Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Macro-reologie Karakterisering van Gill Raker Mucus in de Zilverkarper, Hypophthalmichthys molitrix

2.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61379

⸱

10 juli 2020

 ,  , 
1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, The George Washington University

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol presenteert een methode om reologiekarakterisering uit te voeren van slijm dat zich op kieuwharken (GR's) van de zilverkarper bevindt. Visco-elastische kenmerken van GR-slijm, verkregen door het meten van viscositeit, opslag en verliesmodulus, worden geëvalueerd voor de schijnbare opbrengstspanning om het filtertoevoermechanisme in GR's te begrijpen.

Samenvatting

De zilverkarper, Hypophthalmichthys molitrix, is een invasieve planktivische filtervoedervis die de natuurlijke waterwegen van het stroomgebied van de bovenste Mississippi heeft aangetast vanwege het zeer efficiënte filtertoevoermechanisme. De karakteristieke organen genaamd gill rakers (GR's), gevonden in veel van dergelijke filtervoeders, vergemakkelijken de efficiënte filtratie van voedseldeeltjes zoals fytoplankton die een paar micron groot zijn.

De motivatie om de reologie van het GR-slijm te onderzoeken komt voort uit onze wens om de rol ervan te begrijpen bij het helpen van het filtervoedingsproces in de zilverkarper. De slijmrijke vloeistof, in een 'dikke en kleverige' toestand, kan de hechting van voedseldeeltjes vergemakkelijken. De permeatie en het transport door het GR-membraan worden vergemakkelijkt door de werking van externe schuifkrachten die verschillende afschuifspanningen veroorzaken. Daarom kan slijmreologie een vitale aanwijzing geven voor de enorme uitconcurrerende aard van de zilverkarper in de poel van filtervoedende vissen. Op basis hiervan werd geponeerd dat GR-slijm een klevende functie kan hebben voor voedseldeeltjes en kan fungeren als een transportvoertuig om te helpen bij het filtertoevoerproces.

Het belangrijkste doel van het protocol is om de vloeigrens van het slijm te bepalen, toegeschreven aan de minimale schuifspanning die nodig is om de stroom te initiëren waarbij onomkeerbare plastische vervorming voor het eerst wordt waargenomen over een gestructureerd visco-elastisch materiaal. Dienovereenkomstig werden reologische eigenschappen van het GR-slijm, d.w.z. viscositeit, opslag en verliesmodulus, onderzocht op zijn niet-Newtoniaanse, afschuifverdunnende aard met behulp van een rotatiereometer.

Een protocol dat hier wordt gepresenteerd, wordt gebruikt om de reologische eigenschappen te analyseren van slijm dat wordt gewonnen uit de kieuwharken van een zilveren karper, gevist op de Hart Creek-locatie van de Missouri-rivier. Het protocol heeft tot doel een effectieve strategie te ontwikkelen voor reologisch testen en materiaalkarakterisering van slijm waarvan wordt aangenomen dat het een gestructureerd visco-elastisch materiaal is.

Inleiding

De zilverkarper, Hypophthalmichthys molitrix, is een planktivische filtervoeder en een invasieve soort die verschillende natuurlijke waterwegen in de Verenigde Staten heeft geïnfiltreerd. Deze soort werd aanvankelijk geïntroduceerd in het stroomgebied van de bovenloop van de Mississippi om algenbloei1,2,3te beheersen. De zilverkarper is een uiterst efficiënte feeder. Doorgaans variëren de deeltjesgroottes van verbruiksvoedsel van 4 tot 20 μm tot groter zoöplankton dat ongeveer 80 μm3,4,5is. Deze soort heeft andere inheemse vissen weggeconcurreerd en kan mogelijk enorme schade toebrengen aan inheemse waterwegen door de beschikbare hulpbronnen te beperken1,2,6. Filtervoedende vissen zoals de zilverkarper en de grootkopkarper vormen dus een grote bedreiging voor de Grote Meren1,2,6,7,8.

