Methodenartikel

Een kwantitatieve detectiemethode voor microRNA's in de nier van een ischemisch nierletsel muismodel

DOI:

10.3791/61378

⸱

11 september 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Nephrology, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel presenteert een protocol voor het detecteren van microRNA-expressie in de nieren van een muismodel met acuut nierletsel met behulp van kwantitatieve real-time reverse-transcriptie polymerasekettingreactie. Dit protocol legt de nadruk op een ischemisch nierletselmuismodel en de zorgvuldige extractie van microRNA-monsters.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroRNA's (miRNA's) zijn betrokken bij verschillende ziektetoestanden en zijn effectieve biomarkers voor de vroege diagnose van ziekten en behandeling bij muizen. Standaardprotocollen voor de zuivering van miRNA's en de detectie van hun expressie in de nieren van muizen met acuut nierletsel (AKI) zijn echter niet goed vastgesteld. Deze studie ontwikkelde een effectief en eenvoudig protocol om miRNA's in de nieren van een AKI-muismodel geïnduceerd door renale ischemie-reperfusie te zuiveren en kwantificeren met behulp van kwantitatieve real-time reverse-transcriptie polymerasekettingreactie (qRT-PCR). Dit protocol bestaat uit vijf stappen: 1) inductie van AKI door renale ischemie-reperfusie, 2) oogsten van nieren, 3) zuivering van totaal RNA, inclusief miRNA's, uit nieren, 4) cDNA-synthese door reverse transcriptie van miRNA, en 5) qRT-PCR om miRNA-expressie te detecteren. Met behulp van dit protocol kan het nierischemie-reperfusieschademodel worden gegenereerd bij milde tot ernstige vormen van AKI. Als de procedure correct wordt gevolgd, kan bovendien een consistent AKI-model met minimale individuele verschillen worden verkregen. Deze qRT-PCR-test vertoont een zeer breed dynamisch bereik en maakt de discriminatie van rijpe miRNA's mogelijk, die nauwkeurig kunnen worden gekwantificeerd met hoge specificiteit. Dit protocol kan worden gebruikt om het miRNA-expressieprofiel in AKI-nieren te bestuderen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ischemie-reperfusieschade (IRI) van de nier vertegenwoordigt een van de belangrijkste risicofactoren voor de ontwikkeling van acuut nierletsel (AKI)1. AKI speelt een belangrijke rol bij de prognose van de patiënt, maar specifieke therapieën en vroege diagnostische biomarkers zijn nog niet vastgesteld.

MicroRNA's (miRNA's) zijn korte, niet-coderende RNA's met ongeveer 18-25 basen. miRNA's zijn stabiel in lichaamsvloeistoffen en hun sequenties zijn sterk geconserveerd bij dieren2. MiRNA's reguleren de expressie van meerdere eiwitten via duizenden doelen, waardoor ze verschillende signaalroutes beïnvloeden 2,3,4,5,6,7,8. In de afgelopen jaren is gemeld dat miRNA's betrokken zijn bij verschillende ziektetoestanden en effectieve biomarkers zijn voor de vroege diagnose van verschillende ziekten.

Het algemene doel van dit protocol is het succesvol zuiveren en detecteren van miRNA's in de nieren van een AKI-muismodel geïnduceerd door IRI. Dit IRI-model is een veelgebruikt model van AKI en nierfibrose. De voordelen van het IRI-model zijn onder meer dat het visueel kan bevestigen of ischemie-reperfusie is bereikt en het exacte tijdstip van aanvang van AKI kan bepalen. Een klemduur die lang genoeg is om brede buisschade te veroorzaken, wordt echter geassocieerd met een hoog sterftecijfer, terwijl een korte klemduur geen buisvormige schade veroorzaakt, wat resulteert in een grote variatie in de progressie van buisvormige schade in dit experimentele model. Vergeleken met het bilaterale klemmodel fungeert het juiste nefrectomieweefsel dat in het unilaterale nier-IRI-model wordt geoogst als een controle en zorgt voor nierfalen.

