Method Article

Embryo micro-injection technieken voor efficiënte site-specifieke mutagenese in Culex quinquefasciatus

DOI:

10.3791/61375

⸱

May 24th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Section of Cell and Developmental Biology, University of California, San Diego, 2Department of Entomology and Plant Patholog, Auburn University, 3Tata Institute for Genetics and Society, University of California, San Diego

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft micro-injectieprocedures voor Culex quinquefasciatus embryo's die zijn geoptimaliseerd om te werken met CRISPR/Cas9 genbewerkingstools. Deze techniek kan efficiënt site-specifieke, erfelijke, kiembaanmutaties genereren die kunnen worden gebruikt voor het bouwen van genetische technologieën in deze onderbelichte ziektevector.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Culex quinquefasciatus is een vector van een breed scala aan vector-overgedragen ziekten zoals aviaire malaria, West Nile virus (WNV), Japanse encefalitis, Oostelijke paardenencefalitis, lymfatische filariasis en Saint Louis encefalitis. Met name aviaire malaria heeft een belangrijke rol gespeeld bij het uitsterven van talrijke endemische eilandvogelsoorten, terwijl WNV een belangrijke vectorziekte is geworden in de Verenigde Staten. Om meer inzicht te krijgen in de biologie van C. quinquefasciatus en hun genetische controletoolbox uit te breiden, moeten we efficiëntere en betaalbare methoden ontwikkelen voor genoomtechniek bij deze soort. Sommige biologische eigenschappen die uniek zijn voor Culex-muggen, met name hun eiervlotten, hebben het echter moeilijk gemaakt om micro-injectionprocedures uit te voeren die nodig zijn voor genoomtechniek. Om deze uitdagingen aan te pakken, hebben we een geoptimaliseerd embryomicro-injectieprotocol ontwikkeld dat zich richt op het verminderen van de technische obstakels die verband houden met de unieke kenmerken van Culex-muggen. Deze procedures tonen geoptimaliseerde methoden voor het verzamelen van eieren, het scheiden van eiervlotten en andere behandelingsprocedures die essentieel zijn voor een succesvolle micro-injection bij C. quinquefasciatus. In combinatie met de CRISPR/Cas9 genoombewerkingstechnologie stellen deze procedures ons in staat om sitespecifieke, efficiënte en erfelijke kiembaanmutaties te bereiken, die nodig zijn om geavanceerde genoomengineering uit te voeren en genetische controletechnologieën te ontwikkelen in deze belangrijke, maar momenteel onderbelichte ziektevector.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. quinquefasciatus, algemeen bekend als de zuidelijke huismug, is een competente vector van talrijke pathogenen, waaronder het West Nile-virus (WNV), Japanse encefalitis, Saint Louis-encefalitis en oostelijke paardenencefalitis. In het bijzonder, sinds het voor het eerst werd ontdekt in New York in 1999, is WNV een belangrijke door vectoren overgedragen ziekte geworden in de continentale Verenigde Staten (VS) met meer dan 50.000 gemelde menselijke gevallen die resulteerden in ongeveer 2.300 sterfgevallen tussen 1999 en 20181 en meer dan 4.500 gemelde paardengevallen tussen 2008-20192. Bovendien zijn ten minste 23 vogelsoorten die in Noord-Amerika zijn aangetroffen, getroffen door WNV-infecties met ten minste 12 soorten die als onherstelbaar zijn geclassificeerd als gevolg van WNV3. De impact van WNV op menselijke, paarden- en vogelpopulaties is te wijten aan het opportunistische voedingsgedrag van de vectoren. Meestal zijn vogels de primaire gastheren voor WNV en zijn mensen en paarden incidentele of doodlopende gastheren. Sommige pathogenen gevectoreerd door C. quinquefasciatus infecteren alleen vogels zoals de aviaire malariaparasiet, Plasmodium relictum. In Hawaï is C. quinquefasciatus een belangrijke vector van aviaire malaria en heeft het uitsterven van veel inheemse vogelsoorten veroorzaakt4,5.