Filtervoedende vissen bezitten speciale organen die de kieuwharken (GR's) worden genoemd met een dunne laag slijm op hun oppervlak. Deze organen verbeteren de efficiëntie van filtratie en aggregatie van kleine deeltjes uit de binnenkomende vloeistof. Het doel van het hierin gepresenteerde protocol is om de niet-Newtoniaanse, afschuifverdunnende materiaaleigenschap en opbrengstspanning van het GR-slijm verkregen van het binnenoppervlak van de kieuwharken in de zilverkarper te karakteriseren. De waarde van de vloeigrens van het GR-slijm, vastgesteld met behulp van een rotatiereometer, is van belang in dit onderzoek. De gemeten vloeigrens, ook wel de "schijnbare vloeigrens" genoemd, is afhankelijk van de testmethoden zoals steady shear rate- of dynamische oscillerendespanningstype 9,10. De afschuifverdunnende, 'opbrengst-stressvloeistof', ondergaat een overgang van vast naar vloeistofachtig gedrag bij een kritische toegepaste spanning9,11. De schijnbare vloeigrens is de minimale schuifspanning die nodig is om de stroom op gang te brengen of die waarbij onomkeerbare plastische vervorming voor het eerst wordt waargenomen wanneer het slijm overgaat van een gelachtig materiaal naar een vloeistofachtig materiaal. Dit gedrag kan worden waargenomen in gestructureerde visco-elastische materialen. De overgang van gelachtig naar vloeistofachtig gedrag van het GR-slijm omvat twee functies, d.w.z. een kleefrol om voedseldeeltjes te verzamelen en een transportvoertuigrol om te helpen bij het deeltjesafgifte- en filtratieproces. De uitgebreide functie van het slijm omvat het creëren van diffusiebarrières in ziekteresistentie en ademhaling, het bieden van gecontroleerde afgifte van voedingsfactoren, toxische componenten en uitscheiding, het creëren van metabole routes voor voeding en nestelen, helpen bij roofdierbescherming en het produceren van grenslaagmodificaties die de voortbeweging en voortstuwingsefficiëntie verbeteren12,13,14.

In tegenstelling tot eenvoudige vloeistoffen bezitten complexe vloeistoffen zoals het slijm eigenschappen die variëren met de stroomomstandigheden en vereisen aanvullende meetparameters om hun fysieke gedrag op bulkschaal te definiëren. Om de viscositeit en vloeigrens van GR-slijm te bewaken, worden reologische metingen uitgevoerd met behulp van een rotatiereometer. De rotatiereometer past een constante of oscillerende schuifspanning of spanning toe door middel van een roterende schijf in contact met het vloeistofmonster en meet de respons ervan. De redenering achter het gebruik van dit instrument en deze techniek is dat de rheometer een reeks metingen kan leveren om de materiaaleigenschappen van het GR-slijm van de zilverkarper te beschrijven, die niet alleen door viscositeit kunnen worden gedefinieerd.

Het slijm is een visco-elastisch materiaal en de mechanische reactie op een opgelegde vervorming ligt tussen die van een zuivere vaste stof (beheerst door de elasticiteitswet van Hooke) en die van een zuivere vloeistof (beheerst door de viscositeitswet van Newton)15,16. Het complexe macromoleculaire netwerk in het slijm kan zich uitrekken en heroriënteren als reactie op externe krachten of vervorming. Een rotatiereometer bestaat uit een kegelgeometrie en een Peltierplaat zoals weergegeven in figuur 1 en figuur 2 (zie tabel 1 voor instrumentatiespecificaties). Het doel van deze studie was om een protocol te ontwikkelen om de reologische eigenschappen van het GR-slijm te bepalen. Een voordeel van de rotatiereometer ten opzichte van een viscometer is de mogelijkheid om dynamische metingen uit te voeren met behulp van kleine monstervolumes. Het GR-slijmmonstervolume in deze studie was ongeveer 1,4 ml. De viscometer daarentegen is beperkt tot constante afschuifsnelheden en vereist grote monstervolumes.

De reologische eigenschappen van het slijm zullen naar verwachting sterk variëren binnen de anatomie van de zilverkarper. De eigenschappen van het slijm dat zich op de GR-oppervlakken bevindt, kunnen bijvoorbeeld verschillen van het epibranchiale orgaan. Om rekening te houden met de potentiële variabiliteit van slijmeigenschappen in verschillende regio's van de vis, werd het verkregen GR-slijmmonster verdund en werden oplossingen van drie concentraties gemaakt en getest met behulp van de rotatiereometer. De gegevens en resultaten met betrekking tot slijmreologie die na het uitvoeren van het protocol werden gerapporteerd, toonden de werkzaamheid van de meettechniek aan. De illustratieve gegevens die in dit artikel worden gepresenteerd, zijn niet bedoeld om te worden gegeneraliseerd over de hele zilverkarperpopulatie. Het protocol dat hierin wordt gepresenteerd, kan worden uitgebreid om slijmreologie te onderzoeken over grotere steekproefsets om andere hypothesen te testen.

