1. Op ijs, verstoren de geïnfecteerde monolaag door schrapen met een 1 mL micropipet tip. Breng de media, celpuin, en vrijgegeven Chlamydia in een 1,5 mL microcentrifuge buis.
    2. Pelletchlamydia door centrifugatie gedurende 30 min bij 4 °C, >14.000 x g. Verwijder de supernatant en resuspend pellet in 75 μL van ijskoud 1x SPG. Aliquot in drie 1,5 mL schroef-cap microcentrifuge buizen. Bewaar bij -80 °C.

4. Verificatie van gemuteerde isotypen

  1. Host celcultuur voor beeldvorming gemutagenized isolaten
    1. Zaad een 96 goed glazen bodemplaat met 1,6 x 104 Cos-7 cellen (ATCC) per put in 100 μL van complete media. Incubeer bij 5% CO2, 37 °C. Cellen moeten samenvloeiing bereiken in ongeveer 24 uur. Nadat cellen samenvloeien, vervang media door complete media aangevuld met 1 μg/mL cycloheximide, incubeer 's nachts.
  2. Infecteert cellen met kandidaat-isolaten voor fenotypische verificatie
    1. Dooi mutant klonen en wildtype Chlamydia op ijs.
    2. Voer in de geprepareerde 96 putplaat een tweevoudige seriële verdunning van gemuteerde isolaten uit, met behulp van één kolom per isolaat (11 kolommen). Begin met een eerste verdunning van 1:20 in 100 μl HBSS.
      OPMERKING: Seriële verdunning van Chlamydia wordt uitgevoerd om ervoor te zorgen dat mutantmonsters worden afgebeeld op een MOI < 1.
    3. Infecteer de resterende (12e) kolom met wildtype Chlamydia bij MOI ~0.5.
      OPMERKING: Wildtype Chlamydia worden gebruikt als een controle voor vergelijking tegen gemutagenized isolaten.
    4. Incubeer gedurende 15 minuten schommelen bij 37 °C.
    5. Was geïnfecteerde gastheercellen met voorverwarmde (37 °C) HBSS met 1 mg/mL heparine en HBSS als omschreven in punt 2.2.
    6. Vervang door 200 μL per put van voorverwarmde (37 °C) beeldvormende media.
    7. Vul de interwell ruimtes met voorverwarmde (37 °C) gedeïionized H2O.
    8. Incubeer bij 5% CO2, 37 °C voor 10 uur.
  3. Microscoopopstelling
    OPMERKING: Raadpleeg punt 2.3 voor de opstelling van de microscoop, deze sectie bevat alleen de vereiste installatiewijzigingen.
    1. Selecteer de 96 putplaatsjabloon uit de HCS-plug-in.
    2. Empirisch bepalen putten die overeenkomen met een MOI < 1 voor elk mutant isolaat. Klaver expressie onder controle van de euo promotor is waarneembaar op ~ 10 HPI waardoor vroege visualisatie van insluitsels mogelijk is (Figuur 1B).
    3. Selecteer drie putten per mutantenolaat die overeenkomen met een MOI < 1 en genereer een beeldvormingspositielijst bestaande uit twee FOV per put.
      OPMERKING: Slechts 72 beelden kunnen worden genomen per tijdsinterval als gevolg van hardwarebeperkingen, dit komt overeen met drie verdunningen (putten) per stam met behulp van twee imaging sites per goed als 12 monsters worden afgebeeld.
    4. Nota van de ontwikkelingscyclus van elk mutantenolaat voor 36 uur op 30 min tijdsintervallen vanaf 12 HPI.
    5. Neem de experimentele details op in het vak Opmerkingen acquisities. dat wil zeggen, Nou ABC1: wildtype controle. Nou ABC2: Mutant stam 1, ABC3: Mutant stam 2, etc... Beeldvorming: 12-48 HPI.
    6. Start de beeldacquisitie bij 12 HPI.