Om ziekten te bestrijden die worden overgedragen door C. quinquefasciatus, hebben onderzoekers en vectorcontrolebureaus veelgebruikte instrumenten voor muggenpopulatiecontrole gebruikt, zoals het aanbrengen van insecticiden6, deze methoden zijn echter duur, niet specifiek voor soorten en hebben een beperkte effectiviteit omdat de resistentie tegen insecticiden hoog is in veel C. quinquefasciatuspopulaties 6,7,8,9. Andere controletechnieken, zoals op Wolbachiagebaseerde populatiecontrolestrategieën , zijn de afgelopen jaren ontwikkeld10,11, maar de fitnesskosten in verband met Wolbachia-infectie beperken de haalbaarheid van deze benadering voor deze vector12. Er zijn ook genetische bestrijdingsmethoden ontwikkeld bij andere muggensoorten zoals Aedes aegypti13 , 14, Anopheles gambiae15 en Anopheles stephensi16, inclusief de ontwikkeling van pathogene resistente muggen 17,18,19, die ook kunnen worden ontwikkeld voor C. quinquefasciatus als de vereiste genoomtechniektools zijn ontwikkeld voor deze soort. De biologie van C. quinquefasciatus verschilt echter sterk van andere Aedes- en Anopheles-muggenvectoren, wat de ontwikkeling van vergelijkbare genetische technologieën in deze vector moeilijk heeft gemaakt. Met de komst van crispr-gebaseerde genoom engineering technologieën, precieze genoom engineering is steeds trivialer, betaalbaarder en aanpasbaar geworden en heeft bijgevolg geleid tot de ontwikkeling van nieuwe genetische hulpmiddelen in een breed scala van soorten.

Om mutaties te genereren met CRISPR-gebaseerde technologieën, wordt een mengsel van Cas9-eiwit en synthetische guide RNA (sgRNA), complementair aan de gewenste loci, micro-geïnjecteerd in embryo's in het pre-blastoderm stadium. Aangezien C. quinquefasciatus vrouwtjes hun eieren leggen in groepen die zijn bevestigd in een drijvende vlotstructuur (Figuur 1), in tegenstelling tot het legen van individuele eieren, een eigenschap van Aedes en Anopheles muggen, worden embryomicro-injections steeds ingewikkelder bij deze soort. Culexlarven komen ook uit de voorste kant van elk ei, dat in contact staat met het wateroppervlak(figuur 1),dus eioriëntatie na manipulatie is belangrijk bij deze soort. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol ontworpen voor de micro-invoeging van Cas9-eiwit en sgRNA in C. quinquefasciatus embryo's. Dit protocol is ontworpen om eigenschappen te huisvesten die uniek zijn voor de Culex-biologie om de embryooverleving en genoommutatiesnelheden te verbeteren door middel van bepaalde stappen die essentieel zijn voor tijdige eicelverzameling en ei-overleving.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. C. quinquefasciatus kolonie opfok

  1. Zet meerdere kolonies C. quinquefasciatus volwassenen op in insectenslaapzalen.
    OPMERKING: De kolonies werden geleverd door Dr. Laura Harrington aan cornell university20. Gedetailleerde protocollen voor het fokken van Culex-muggen zijn te vinden in andere literatuur21.
    1. Houd de muggen op 25 ± 1 °C bij 30% vochtigheid met een dag-nachtcyclus van 12:12 uur.
    2. Geef 20% suikeroplossing ad libitum door een suikeroplossingscontainer met een lont in de kooi te introduceren of door wattenballen te verzadigen met de suikeroplossing en deze in de kooi te plaatsen.
  2. Laat muggen ten minste 3 dagen paren voordat ze bloed geven (figuur 2A).

2. Verzameling van C. quinquefasciatus pre-blastoderm stadium embryo's

  1. Geef vrouwtjes na 3-6 dagen na eclosie 1-2 ml geciteerd runderbloedmeel via een synthetisch membraan en verwarmd tot ongeveer 40 °C in een bloedtoevoersysteem (figuur 2B). Er zijn ook alternatieve bloedtoevoerprotocollen die kunnen worden gebruikt voor Culex-muggen (zie bijvoorbeeld ref21).
    OPMERKING: C. quinquefasciatus staat bekend om een voorkeur voor vogelbloed. Sommige laboratoria gebruiken verdoofde levende vogels of vogelbloed voor hun bloedmeelbron21,22,23. Kolonies kunnen echter worden getraind / geselecteerd om zich te voeden met runderbloed of kleine knaagdieren als deze functie voor meerdere generaties is geselecteerd.
    1. Laat vrouwtjes minimaal 3 dagen na het bloed voeden rusten om oogenese en eirijping te ondergaan voordat ze ovipositie induceren voor micro-injectie-experimenten.
  2. Maak op de dag van embryonale micro-invoegingen een ovipositiebeker met organisch geïnfundeerd ovipositiewater. Ovipositiewater moet worden gemaakt door konijnenuitwerpselen (50 g/L), ontbindend gras (4,5 g/L) of visvoer (25 g/L) in water te fermenteren gedurende 5 of meer dagen24,25.
  3. Plaats de ovipositiebeker in de kooi en plaats de hele kooi op een donkere plaats (figuur 2C).
  4. Controleer na elke 30 minuten de beker op eiervlotten.
    1. Als er eiervlotten aanwezig zijn, verzamel de vlotten door ze met een penseel te scheppen en op een nat filterpapier te plaatsen (figuur 2D,E).