Het niermonster wordt gepureerd met behulp van een glashomogenisator, waarin eiwitten en nucleïnezuren worden gescheiden en DNA en RNA worden gescheiden9. Totaal RNA, inclusief miRNA, wordt gezuiverd uit het niermonster met behulp van een op silicamembraan gebaseerde spinkolom9. Vervolgens wordt cDNA-synthese (reverse transcriptie) uitgevoerd uit totaal RNA met behulp van poly(A)polymerase en oligo-dT primers10. Ten slotte wordt de miRNA-expressie bepaald door qRT-PCR met behulp van een intercalerende kleurstof10. qRT-PCR kan genexpressie nauwkeuriger kwantificeren in vergelijking met PCR van amplificatievolumes op eindpunten. qRT-PCR meet hoge concentraties en wordt gekenmerkt door een breed dynamisch bereik, waardoor een nauwkeurige kwantificering mogelijk is die afhankelijk is van het aantal cycli. Eerdere studies meldden dat eenvoudige processen kunnen worden gebruikt om miRNA's in weefsels effectief te zuiveren en te detecteren 8,9,10. Er is gemeld dat de in dit protocol beschreven methoden voor cDNA-synthese (reverse transcriptie) en de detectie van miRNA-expressie door qRT-PCR met behulp van een intercalerende kleurstof een hoge nauwkeurigheid en gevoeligheid vertonen10.

Bovendien is dit protocol eenvoudig en bereikt het consistente resultaten tussen laboratoria. Daarom is dit protocol nuttig in onderzoeken die zeer nauwkeurige en gevoelige miRNA-detectie vereisen in de AKI-nieren van muizen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierexperimentele protocollen zijn goedgekeurd door de dierethische commissie van Jichi Medical University en uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor het gebruik en de verzorging van proefdieren uit de Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals.

1. IRI-model

OPMERKING: Controleer tijdens de procedure zorgvuldig op onderkoeling, darmhydratatie en diepte van de anesthesie.