Het doel van deze studie is om de variatie van reologische eigenschappen van GR-slijmreologie aan te tonen met drie verschillende slijmconcentraties (400 mg / ml, 200 mg / ml en 100 mg / ml). De concentratie van 400 mg / ml vertegenwoordigt het ruwe slijmmonster dat is geoogst van de vis-GRs. Gedeioniseerd water (DI) werd gebruikt om het ruwe slijmmonster te verdunnen tot concentraties van 200 mg / ml en 100 mg / ml. Het verdunnen van de slijmmonsters maakte de evaluatie mogelijk van de mate van afschuifverdunning en schijnbare opbrengststress als functie van de concentratie en de bepaling van de concentratie waarbij het GR-slijm overgaat in niet-Newtoniaans gedrag. Een shaker werd gebruikt om grote klonten slijm in de monsters af te breken om fouten in de reologische gegevens als gevolg van inhomogeniteit te verminderen.

Bij de meeste gewervelde dieren, inclusief vissen, zijn de overheersende slijmvormende macromoleculen glycoproteïnen (mucines) die de neiging hebben om in water op te zwellen door verstrengelingen of chemische cross-linking en een gelachtig materiaal te creëren12,13,17,18,19,20. De hoogmoleculaire, gelvormende macromoleculen en het hoge watergehalte weerspiegelen de gladheid in het slijm13. Een hoge mate van inter-macromoleculaire interacties leidt tot gelvorming, terwijl lagere niveaus van inter-macromoleculaire interacties of verbroken bindingen resulteren in vloeistoffen met een hoge viscositeit21.

De processen van voedseldeeltjesfiltratie in filtervoedende vissen worden geholpen door GR-slijmgerelateerde eigenschappen zoals cohesie en viscositeit die het potentieel voor hechting en kleefkracht bepalen22. De sterkte van op slijm gebaseerde adhesie hangt af van specifieke intermoleculaire, elektrostatische of hydrofobe interacties23. Sanderson et al.24 voerden een suspensievoedingsstudie uit bij zwartvissen waarin ze het bewijs vonden voor op slijm gebaseerde adhesie. Ze verklaarden dat de hechting van gesuspendeerde voedseldeeltjes met een slijmvliesoppervlak wordt gevolgd door het transport van geaggregeerde klonten deeltjes die samen met slijm zijn gebonden door gerichte waterstroom die erop inwerkt24. Het slijm dat wordt blootgesteld aan schuifspanningen die worden gegenereerd door waterstroom vergemakkelijkt de levering van voedseldeeltjes aan spijsverteringsorganen. Endoscopische technieken werden gebruikt om gefilterde deeltjes te observeren24.

Literatuur over het bereik van schuifsnelheden en praktische limieten bij het reologisch testen van GR-slijm is schaars. Daarom werd begeleiding gezocht bij reologische studies over maag-, neus-, cervix- en longslijm, zalmhuidslijm, hagfish-slijm en botgewricht oppervlaktesmeermiddel waarin de reologische karakterisering en niet-Newtoniaanse kenmerken werden bestudeerd11,12,25,26,27,28,29,30,31. Meer recent is het effect van vishuidslijm op de voortbeweging en de stuwende efficiëntie bestudeerd met behulp van viscometrie met constante schuifsnelheid. Huidslijmreologiestudies (zonder enige verdunning of homogenisatie) met betrekking tot zeebrasem, zeebaars en mager vertoonden niet-Newtoniaans gedrag bij typisch lage afschuifsnelheden14.  In een andere gerelateerde studie bleken de ruwe huidslijmmonsters van dorsale en ventrale zijden van de Senegalese tong niet-Newtoniaans gedrag te vertonen, wat wijst op een hogere viscositeit van het ventrale slijm bij alle afschuifsnelheden die als32worden beschouwd . Andere reologische protocollen met betrekking tot de ontwikkeling van de hydrogelsteiger en voor sterk geconcentreerde suspensies met behulp van een viscometer met constante schuifsnelheid zijn ook gemeld in de literatuur33,34.