3. Uitlijning van C. quinquefasciatus pre-blastoderm stadium embryo's

  1. Scheid de eieren van de vlotten door op het vlot te drukken en de eieren afzonderlijk te plagen met behulp van een fijn penseel en een tang (figuur 2E).
  2. Lijn afzonderlijke eieren uit op een dunne strook dubbelzijdig plakband die over de bovenkant van een glazen dia is geplaatst (afbeelding 2F).
  3. Probeer tijdens het uitlijnen de voorste kant van elk ei in dezelfde richting te richten voor een gemakkelijkere toegankelijkheid.
    OPMERKING: Een alternatieve ei uitlijningsmethode zonder dubbelzijdig plakband is te vinden in een eerder gepubliceerd Nasonia vitripennis embryo micro-injection protocol26.
  4. Bedek eieren met de halocarbon oliemix.
    OPMERKING: Halocarbon-mix kan van tevoren worden bereid door twee halokoolstofreagentia en water voorzichtig te mengen (9:1:20, halocarbon 700 : halocarbon 27 : Ultrapure-water) en het mengsel vervolgens 's nachts op 25οC te incuberen om de waterverzadiging van de halokoolstofolie te vergemakkelijken.

4. Naaldvoorbereiding voor micro-injections

  1. Genereer de aluminosilicaat capillaire glazen naalden met behulp van een glazen micropipettrekker.
    1. Plaats een aluminosilicaat capillair glas in een naaldtrekker, volgens de instructies uit de gebruikershandleiding van de naaldtrekker.
      OPMERKING: Kwarts- en borosilicaat capillaire naalden kunnen ook worden gebruikt, maar voor dit experiment heeft aluminosilicaat de voorkeur vanwege de relatieve betaalbaarheid en duurzaamheid.
    2. Stel de warmte in op 516, de snelheid op 100, op vertraging op 70, op 97 en op 500 op de naaldtrekker.
    3. Activeer de naaldtrekker, volgens de instructies van de trekker en herhaal indien nodig voor extra naalden.
      OPMERKING: Tijdens het injectieproces raken naalden vaak verstopt of per ongeluk gebroken, daarom wordt het sterk aanbevolen om extra naalden te trekken voor een enkel experiment.
  2. Schuine kant van de naald door de punt van de getrokken naald voorzichtig aan te raken op de roterende diamant schuurplaat gedurende ongeveer 10 s onder een hoek van 50°.
    OPMERKING: Door de naald af te schuinen, wordt deze geopend om vloeistof door te laten stromen en tegelijkertijd een scherpere punt te creëren voor gemakkelijkere penetratie in het embryo. Een voorbeeld van een goede naald is te zien in een eerder artikel26.
  3. Bewaar getrokken en afgeschuinde naalden door ze in te bedden in lijnen van modelleurklei in een petrischaal.
    OPMERKING: Om de beste kwaliteit voor naaldtips te garanderen, moeten naalden zo dicht mogelijk bij het moment van injectie vers worden getrokken en afgeschuind.

5. Het injectiemengsel laden

  1. Bereid het injectiemengsel bestaande uit genoommodificatiereagentia (bijv. 200 ng/μL sgRNA en 200 ng/μL Cas9-mengsel) of voorkeursinjectieoplossingen voor en houd het op ijs.
    OPMERKING: Deze mix kan worden bereid in afwachting van het leggen van eieren. Meer informatie over de productie en voorbereiding van cas9 en sgRNA voor micro-injection is te vinden in eerdere publicaties27,28,29,30.
  2. Breng 2 μL injectiemengsel in de injectienaald met behulp van een microloadertip.

6. Micro-injection opgezet

  1. Plaats de gevulde injectienaald in een micromanipulator die is gekoppeld aan een elektronische micro-injectiemiddel.
  2. Plaats de glazen dia met de uitgelijnde eieren op het podium van een samengestelde microscoop.
  3. Lijn met behulp van de micromanipulator en de samengestelde microscoop de naald uit om onder een hoek van 25-35° op het achterste uiteinde van het embryo te richten.