  1. Bereid de volgende items voor: een centrifugebuis van 50 ml met katoen gedrenkt in isofluraan, een verwarmd chirurgisch kussen, een petrischaaltje met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), een chirurgische schaar en een tang. Houd de PBS op 37 °C.
    OPMERKING: Dit IRI-model is gegenereerd met behulp van mannelijke C57BL/6-muizen (9 weken; 20-25 g) gehuisvest in een kamer met gecontroleerde temperatuur, vochtigheid en een licht-donkercyclus van 12 uur.
  2. Verdoof het dier met isofluraan: inductieconcentratie 3%-5%, onderhoudsconcentratie 2%-3% en concentratie tijdens het klemmen 1%-1,5%. Bevestig de diepte van de anesthesie door het verlies van reflexen. Inhalatie-anesthesie heeft als voordeel dat de tijd kan worden aangepast. De procedure kan veel tijd in beslag nemen vanwege de afschilfering van het weefsel rond de nier. Het nadeel van inhalatie-anesthesie is echter dat de lichaamstemperatuur de neiging heeft te dalen. Vermijd tijdens de procedure onnodige anesthesie.
  3. Monteer de verdoofde muis op een verwarmd chirurgisch kussen op zijn rug, verwijder het haar rond de incisie en spuit de buikhuid van de muis in met 70% ethanol.
  4. Maak een incisie in de middellijn in de buikhuid, spier en peritoneale membraan met behulp van een schaar en tang.
  5. Gebruik een wattenstaafje bevochtigd met PBS en duw de darm voorzichtig naar de linkerkant van de extra-abdominale holte, waardoor de rechternier en urineleider bloot komen te liggen. De lange proceduretijd zal waarschijnlijk postoperatief darmletsel veroorzaken. Het is dus beter om te opereren zonder de darmen uit de buikholte te verwijderen wanneer een gezichtsveld kan worden verkregen. Vermijd uitdroging van de darmen. Droge wattenstaafjes of gaasjes kunnen darmbeschadiging veroorzaken.
  6. Til de rechter urineleider op met een schuine tang. Ligate de rechter urineleider twee keer met behulp van 4/0 met zijde gevlochten hechtingen. Knip tussen de hechtingen, waardoor de hechtdraad die dichter bij de nier zit langer blijft.
  7. Houd de resterende hechtdraad voorzichtig vast zonder te veel te trekken en ontleed botweg het bindweefsel en vet langs de nier. Door een operatie van achteren uit te voeren, wordt de kans op leverschade verkleind.
    1. Identificeer een bloedvat, anders dan de nierslagaders en -aders, dat bloed naar de rechternier voert, en bind of knip het vervolgens. Wanneer de rechternier voldoende is losgemaakt, lig dan de rechter nierslagader en -ader met behulp van een 4/0 met zijde gevlochten hechtdraad. Gebruik in plaats van hechten een hemostatische clip.
    2. Gebruik een wattenstaafje bevochtigd met PBS om de darm voorzichtig naar de rechterkant van de extra-buikholte te duwen om de linkernier bloot te leggen en bedek de darm vervolgens met een bevochtigd laken om te voorkomen dat deze uitdroogt. Ontleed het bindweefsel en vet rond de linker nier.
  8. Identificeer een ander bloedvat dan de nierslagaders en -aders, dat de linkernier van bloed voorziet, en bind of knip het vervolgens. Klem de nierslagader en de nierader vast om ischemie van de linker nier te induceren. Plaats de hemostatische clip op ongeveer 1 cm van de nier om schade aan het nierparenchym te voorkomen. Succesvolle ischemie kan visueel worden bevestigd door een geleidelijke uniforme verdonkering van de nier.
  9. Breng de darmen terug naar de buikholte en zorg ervoor dat darmverdraaiing wordt voorkomen; Sluit de buikhuid tijdelijk af en drapeer deze om een vochtige omgeving te behouden. Verminder de concentratie van inademingsanesthesie zoveel mogelijk en probeer het dier warm te houden. De klemtijd is 25–45 min. Een langere klemtijd veroorzaakt ernstigere nierschade, maar verhoogt ook de mortaliteit op lange termijn. Pas aan door de pathologieresultaten te analyseren.
  10. Verwijder de klem nadat de periode van ischemie is afgelopen. Zorg ervoor dat de reperfusie van de bloedstroom en de nierkleur verbeteren. Controleer of de darm niet verdraaid is voordat u de buikhuid sluit. Indruppel PBS intraperitoneaal als volumesupplement voordat de buik in twee lagen wordt gesloten. Sluit de buikhuid met behulp van 4-0 nylon hechtingen. Voor langere perioden van nierverwijdering kan de kans op darmverklevingen worden verminderd door de buikwand en het buikvlies afzonderlijk te sluiten.
  11. Om het risico op postoperatieve infectie te minimaliseren, brengt u een antisepticum (bijv. jodium-/alcoholoplossing) aan op het operatiegebied.

2. Afname van niermonsters

OPMERKING: Deze video heeft een klemtijd van 45 minuten, waarbij de nieren 24 uur later worden verzameld.

  1. Verdoof het dier met 5% isofluraan en bevestig de diepte van de anesthesie door het verlies van reflexen.
  2. Maak een incisie in de middellijn in de buikhuid, spier en peritoneale membraan met behulp van een schaar en tang. Verzamel het bloed van de inferieure vena cava die is doorboord met een naald van 27 G.
  3. Maak een incisie in de middellijn in de borstwand en steek een naald van 23 G in de linker hartkamer. Bevestig de terugstroom. Maak een incisie in de lever en injecteer 20 ml PBS. Terwijl het bloed wegvloeit, verandert de lever van kleur van rood naar roze, wat bevestigt dat er voldoende bloed is afgevoerd.
  4. Verwijder de linker nier met een tang en een schaar en was deze met PBS in een petrischaaltje. Verwijder de nierfascia met een tang en zorg ervoor dat de nier niet uitdroogt.
  5. Snijd de nier doormidden en gebruik de ene helft voor histopathologie en de andere helft voor de volgende stap. Vermijd het nierbekken en oogst 30 mg van de nier. Bewaar dit voor gebruik bij -80 °C.