In deze studie werden de GR-slijmeigenschappen onderzocht met behulp van een spanningssnelheidsgecontroleerde, rotatiereometer die op grote schaal is gebruikt in reologie-experimenten op complexe biologische vloeistoffen25. Voor Newtoniaanse vloeistoffen blijft de schijnbare viscositeit constant, is de afschuifsnelheid onafhankelijk en variëren de schuifspanningen lineair met de afschuifspanningssnelheden (Figuur 3A, B). Voor niet-Newtoniaanse vloeistoffen (zoals afschuifverdunnende vloeistoffen) is de viscositeit afhankelijk van de afschuifsnelheid of van vervormingsgeschiedenis afhankelijk(figuur 3A,B). De verliesmodulus (G") vertegenwoordigt de mate waarin het materiaal bestand is tegen de neiging om te stromen en is representatief voor de viscositeit van de vloeistof(figuur 4). De opslagmodulus (G') vertegenwoordigt de neiging van het materiaal om zijn oorspronkelijke vorm te herstellen na door spanning veroorzaakte vervorming en is gelijk aan elasticiteit (figuur 4). De fasehoek (δ) of verliestangenswaarde wordt berekend uit de inverse raaklijn van G"/G'. Het vertegenwoordigt de balans tussen energieverlies en -opslag en is ook een veel voorkomende parameter voor het karakteriseren van visco-elastische materialen (δ = 0° voor een Hookean-vaste stof; δ = 90° voor een viskeuze vloeistof; δ < 45° voor een visco-elastische vaste stof en δ > 45° voor een visco-elastische vloeistof) (Figuur 4)25. De schijnbare vloeigrens (σy) in gestructureerde vloeistoffen vertegenwoordigt een verandering van toestand die kan worden waargenomen in reologische gegevens van steady state sweep en dynamische stress-strain sweeps10. Als de externe uitgeoefende spanning minder is dan de schijnbare vloeigrens, zal het materiaal elastisch vervormen. Wanneer de spanning de schijnbare vloeigrens overschrijdt (gemarkeerd als "gemiddelde spanning" in figuur 3B),zal het materiaal overgaan van elastische naar plastische vervorming en beginnen te stromen in zijn vloeibare toestand35. Het meten van de opslagmodulus (G') en verliesmodulus (G") in het slijmmonster onder oscillerende spanning (of spanning) omstandigheden kwantificeert de verandering in de materiaaltoestand van gelachtig naar visco-elastisch vloeistofachtig gedrag.

De soorten reometertests die worden uitgevoerd om gegevens met betrekking tot opslagmodulus (G), verliesmodulus (G") en schijnbare viscositeit (η) te bewaken, worden hier beschreven. De dynamische oscillatietests (rekvegen en frequentievegen) bewaakten G' en G" onder gecontroleerde oscillatie van kegelgeometrie. De dynamische spanningsvegens bepaalden het lineaire visco-elastische gebied (LVR) van het slijm door de intrinsieke materiaalrespons te monitoren(figuur 4). Rekvegen werden gebruikt om het vloeigedrag bij constante oscillatiefrequentie en temperatuur te bepalen. De dynamische frequentieveegtests bewaakten de materiaalrespons op toenemende frequentie (vervormingssnelheid) bij een constante amplitude (spanning of spanning) en temperatuur. De spanning werd gehandhaafd in het lineaire visco-elastische gebied (LVR) voor de dynamische frequentieveegtests. De steady-state shear rate tests bewaakten de schijnbare viscositeit (η) onder constante rotatie van de kegelgeometrie. Het GR-slijm werd onderworpen aan incrementele spanningsstappen en de schijnbare viscositeit (η, Pa.s) werd gecontroleerd op variërende afschuifsnelheid (ý, 1/s).

Het protocol dat in dit artikel wordt gepresenteerd, behandelt het GR-slijm als een complex gestructureerd materiaal van onbekende visco-elasticiteit met een bepaald lineair visco-elastisch responsbereik. Het visslijm werd gewonnen uit de GRs van de zilverkarper tijdens een visexpeditie op de Hart Creek-locatie in de Missouri-rivier door professor L. Patricia Hernandez (Department of Biological Sciences, The George Washington University) 1,2,36.  Een reeks GRs in de mond van een zilverkarper wordt weergegeven in figuur 5A en een schematische tekening wordt weergegeven in figuur 5B. Een weggesneden GR is weergegeven in figuur 5C.  De extractie van slijm uit GR's van de zilverkarper wordt als voorbeeld gepresenteerd in de schematische tekeningen, Figuur 5D, E. Alle reometertests werden uitgevoerd bij een constante, gecontroleerde temperatuur van 22 ± 0,002 °C, de temperatuur geregistreerd op de visplaats1,2,36.  Elk slijmmonster werd drie keer getest met de reometer en de gemiddelde resultaten worden samen met de statistische foutbalken gepresenteerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Bereiding van de slijmoplossingen van verschillende concentraties

OPMERKING: Drie concentraties van de slijmoplossing (400 mg / ml, 200 mg / ml en 100 mg / ml met geschatte volumes, respectievelijk 1 ml, 1 ml en 2 ml) worden voorbereid voor dit experiment.