7. Embryomicro-injection (Figuur 2G)

  1. Steek de naald voorzichtig in het embryo en injecteer het mengsel met een hoeveelheid van ongeveer 10% van het volume van het embryo (700-800 pL afhankelijk van de grootte van de eieren).
    OPMERKING: Bij het injecteren moet het ei enigszins zwellen, maar als er te veel vloeistof wordt geïnjecteerd, kunnen eieren barsten of kan cytoplasmatische vloeistof uitlekken.
  2. Injecteer ongeveer 20 eieren tegelijk en stop en voer embryoherstelprocedures uit.
    OPMERKING: Tijdens het injecteren is er een grote kans op naalden om te verstoppen of te breken. Als er een verstopping optreedt, die kan worden bepaald door een gebrek aan injectievloeistof die door de naald stroomt, probeer dan de naald schoon te maken met de schone functie op de elektronische micro-injectiector of probeer de naald opnieuw af te schuinen. Als geen van beide stappen werkt, schakel dan snel over naar een nieuwe naald en zorg ervoor dat de voorbereide eieren bevochtigd blijven.

8. Embryoherstel en -uitbroeden

  1. Laat de eieren minstens 5 minuten ongestoord. Verwijder binnen 20 minuten na injectie de halocarbonolie voorzichtig door licht te borstelen met een schone kwast(afbeelding 2H).
  2. Til de eieren voorzichtig op met een penseel en plaats ze in een kopje dubbel gedestilleerd water (figuur 2I). Zorg ervoor dat de eieren op het wateroppervlak blijven.
  3. Controleer de eieren dagelijks gedurende 7 dagen om uit te broeden (figuur 2J).
  4. Volg de normale opfokprocedures voor larven21.

9. Screening op genoommodificatie

  1. Screen de geïnjecteerde muggen op de mutante fenotypes met behulp van een stereoscope (Figuur 2K).
    1. Verifieer mutaties die geen gemakkelijk herkenbaar fenotype hebben, door PCR-versterking, T7 Endonuclease I-assay en sequencing door subcloning van het doelgebied31.
  2. Stel extra kruisingen op tussen geïnjecteerde individuen om erfelijke mutaties in de kiembaan te detecteren.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In eerder gepubliceerde experimenten werd deze methode gebruikt om met succes somatische en kiembaanmutaties te genereren van een gen dat cruciaal is voor de ontwikkeling van donkere oogpigmentatie, wit (CPIJ005542)30 (Tabel 1). CRISPR/Cas9 gegenereerde somatische mutaties werden gescoord door screening op verlies van pigmentatie in de ogen van geïnjecteerde personen in het popstadium (G0). Somatische mutaties waren over het algemeen aanwezig als mozaïekfenotypes waarbij sommige, maar niet alle cellen het mutante fenotype hebben. Somatische mutaties van het witte gen resulteerden bijvoorbeeld in een mengsel van ommatidia met fenotypes zonder pigmentatie en die met een wildtype gepigmenteerd fenotype30. Toen er echter een kiembaanmutatie van het witte gen was, erfde de volgende generatie (G1) het fenotype met volledige witte ogen. Kiembaanmutatiepercentages werden bepaald door mozaïek G0-individuen te kruisen en te scoren voor volledig witte ogen nakomelingen (G1). Deze experimenten resulteerden in een overlevingspercentage van 64% tot 82% embryo's, evenals een somatisch mutagenesepercentage van 37% tot 57% en een >61% kiembaanmutagenese (tabel 1). Door multiplexing sgRNAs om meerdere loci in hetzelfde gen te richten, stegen de somatische en kiembaan mutagenesepercentages naar boven tot maar liefst 86% (Tabel 1). Bovendien worden al vele generaties levensvatbare homozygote bestanden van de witte mutanten met succes in het lab bewaard.

figure-results-1
Figuur 1: C. quinquefasciatus eivlot en enkele eimorfologie.
Dorsale (A), laterale (B) en ventrale (C) uitzicht op C quinquefasciatus eiervlotten. C. quinquefasciatus vrouwtjes leggen hun eieren met de meer bolvormige voorste kant die het wateroppervlak raakt, terwijl de meer puntige posterieure weg van het wateroppervlak (D). A- voorste; P- posterior Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Tijdlijn voor het maken van C. quinquefasciatus mutanten door micro-injection.
Tijdlijn van C. quinquefasciatus kolonievoorbereiding en embryoverzameling voor micro-injection (A-D). Verzamelde eieren worden vervolgens gescheiden (E) uitgelijnd in dezelfde richting en bedekt met halokoolstofolie (F). De eieren worden vervolgens geïnjecteerd (G) en mogen minimaal 5 minuten rusten voordat de halocarbonolie (H) wordt verwijderd. Eieren worden vervolgens overgebracht naar een schoonwaterbron (I) voor het uitkomen (J) en gescreend op mutante fenotypen (K). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