3. Zuiveren van miRNA's uit niermonsters

OPMERKING: Hier worden niermonsters met een gewicht van 30 mg gehomogeniseerd met behulp van een glashomogenisator en een biopolymeerversnipperingssysteem in een microcentrifuge-spinkolom. Vervolgens wordt miRNA uit het niermonster geïsoleerd met behulp van een op silicamembraan gebaseerde spinkolom.

  1. Bereid de volgende items voor: microcentrifugebuisjes van 1,5 of 2,0 ml, 100% ethanol, chloroform, een glashomogenisator, ijs, een biopolymeerversnipperingssysteem in een microcentrifuge-spinkolom9, op silicamembraan gebaseerde spinkolommen9, lysisagens op basis van fenol/guanidine, wasbuffer met guanidine en ethanol (wasbuffer 1) en wasbuffer met ethanol (wasbuffer 2).
  2. Plaats een niermonster van 30 mg in een glashomogenisator en voeg 700 μl lysisreagens op basis van fenol/guanidine toe. Voer deze stap uit op ijs omdat het weefsel door hitte wordt gedenatureerd.
  3. Homogeniseer het niermonster door de stamper langzaam op het monster te drukken door het te draaien. Herhaal dit proces enkele tientallen keren op ijs totdat het niermonster volledig is opgelost in het lysisreagens op basis van fenol/guanidine. Wanneer miRNA niet wordt verkregen in latere metingen, is dit waarschijnlijk vanwege onvoldoende oplossen.
  4. Voor verdere homogenisatie brengt u het gehomogeniseerde lysaat over naar het biopolymeerversnipperingssysteem in een microcentrifuge-spinkolom die in een opvangbuis van 2,0 ml is geplaatst. Centrifugeer dit bij 14.000 × g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Breng het gehomogeniseerde lysaat over in een nieuwe microcentrifugebuis.
  6. Voeg 140 μL chloroform toe aan het gehomogeniseerde lysaat en sluit de buis goed af. Meng de tube 15 s door inversie.
  7. Incubeer de monsters gedurende 2-3 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer ze vervolgens 15 minuten bij 12.000 × g bij 4 °C.
  8. Breng het bovenstaande (normaal 300 μl) over in een nieuwe microcentrifugebuis zonder het neerslag te verstoren en voeg 1,5 volume (normaal 450 μl) 100% ethanol toe. Meng het monster door 5 s te vortexen.
  9. Pipetteer tot 700 μl van het monster in een op silicamembraan gebaseerde spinkolom die in een verzamelbuis van 2,0 ml is geplaatst. Sluit de kolomdop en centrifugeer gedurende 15 s bij 15.000 × g . Gooi na het centrifugeren de doorstroming in de opvangbuis weg.
  10. Voeg 700 μL wasbuffer 1 toe aan de centrifugekolom op basis van silicamembranen om het monster grondig te wassen. Sluit de dop van de kolom en centrifugeer deze gedurende 15.000 × g gedurende 15 s. Gooi na het centrifugeren de doorstroming in de opvangbuis weg.
  11. Voeg 500 μL wasbuffer 2 toe aan de centrifugekolom op basis van silicamembraan om eventuele sporen van zout te verwijderen. Sluit de dop van de kolom en centrifugeer gedurende 15 s bij 15.000 × g . Gooi na het centrifugeren de doorstroming in de opvangbuis weg.
    1. Herhaal stap 3.11.
  12. Centrifugeer de centrifuge van de centrifuge op basis van silicamembranen opnieuw op 15.000 × g gedurende 1 min. Gooi na het centrifugeren de doorstroming in de opvangbuis weg.
  13. Plaats de spinkolom op basis van silicamembranen in een nieuwe opvangbuis van 1,5 ml. Breng 25 μL RNasevrij water over in de kolom en sluit de dop van de kolom. Laat het monster 5 minuten op kamertemperatuur staan en centrifugeer het vervolgens gedurende 1 minuut op 15.000 × g .
  14. Breng het 25 μL eluaat met miRNA's over naar een nieuwe microcentrifugebuis. Omdat miRNA wordt afgebroken door herhaald oplossen, wordt aanbevolen om het monster in 2 of 3 buisjes te doseren. Bewaar deze voor gebruik bij -80 °C.