5. Gegevensanalyse voor verificatie isolaat

  1. In-focus beeldstapels maken en fluorescentieexpressie kwantificeren in individuele insluitsels
    1. Genereer fluorescerende intensiteitssporen voor elke opname zoals gespecificeerd in punt 3.1 - 3.2.
  2. Ctr mutagenized isolaten verifiëren
    OPMERKING: Om de gewijzigde ontwikkelingsprofielen van mutantisolaten te verifiëren, worden hun expressieprofielen vergeleken met het wildtype-expressieprofiel met behulp van Python-notebook. De Python notebook die wordt gebruikt voor de verificatie van mutant klonen met gewijzigde ontwikkelingsprogrammering is voorzien in de aanvullende gegevens (clone_check-Markdown).
    1. De tracegegevens voor opneming importeren en filteren in het clone_check-Markdown Python-notitieblok zoals uitgevoerd in punt 3.3.
    2. Bereken de gemiddelde en standaarddeviatie (SOA) van de sporen van elk isolaat- en wildtypecontrolepopulatie met behulp van de gemiddelde en soa-cel berekenen.
    3. Met de Graph Iso vs WT-cel plott de gemiddelde en standaardfout van het gemiddelde (SEM) van elke gemuteerde kloon tegen de wildtypecontrole om te bepalen of de gemuteerde expressiekinetiek afwijkt van het wildtypemonster(figuur 4).
    4. Bepaal of de geïsoleerde mutantenpopulatie klonaal is door de mutantensporen in kaart te brengen en te vergelijken met wildtype-inclusiesporen met behulp van een strooiperceel zoals gedaan in punt 3.3.3.7-3.3.10 (figuur 2, figuur 3). Als het isolaat een gemengde populatie is, zal het perceel één populatie laten zien die overlaying met wildtype en een tweede verschillende populatie buiten de wildtype scatter wolk. Als de populatie er gemengd uitziet, kan de mutant opnieuw worden geïsoleerd met behulp van de oorspronkelijke procedure beschreven in punt 3.4.
      OPMERKING: Om te bepalen of het ontwikkelingsprofiel van een isolaat statistisch verschilt van wildtype, moeten de curven voor elk isolaat worden vergeleken met wildtype met ANOVA.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Directe EMS mutagenesis van onze promotor-reporter chlamydial stam resulteerde in een ~ 75% vermindering van de infectiviteit. Met behulp van de beschreven live-cell imaging protocol, ~ 600 insluitsels werden afgebeeld en bijgehouden over een periode van 24 uur. De fluorescerende expressie kinetiek van beide verslaggevers in elke opname werd gevisualiseerd met behulp van aangepaste Python notebook scripts. Twee visualisatiebenaderingen werden uitgevoerd om kandidaat mutagenized Chlamydia voor isolatie te identif...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het ontleden van de mechanismen die de chlamydial ontwikkelingscyclus controleren is belemmerd door de beperkingen van de momenteel beschikbare genetische hulpmiddelen. In dienst van onze promotor-reporter Chlamydia in combinatie met live-cel geautomatiseerde microscopie, werd een systeem gebouwd dat het mogelijk maakt monitoring van cel-type ontwikkeling in individuele insluitsels over een periode van 24 uur. Dit systeem, in combinatie met chemische mutagenese en directe inclusieisolatie, heeft een methode ontw...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken Dr. Anders Omsland van de Washington State University voor het leveren van de CIP-1 axenic media. Dit werk werd ondersteund door NIH grant R01AI130072, R21AI135691 en R21AI113617. Aanvullende ondersteuning werd geboden door startkapitaal van de Universiteit van Idaho en het Center for Modeling Complex Interactions via hun NIH-subsidie P20GM104420.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
24-wells polystyreen platenCorning3524Celcultuur groei voor herinfectie van isolaten
6-wells glazen bodemplatenCellvisP06-1.5H-NCelcultuur groei voor beeldvorming
96-wells glazen bodemplatenNunc165305Celcultuur groei voor beeldvorming
Bold line CO2 UnitOKO LabsCO2 UNIT BLStage incubator CO2 controle
Bold line T UnitOKO LabsH301-T-UNIT-BL-PLUSStage incubator temperatuur controle
Borosilicaat glazen capillaire buizenSutter InstrumentB1005010Capillaren
BrightLine bandpass emissiefilter (514/30nm)SemrockFF01-514/30-25Fluorescentie filter cube
BrightLine bandpass emissiefilter (641/75nm)SemrockFF02-641/75-25Fluorescentie filter cube
CellTram VarioEppendorf5196000030Microinjector
Chlamydia trachmatis serovar L2ATCCVR-577Chlamydia trachomatis
CIP-1 mediaIn houseNAAxeen media. IPB aangevuld met 1% FBS, 25 μM aminozuren, 0.5
mM G6P, 1.0 mM ATP, 0.5 mM DTT en 50 μM GTP, UTP en
CTP. (Omsland, A. 2012) zelf gemaakt.
Cos-7 cellen (ATCC)ATCCCRL-1651Afrikaanse groene aapniercel (gastheercellen)
CycloheximideMP Biomedicals194527Gastheercel groei remmer
Ethyl methanesulfonaat, 99%Acros OrganicsAC205260100Mutagen
Fetal PlexGemini Bio-Products100-602Aanvulling op basisgroeimedia
Fiji/ImageJhttps://imagej.net/FijiNAOpen source beeldanalysesoftware. https://imagej.net/Fiji
Galaxy 170 S CO2 incubatorEppendorfCO1700100XCelcultuur incubatie
gblocks (Fluorescente FP varianten: Clover en mKate2)Integrated DNA TechnologiesNAgblock ORF's van Ctr geoptimaliseerde FP varianten voor klonen in p2TK2SW2
Gentamycine 10mg/mlGibco15710-064Antibioticum voor groeimedia
HBSS (Hank's Balanced Salt Solution)Corning21-020-CMGastheercellen spoelen
Heparine-natriumAmersham Life Science16920Inhibeert en keert de vroege elektrostatische interacties tussen de gastheercel en EB's om
HEPES 1MGE Life SciencesSH30237.01pH buffer voor groeimedia
InjectManEppendorf5179 000.018Micromanipulator
Jupyter Notebookhttps://jupyter.org/NAVisualisatie van inclusiesporingen. https://jupyter.org/
Lambda 10-3Sutter InstrumentLB10-3Filterwiel controller
Oko TouchOKO LabsOko TouchInterface om de Bold line T en CO2 Unit te bedienen
Prior XY stagePriorH107Gemotoriseerde XY microscooptafel
PrismR CentrifugeLabnetC2500-RTemperatuur gecontroleerde microcentrifuge
Problot Hybridisatie ovenLabnetH1200ARotsachtige incubator voor infectie met Chlamydia
Proscan IIPriorH30V4XYZ microscooptafel controller
Purifier Class 2 Biosafety CabinetLabconco362804Celcultuurwerk
RPMI-1640 (geen fenolrood)Gibco11835-030Basisgroeimedia voor beeldvorming
RPMI-1640 (fenolrood)GE Life SciencesSH30027.01Basisgroeimedia
scopeLED excitatie LEDs (470nm,595nm)scopeLEDF140Excitatielucht
Sonic Dismembrator Model 500Fisher Scientific15-338-550Sonicator, hersuspensie van chlamydiale pellet
Stage incubatorOKO LabsH301-K-FRAMECluster welplaat incubatiekamer
sucrose-fosfaat-glutamaat buffer 1X (SPG)In houseNAChlamydia opslagbuffer. (10 mM natriumfosfaat [8 mM K 2HPO 4, 2 mM KH 2PO 4], 220 mM sucrose, 0.50 mM L-glutaminezuur; pH 7.4)
T-75 FlaconsThermo Scientific156499Celcultuur groei
TE 300 omgekeerde microscoopNikon16724microscoop
THOR LEDThor LabsLEDD1BWitte licht
TrypsineCorning25-052-CIVerstoort gastheercellen uit fles voor zaaien in platen
Zyla sCMOSAndorZYLA-5.5-USB3beeldvormingscamera
µManager 2.0gammahttps://github.com/micro-manager/micro-managerNAOpen source geautomatiseerde microscoopbesturingssoftwarepakket