OverlevingSomatisch mozaïek (G0)Kiembaan mutagenese (G1)
SgRNA#injected♂♀Totaal (%)♂♀Totaal (%)G1 mutanten (%)
wsgRNA-150152035(70)7(47)13(65)20(57)128(69)
wsgRNA-25093241(82)3(33)12(38)15(37)51(61)
wsgRNA-350171532(64)7(41)8(53)15(47)157(72)
wsgRNA-1/wsgRNA-25071623(46)5(71)12(75)17(74)123(79)
wsgRNA-1/wsgRNA-35013922(44)10(77)6(67)16(73)72(81)
wsgRNA-2/wsgRNA-350171027(54)13(76)8(80)21(78)101(85)
wsgRNA-1/wsgRNA-2/wsgRNA-350111021(42)9(82)9(90)18(86)149(86)

Tabel 1: Overlevings- en mutatiepercentages van embryo's geïnjecteerd met enkelvoudige en multiplexed gRNAs gericht op wit. De tabel wordt herdrukt met toestemming van30

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met recente inspanningen om genetisch gemanipuleerde tools voor muggenvectorbestrijding te genereren, is het nodig om embryomicro-injectieprotocollen te ontwikkelen en te optimaliseren voor veelvoorkomende muggenziektevectoren. Hoewel er methoden zijn ontwikkeld voor Aedes- en Anopheles-muggen, is een protocol dat speciaal voor Culex is ontworpen, minimaal onderzocht. Over het algemeen kunnen muggenembryo-injectieprotocollen worden onderverdeeld in 3 algemene stappen: 1) embryoverzameling en -voorbereiding, 2) embryo-injectie en 3) herstel na injectie. Om mutanten succesvol te genereren, moeten alle drie de stappen worden geoptimaliseerd voor de doelsoort. Dit aangepaste protocol voor embryomicro-injection is specifiek voor succesvolle genoomtechniek van Culex-muggen.

Het maximaliseren van embryoverzameling is een veel voorkomend knelpunt in embryomicro-injectieprotocollen. Om het aantal verzamelde eieren in korte tijd te verhogen, werden muggen gedurende 2-3 dagen na het bloedmeel beperkt van een ovipositiesubstraat. Het is belangrijk op te merken dat C. quinquefasciatus de neiging heeft om de voorkeur te geven aan aviaire bloedbronnen in tegenstelling tot zoogdierbronnen of membraanvoeding met zoogdierbloed. Veel onderzoekers hebben echter moeite om een betrouwbare bron van levende vogels of vogelbloed te verkrijgen voor bloedvoeding, zodat laboratoriumbestanden kunnen worden aangepast om zich te voeden met meer toegankelijke bloedbronnen. Het is ook cruciaal om voedingsrijk water te gebruiken voor het ovipositiesubstraat, omdat het ovipositie-aanwijzingen biedt voor C. quinquefasciatus en de meeste andere Culex-vectoren. Er zijn veel methoden om voedselrijk water te genereren, dat mogelijk moet worden geoptimaliseerd tussen laboratoria om ervoor te zorgen dat een geschikt aantal eieren beschikbaar is voor micro-insectie. Hoewel deze methode bijvoorbeeld het meest succesvol was met konijnenuitwerpselen die gedurende 5 of meer dagen in gedeioneerd water werden gefermenteerd, hebben andere onderzoekers meer succes met gras- of visvoer als voedingsbron en sommige zelfs met gedestilleerd water21.

Omdat Culex-muggen groepen eieren in vlotten leggen, is het verzamelen van eieren vrij eenvoudig. Eieren kunnen eenvoudig worden verzameld door het hele vlot met een penseel te scheppen. Eischeiding is ingewikkelder, maar essentieel voor een succesvolle injectie. Eieren kunnen zorgvuldig van het vlot worden gescheiden door zachte neerwaartse druk tussen eieren met penseel of tang toe te passen. Met enige oefening waren meerdere gebruikers betrouwbaar in staat om enkele eieren van eiervlotten te scheiden. Na het scheiden van elk ei worden de eieren in dezelfde richting uitgelijnd op dubbelzijdig plakband, dat de eieren stabiliseert tijdens micro-injection. Eieren worden geïnjecteerd in het taps toelopende achterste uiteinde en de toevoeging van halokoololie houdt de eieren vochtig tijdens manipulatie.