4. Omgekeerde transcriptie van miRNA

OPMERKING: Hier wordt 1,0 μg geïsoleerd RNA omgekeerd getranscribeerd met behulp van reverse transcriptase, poly(A)polymerase en oligo-dT-primers.

  1. Bereid de volgende items voor: 1,5 ml microcentrifugebuisjes; Stripbuizen met 8 putjes; RNase-vrij water; ijs; een 10x nucleïnezuurmix met deoxynucleotiden, ribonucleotidetrifosfaten en oligo-dT-primers; een mix van poly(A)polymerase en reverse transcriptase; en activerende buffer, waaronder Mg2+, desoxyribonucleotiden, oligo-dT-primers en willekeurige primers10.
  2. Bereid een mastermix-oplossing voor met 2,0 μl 10x nucleïnezuurmix, 2,0 μl poly(A)-polymerase en reverse transcriptase-mix en 4,0 μl 5x activerende buffer, inclusief Mg2+, desoxyribonucleotiden, oligo-dT-primers en willekeurige primers, voor een totaal van 8,0 μl per buisje.
  3. Doseer 8,0 μl van de mastermixoplossing in elke buis.
  4. Voeg 1,0 μg geïsoleerde miRNA's gezuiverd uit het niermonster toe aan elk buisje.
  5. Voeg RNasevrij water toe aan elke buis tot een totaal van 20 μL. Meng grondig door te pipetteren en centrifugeer op 1.500 x g gedurende 15 s.
  6. Incubeer de monsters gedurende 60 minuten bij 37 °C, onmiddellijk gevolgd door een incubatie gedurende 5 minuten bij 95 °C. Deze stap kan worden uitgevoerd in een thermische cycler.
  7. Breng het cDNA over in een nieuwe microcentrifugebuis en verdun 10 keer (1:10) met RNase-vrij water.
  8. Bewaar het verdunde cDNA voor gebruik op korte termijn op ijs en op lange termijn bij -80 °C.

5. qRT-PCR van miRNA

OPMERKING: qRT-PCR van miRNA wordt uitgevoerd met behulp van een intercalerende kleurstof. Hier werden primers gebruikt voor U6 small nuclear 2 (RNA-2), miRNA-17-5p, miRNA-18a-5p, miRNA-21a-5p, miRNA-132-3p, miRNA-212-3p, miRNA-223-3p en miRNA-574-5p.