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. AbdelRahman, Y., Belland, R. The chlamydial developmental cycle. FEMS Microbiology Reviews. 29 (5), 949-959 (2005).
  2. Clifton, D., et al. A chlamydial type III translocated protein is tyrosine-phosphorylated at the site of entry and associated with recruitment of actin. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 101 (27), 10166-10171 (2004).
  3. Yu, H. H. Y., Tan, M. σ28 RNA polymerase regulates hctB, a late developmental gene in Chlamydia. Molecular Microbiology. 50 (2), 577-584 (2003).
  4. Koo, I., Stephens, R. A Developmentally Regulated Two-component Signal Transduction System in Chlamydia. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 17314-17319 (2003).
  5. Grieshaber, S., et al. Impact of Active Metabolism on Elementary Body Transcript Profile and Infectivity. Journal of Bacteriology. 200 (14), 00065(2018).
  6. Belland, R., et al. Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 100 (14), 8478-8483 (2003).
  7. Wang, Y., et al. Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis: restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258(2011).
  8. Nguyen, B., Valdivia, R. Virulence determinants in the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis revealed by forward genetic approaches. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 109 (4), 1263-1268 (2012).
  9. Mueller, K., Wolf, K., Fields, K., Maurelli, A. Gene Deletion by Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis. MBio. 7 (1), 01817(2016).
  10. Rosario, C. J., Tan, M. The early gene product EUO is a transcriptional repressor that selectively regulates promoters of Chlamydia late genes. Mol Microbiol. 84 (6), 1097-1107 (2012).
  11. Brickman, T., Barry, C., Hackstadt, T. Molecular cloning and expression of hctB encoding a strain-variant chlamydial histone-like protein with DNA-binding activity. Journal of Bacteriology. 175 (14), 4274-4281 (1993).
  12. Omsland, A., Sager, J., Nair, V., Sturdevant, D., Hackstadt, T. Developmental stage-specific metabolic and transcriptional activity of Chlamydia trachomatis in an axenic medium. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 109 (48), 19781-19785 (2012).
  13. Su, H., et al. A recombinant Chlamydia trachomatis major outer membrane protein binds to heparan sulfate receptors on epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 93 (20), 11143-11148 (1996).
  14. Edelstein, A., et al. Computer control of microscopes using µManager. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 14-20 (2010).
  15. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  16. Plotly Technologies Inc. Collaborative data science. , Montréal, QC. https://plot.ly (2015).
  17. Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
  18. Shcherbo, D., et al. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochemical Journal. 418 (3), 567-574 (2009).
  19. Sega, G. A review of the genetic effects of ethyl methanesulfonate. Mutation Research. 134 (2-3), 113-142 (1984).
  20. Ferguson, L., Denny, W. Frameshift mutagenesis by acridines and other reversibly binding DNA ligands. Mutagenesis. 5 (6), 529-540 (1990).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Live cell microscopieduaal promoter reportersysteemchemische mutageneseceltype switchingontwikkelingscycluselementaire lichamenreticulaire lichamenclonale isolatie

Gerelateerde artikelen