Om embryoschade tijdens micro-injectie te beperken, moeten injectienaalden van de juiste sterkte zijn en onder een geschikte hoek worden afgeschuind. Aluminosilicaatnaalden die 10 seconden onder een hoek van 50° werden afgeschuind, hadden de beste resultaten, maar borosilicaat- en kwartsnaalden kunnen ook werken, ook al zijn ze misschien minder duurzaam en duurder. Bovendien vergemakkelijkt een goede naaldafschuining een betere doorstroming van de Cas9- en sgRNA-mengsels en creëert het een scherper punt voor gemakkelijkere penetratie in het embryo. In veel gevallen is afschuinen ook een efficiënte manier om verstopte naalden snel te repareren in plaats van de tijd en moeite te besteden aan het vervangen van verstopte naalden.

Na injectie moeten de eieren ten minste 5 minuten ongestoord blijven, waarbij de halokoolstofolie onmiddellijk daarna wordt verwijderd door deze voorzichtig weg te borstelen met een schone kwast. Na verwijdering van de halocarbonolie kunnen de geïnjecteerde eieren in water worden geplaatst om uit te komen, wat meestal binnen 3 dagen na injectie gebeurt. Met oefening en voldoende aantallen eieren kan dit protocol consistente somatische en kiembaanmutaties bereiken in C. quinquefasciatus en is veelzijdig genoeg om het gemakkelijk aan te passen aan andere Culex-muggen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door UCSD-opstartfondsen gericht op O.S.A.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
9 oz clear plastic pet cupKaratC-KC9Insect Rearing and Egg Collection
Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter)Sutter InstrumentsBF100-58-10Microinjection, borosilicate and quartz needles could also be used but we prefered aluminosilicate
BloodColorado Serum Company31025The colony took multiple generations to adapt to this blood source. Other blood sources are likely just as appropriate. See protocol notes on blood source selection.
BugdormBugdorm4F2222Insect Rearing Cage
Cas9 Protein with NLSPNABioCP01Microinjection
Compound MicroscopeOlympus BX41Microinjection, for embryo injection
Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes)Sutter Instruments104EMicroinjection, to be used with beveler
DNase/RNase-Free distilled WaterInvitrogen10977-015Microinjection
Double-sided TapeScotchB084NVQGXDMicroinjection, embryo alignment
Femtojet 4x or 4i programmable microinjectorEppendorfMicroinjection
Femtotips Microloader tipsFisher ScientificE5242956003Microinjection
Filter PaperWhatman1001-090Microinjection, embryo collection
Fine-tip paintbrushZEM2595Microinjection, embryo alignment
Halocarbon oil 27Sigma-AldrichH8773Microinjection, embryo alignment
Halocarbon oil 700Sigma-AldrichH8898Microinjection, embryo alignment
HemotekHemotekPS5Line Maintenance
Microelectrode BevelerSutter InstrumentsBV10Microinjection, needle beveling
Micropipette PullerSutter InstrumentsP-1000 or P-2000Microinjection, needle pulling
Microscope SlidesFisherbrand12-550-A3Microinjection, embryo alignment
Non-Drying Modeling ClayJoviB0025Z71IMMicroinjection, needle storage
Stereo MicroscopeOlympusSZ51Microinjection, for embryo alignment
SugarDomino20% sugar solution for adult sugar source.
T7 Endonuclease INEBM0302Preparation of microinjection materials
TOPO TA Cloning KitThermoFischer ScientificK451020Preparation of microinjection materials
Ultra-fine tip forcepsFisher Scientific16-100-121Microinjection, embryo alignment