  1. Bereid de volgende items voor: microcentrifugebuisjes van 1,5 ml, reactieplaten met 96 putjes voor qRT-PCR, zelfklevende film voor de reactieplaat met 96 putjes, miRNA-specifieke primers, PCR Master Mix bestaande uit Taq DNA-polymerase, PCR-buffer, deoxynucleotiden en universele primers10, en een real-time PCR-instrument.
  2. Bereid een mastermix voor met 12,5 μL 2x PCR Master Mix, 2,5 μL van elke miRNA-primer (5 μM) opgelost in nucleasevrij water, en 1,25 μL 10x universele primers voor elk putje.
  3. Doseer 22,5 μl van het mastermengsel in elk putje van de plaat met 96 putjes.
  4. Voeg 2,5 μL sjabloon-cDNA toe aan elk putje.
  5. Sluit de plaat af met de zelfklevende folie voor de reactieplaat met 96 putjes. Centrifugeer de plaat vervolgens gedurende 30 s op 1.000 × g .
  6. Gebruik het real-time PCR-instrument en de software om het PCR-cyclusprogramma als volgt uit te voeren.
    1. Plaats de plaat in het real-time PCR-instrument. Wijs een naam toe aan het monster en doelmiRNA in elk putje met behulp van de Real-Time PCR-software.
    2. Voer de volgende PCR-cyclusomstandigheden in de real-time PCR-software in volgens de instructies: pre-incubatie bij 95 °C gedurende 15 minuten, gevolgd door 40 cycli van denaturatie bij 94 °C gedurende 15 s, gloeien bij 55 °C gedurende 30 s, en verlenging bij 70 °C gedurende 30 s.
  7. Analyseer de qRT-PCR-gegevens met behulp van de software van het real-time PCR-instrument. Controleer op niet-specifieke reacties. Analyseer de dissociatiecurve of de smeltcurve om te bevestigen dat er geen andere versterking heeft plaatsgevonden dan de bedoelde.
    1. Normaliseer het expressieniveau van doelmiRNA's naar RNU-6 als een endogene controle. Bereken het relatieve expressieniveau van doelmiRNA's met behulp van de 2-ΔΔCT-methode 11.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier werd het miRNA-expressieprofiel in AKI-muizen onderzocht. Het miRNA-expressieprofiel is onderzocht in verschillende organen en weefsels bij muizen. MiRNA's zijn belangrijke post-transcriptionele regulatoren en worden nu uitgebreid bestudeerd bij de karakterisering van een verscheidenheid aan ziekten, waaronder AKI. MiRNA's hebben het potentieel om pathologische aandoeningen op te helderen en te worden toegepast op de behandeling van AKI12. De belangrijkste oo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van het protocol dat in dit manuscript wordt gepresenteerd, werden miRNA's uit de nier van IRI-muizen met succes gezuiverd en gedetecteerd met behulp van qRT-PCR. Kritieke punten van de IRI-inducerende procedure in het protocol zijn onder meer een zorgvuldige monitoring van de lichaamstemperatuur en anesthesieconcentraties, waarvan bekend is dat ze van invloed zijn op AKI20. De kracht van dit protocol is dat het visuele bevestiging mogelijk maakt of isc...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflicten hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken Nam Nguyen, PhD voor het bewerken van een concept van dit manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Bent Tip Tapered Tweezers without HookNatsume SeisakushoMA-47
Buffer RLTQiagen79216wash buffer 1
Buffer RWTQiagen1067933wash buffer 2
C57B6 muizenSLCnot assign
tang met tandenNatsume SeisakushoMA-49
tang zonder tandenNatsume SeisakushoMA-48-1
Hemostatische clipsNatsume SeisakushoKN−353
MicroAmp Optical 96-well reactieplaat voor qRT-PCRThermo Fisher Scientific431681396-well reactieplaat
MicroAmp Optical kleeffilmThermo Fisher Scientific4311971kleeffilm voor 96-well reactieplaat
miRNA-132-3p primerQiagenMS000034585'UAACAGUCUACAGCCAUGGUCG
miRNA-17-5p primerQiagenMS000292745'CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG
miRNA-18a-5p primerQiagenMS000315145'UAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUAG
miRNA-212-3p primerQiagenMS000038155'UAACAGUCUCCAGUCACGGCC
miRNA-21a-5p primerQiagenMS000090795'UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA
miRNA-223-3p primerQiagenMS000038715'UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA
miRNA-574-5p primerQiagenMS000436175'UGAGUGUGUGUGUGUGAGUGUGU
miRNeasy Mini kitQiagen217004op silica-membraan gebaseerde spinkolom
miScript II RT kitQiagen218161
miScript SYBR Green PCR kitQiagen218073
QIA shredderQiagen79654biopolymeer-snippersysteem in een microcentrifuge-spinkolom
QIAzol Lysis ReagentQiagen79306op fenol/guanidine gebaseerd lysisreagens
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR systeemThermo Fisher Scientific4472380real-time PCR instrument
QuantStudio 12K Flex Software versie 1.2.1.Thermo Fisher Scientific4472380real-time PCR instrument software
RNU6-2 primerQiagenMS00033740niet bekend gemaakt
chirurgische schaarNatsume SeisakushoB-2
Vascular clip applierVITALITEC1621420