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. https://www.cdc.gov/westnile/statsmaps/cumMapsData.html#eight (2019).">Final Cumulative Maps and Data | West Nile Virus. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/westnile/statsmaps/cumMapsData.html#eight (2019).
  2. https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animalhealth/animal-disease-information/equine/wnv (2020).">APHIS | West Nile Virus (WNV). USDA. , Available from: https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animalhealth/animal-disease-information/equine/wnv (2020).
  3. Persistent impacts of West Nile virus on North American bird populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), 14290-14294 (2015).">Luke George, T., et al. Persistent impacts of West Nile virus on North American bird populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), 14290-14294 (2015).
  4. The Epizootiology and Ecological Significance of Malaria in Hawaiian Land Birds. Ecological Monographs. 56 (4), 327-344 (1986).">van Riper, C., van Riper, S. G., Lee Goff, M., Laird, M. The Epizootiology and Ecological Significance of Malaria in Hawaiian Land Birds. Ecological Monographs. 56 (4), 327-344 (1986).
  5. Mitigating Future Avian Malaria Threats to Hawaiian Forest Birds from Climate Change. PloS One. 12 (1), 0168880(2017).">Liao, W., Atkinson, C. T., LaPointe, D. A., Samuel, M. D. Mitigating Future Avian Malaria Threats to Hawaiian Forest Birds from Climate Change. PloS One. 12 (1), 0168880(2017).
  6. Transcriptomic analysis of insecticide resistance in the lymphatic filariasis vector Culex quinquefasciatus. Scientific Reports. 9 (1), 11406(2019).">Martins, W. F. S., et al. Transcriptomic analysis of insecticide resistance in the lymphatic filariasis vector Culex quinquefasciatus. Scientific Reports. 9 (1), 11406(2019).
  7. Insecticide resistance in Culex quinquefasciatus mosquitoes after the introduction of insecticide-treated bed nets in Macha, Zambia. Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 36 (2), 411-420 (2011).">Norris, L. C., Norris, D. E. Insecticide resistance in Culex quinquefasciatus mosquitoes after the introduction of insecticide-treated bed nets in Macha, Zambia. Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 36 (2), 411-420 (2011).
  8. Multiple insecticide resistance mechanisms in Anopheles gambiae and Culex quinquefasciatus from Benin, West Africa. Acta tropica. 101 (3), 207-216 (2007).">Corbel, V., et al. Multiple insecticide resistance mechanisms in Anopheles gambiae and Culex quinquefasciatus from Benin, West Africa. Acta tropica. 101 (3), 207-216 (2007).
  9. Insecticide resistance status in Culex quinquefasciatus in Benin. Parasites & Vectors. 8, 17(2015).">Yadouléton, A., et al. Insecticide resistance status in Culex quinquefasciatus in Benin. Parasites & Vectors. 8, 17(2015).
  10. Wolbachia-based population control strategy targeting Culex quinquefasciatus mosquitoes proves efficient under semi-field conditions. PloS One. 10 (3), 0119288(2015).">Atyame, C. M., et al. Wolbachia-based population control strategy targeting Culex quinquefasciatus mosquitoes proves efficient under semi-field conditions. PloS One. 10 (3), 0119288(2015).
  11. Cytoplasmic incompatibility as a means of controlling Culex pipiens quinquefasciatus mosquito in the islands of the south-western Indian Ocean. PLoS Neglected Tropical Diseases. 5 (12), 1440(2011).">Atyame, C. M., et al. Cytoplasmic incompatibility as a means of controlling Culex pipiens quinquefasciatus mosquito in the islands of the south-western Indian Ocean. PLoS Neglected Tropical Diseases. 5 (12), 1440(2011).
  12. Effects of Wolbachia on fitness of Culex quinquefasciatus (Diptera; Culicidae). Infection, Genetics and Evolution: Journal of Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics in Infectious Diseases. 11 (8), 2138-2143 (2011).">Almeida, F., et al. Effects of Wolbachia on fitness of Culex quinquefasciatus (Diptera; Culicidae). Infection, Genetics and Evolution: Journal of Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics in Infectious Diseases. 11 (8), 2138-2143 (2011).
  13. Development of a confinable gene drive system in the human disease vector Aedes aegypti. eLife. 9, 51701(2020).">Li, M., et al. Development of a confinable gene drive system in the human disease vector Aedes aegypti. eLife. 9, 51701(2020).
  14. Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control. BMC Biology. 5, 11(2007).">Phuc, H. K., et al. Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control. BMC Biology. 5, 11(2007).
  15. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).">Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
  16. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6736-6743 (2015).">Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6736-6743 (2015).