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kelly, K. J. Acute renal failure: much more than a kidney disease. Seminas in Nephrology. 26 (2), 105-113 (2006).
  2. Saikumar, J., Ramachandran, K., Vaidya, V. S. Noninvasive micromarkers. Clinical Chemistry. 60 (9), 1158-1173 (2014).
  3. Beermann, J., Piccoli, M. T., Viereck, J., Thum, T. Non-coding RNAs in Development and Disease: Background, Mechanisms, and Therapeutic Approaches. Physiological Reviews. 96 (4), 1297-1325 (2016).
  4. Yang, G., et al. Discovery and validation of extracellular/circulating microRNAs during idiopathic pulmonary fibrosis disease progression. Gene. 562 (1), 138-144 (2015).
  5. Zhang, T., et al. Circulating miR-126 is a potential biomarker to predict the onset of type 2 diabetes mellitus in susceptible individuals. Biochemical and Biophysical Research Communications. 463 (1-2), 60-63 (2015).
  6. Zhong, X., et al. miR-21 is a key therapeutic target for renal injury in a mouse model of type 2 diabetes. Diabetologia. 56 (3), 663-674 (2013).
  7. Wang, J., et al. Downregulation of urinary cell-free microRNA-214 as a diagnostic and prognostic biomarker in bladder cancer. Journal of Surgical Oncology. 111 (8), 992-999 (2015).
  8. Morishita, Y., et al. MicroRNA expression profiling in peritoneal fibrosis. Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinial Medicine. 169, 47-66 (2016).
  9. Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. BioTechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
  10. Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
  11. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
  12. Jonas, S., Izaurralde, E. Towards a molecular understanding of microRNA-mediated gene silencing. Nature Reviews. Genetics. 16 (7), 421-433 (2015).
  13. Ichii, O., Horino, T. MicroRNAs associated with the development of kidney diseases in humans and animals. Journal of Toxicologic Pathology. 31 (1), 23-34 (2018).
  14. Ma, L., et al. Changes of miRNA-17-5p, miRNA-21 and miRNA-106a level during rat kidney ischemia-reperfusion injury. Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 95 (19), 1488-1492 (2015).
  15. Saikumar, J., et al. Expression, circulation, and excretion profile of microRNA-21, -155, and -18a following acute kidney injury. Toxicological Sciences: an Official Journal of the Society of Toxicology. 129 (2), 256-267 (2012).
  16. Li, Y. F., et al. MicroRNA-21 in the pathogenesis of acute kidney injury. Protein & Cell. 4 (11), 813-819 (2013).
  17. Zhou, J., Chen, H., Fan, Y. Systematic analysis of the expression profile of non-coding RNAs involved in ischemia/reperfusion-induced acute kidney injury in mice using RNA sequencing. Oncotarget. 8 (59), 100196-100215 (2017).
  18. Liu, Y., et al. MicroRNA expression profile by next-generation sequencing in a novel rat model of contrast-induced acute kidney injury. Annals of Translational Medicine. 7 (8), 178(2019).
  19. Colbert, J. F., et al. A model-specific role of microRNA-223 as a mediator of kidney injury during experimental sepsis. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 313 (2), 553-559 (2017).
  20. Delbridge, M. S., Shrestha, B. M., Raftery, A. T., El Nahas, A. M., Haylor, J. L. The effect of body temperature in a rat model of renal ischemia-reperfusion injury. Transplantation Proceedings. 39 (10), 2983-2985 (2007).
  21. Dallas, P. B., et al. Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR -- how well do they correlate. BMC Genomics. 6, 59(2005).
  22. Rockett, J. C., Hellmann, G. M. Confirming microarray data--is it really necessary. Genomics. 83 (4), 541-549 (2004).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

MicroRNA zuiveringqRT PCR detectieacute nierschadeRNA isolatiecDNA synthesekwantitatieve PCRnierschismemodelbiomarkerdetectiemicroRNA kwantificering

Gerelateerde artikelen