  17. Engineered resistance to Zika virus in transgenic expressing a polycistronic cluster of synthetic small RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3656-3661 (2019).">Buchman, A., et al. Engineered resistance to Zika virus in transgenic expressing a polycistronic cluster of synthetic small RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3656-3661 (2019).
  18. Broad dengue neutralization in mosquitoes expressing an engineered antibody. PLoS Pathogens. 16 (1), 1008103(2020).">Buchman, A., et al. Broad dengue neutralization in mosquitoes expressing an engineered antibody. PLoS Pathogens. 16 (1), 1008103(2020).
  19. Engineered resistance to Plasmodium falciparum development in transgenic Anopheles stephensi. PLoS Pathogens. 7 (4), 1002017(2011).">Isaacs, A. T., et al. Engineered resistance to Plasmodium falciparum development in transgenic Anopheles stephensi. PLoS Pathogens. 7 (4), 1002017(2011).
  20. Multiple Cytochrome P450 genes: their constitutive overexpression and permethrin induction in insecticide resistant mosquitoes, Culex quinquefasciatus. PloS One. 6 (8), 23403(2011).">Liu, N., Li, T., Reid, W. R., Yang, T., Zhang, L. Multiple Cytochrome P450 genes: their constitutive overexpression and permethrin induction in insecticide resistant mosquitoes, Culex quinquefasciatus. PloS One. 6 (8), 23403(2011).
  21. Rearing of Culex spp. and Aedes spp. Mosquitoes. Bio Protocols. 7 (17), 2542(2017).">Kauffman, E., et al. Rearing of Culex spp. and Aedes spp. Mosquitoes. Bio Protocols. 7 (17), 2542(2017).
  22. Effects of blood meal source on the reproduction of Culex pipiens quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 37 (1), 1(2012).">Richards, S. L., Anderson, S. L., Yost, S. A. Effects of blood meal source on the reproduction of Culex pipiens quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 37 (1), 1(2012).
  23. Techniques for Rearing Culex Mosquitoes. American Midland Naturalist. 52 (1), 253(1954).">Kitzmiller, J. B., Micks, D. W. Techniques for Rearing Culex Mosquitoes. American Midland Naturalist. 52 (1), 253(1954).
  24. Behavioural and electrophysiological evaluation of oviposition attractants for Culex quinquefasciatus say (Diptera: Culicidae). Experientia. 48 (11-12), 1109-1111 (1992).">Mordue, A. J., Blackwell, A., Hansson, B. S., Wadhams, L. J., Pickett, J. A. Behavioural and electrophysiological evaluation of oviposition attractants for Culex quinquefasciatus say (Diptera: Culicidae). Experientia. 48 (11-12), 1109-1111 (1992).
  25. Oviposition preference and offspring performance in container breeding mosquitoes: evaluating the effects of organic compounds and laboratory colonisation. Ecological Entomology. 42 (4), 506-516 (2017).">Allgood, D. W., Yee, D. A. Oviposition preference and offspring performance in container breeding mosquitoes: evaluating the effects of organic compounds and laboratory colonisation. Ecological Entomology. 42 (4), 506-516 (2017).
  26. Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation. Journal of Visualized Experiments. (130), e56990(2017).">Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation. Journal of Visualized Experiments. (130), e56990(2017).
  27. Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 7 (1), 1-7 (2017).">Li, M., et al. Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 7 (1), 1-7 (2017).
  28. Highly Efficient Site-Specific Mutagenesis in Malaria Mosquitoes Using CRISPR. Genes, Genomes, Genetics. 8 (2), 653-658 (2018).">Li, M., Akbari, O. S., White, B. J. Highly Efficient Site-Specific Mutagenesis in Malaria Mosquitoes Using CRISPR. Genes, Genomes, Genetics. 8 (2), 653-658 (2018).
  29. Germline Cas9 Expression Yields Highly Efficient Genome Engineering in a Major Worldwide Disease Vector, Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (49), 10540-10549 (2017).">Li, M., Bui, M., Yang, T., White, B. J., Akbari, O. S. Germline Cas9 Expression Yields Highly Efficient Genome Engineering in a Major Worldwide Disease Vector, Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (49), 10540-10549 (2017).
  30. Methods for the generation of heritable germline mutations in the disease vector Culex quinquefasciatus using clustered regularly interspaced short palindrome repeats-associated protein 9. Insect Molecular Biology. 29 (2), 214-220 (2020).">Li, M., et al. Methods for the generation of heritable germline mutations in the disease vector Culex quinquefasciatus using clustered regularly interspaced short palindrome repeats-associated protein 9. Insect Molecular Biology. 29 (2), 214-220 (2020).
  31. https://www.neb.com/protocols/2014/08/11/determining-genome-targeting-efficiency-using-t7-endonuclease-i (2020).">New England Biolabs Determining Genome Targeting Efficiency using T7 Endonuclease I. NEB. , Available from: https://www.neb.com/protocols/2014/08/11/determining-genome-targeting-efficiency-using-t7-endonuclease-i (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Embryo MicroinjectionCulex QuinquefasciatusEgg Raft SeparationCRISPR Cas9Germline MutagenesisNeedle PreparationHalocarbon OilMicromanipulator UseSomatic MutationsEgg Collection

Related Articles