  1. Om de massa van het slijm te berekenen, meet u de gemiddelde massa van de injectieflacons met (Mmet-slijm ; mg) en zonder slijm (Minjectieflacons ; mg). Trek vervolgens de massa van de injectieflacons af met slijm met die zonder slijm (Mslijm = M metslijm - Minjectieflacons ; mg).
  2. Verdun het slijm in drie concentraties (400, 200, 100, mg / ml) met gedeioniseerd (DI) water.
    1. Bereid de eerste concentratie van de slijmoplossing, 400 mg / ml door 0,6 ml DI-water aan het slijm toe te voegen met behulp van een micropipette.
      OPMERKING: Aangezien het geschatte volume van het geëxtraheerde slijm 1,4 ml was, heeft de oplossing van 400 mg / ml een totaal volume van ~ 2 ml.
    2. Plaats de injectieflacon met 400 mg/ml slijmoplossing op een shaker om ervoor te zorgen dat de slijmoplossing voldoende is gehomogeniseerd en dat eventuele agglomeratie van slijmdeeltjes wordt beperkt.
    3. Bereid de tweede concentratie van de slijmoplossing, 200 mg/ml, door de helft van het volume van de slijmoplossing met de eerste concentratie in een nieuwe injectieflacon te dompelen met behulp van een micropipette en 1 ml DI-water aan de nieuwe injectieflacon toe te voegen.
    4. Herhaal stap 1.2.2 voor de eerste en tweede injectieflacon met slijmoplossingen.
    5. Bereid de derde concentratie van de slijmoplossing, 100 mg/ml, door de helft van het volume (1 ml) van de 200 mg/ml oplossing in een nieuwe injectieflacon te dompelen met behulp van een micropipette en di-water toe te voegen aan de nieuwe injectieflacon.
    6. Herhaal stap 1.2.2 voor alle drie de concentraties slijmoplossingen in hun respectieve injectieflacons (zie aanvullende figuur 1).
    7. Bewaar de injectieflacons met slijmoplossing in de koelkast totdat de reometerkalibratie en -tests zijn uitgevoerd.

2. Metingen en data-acquisitie met behulp van een rheometer

OPMERKING: De software die in dit protocol wordt gebruikt voor instrumentcontrole en gegevensverzameling met rheometer wordt vermeld in de tabel met materialen. Deze software wordt 'reometerinstrumentbesturingssoftware' genoemd.

  1. Stel het reometerinstrument in en kalibreer het.
    1. Schakel de persluchttoevoer naar de reometer in en zorg ervoor dat de pneumatische tafel en de reometer met behulp van een bellenmeter worden genivelleerd. Draai de beschermkap van de rheometeras af en houd de as stil tijdens het losdraaien.
    2. Schakel de hoofdschakelaars van de reometer in om de magnetische lagers op de reometer te activeren.
    3. Schakel de reometerbesturingscomputer in met de besturingssoftware van het reometerinstrument erin geïnstalleerd en start de regelsoftware van het reometerinstrument (zie aanvullende figuur 2).
    4. Voer instrumentkalibratie uit door de tabbladen'Kalibratie | Instrument' vanuit het softwarevenster. Kies de optie'Instrument'. Klik op'Kalibreren'onder'Traagheid'. Noteer de traagheidskalibratiewaarde van het instrument in μN.m.s2 en herhaal de kalibratie ten minste 3x om ervoor te zorgen dat de kalibratiewaarden zich binnen 10% van elkaar bevinden (zie aanvullende figuur 3).
  2. Installeer de rheometergeometrie op de as van de rheometer.
    1. Klik op het tabblad'Geometrieën'in de regelbesturingssoftware van het reometerinstrument.
    2. Reinig de kegel met de gewenste geometrie (40 mm diameter, 1◦ 0' 11'' kegel) en Peltierplaat met isopropanol (zie tabel 1, tabel met materialen, figuur 1en figuur 2).
      OPMERKING: De Peltier Plate wordt geïnstalleerd op de reometer; het kan worden gereinigd met isopropanol terwijl het direct aan de reometer is bevestigd.
    3. Zorg ervoor dat de Peltier plaatbevestiging vrij is van zichtbaar stof en reinig, indien nodig, met isopropanol. Installeer de Peltier-plaat als deze niet vooraf in de reometer is geïnstalleerd en sluit de koellichaamaansluitingen aan.
    4. Druk op de'Vergrendelknop'op de rheometer op de vergrendelingsas die is verbonden met de kegelgeometrie. Dit arresteert de positie van de as, maar deze kan vrij draaien op de positie.
    5. Klik op'Smart Swap | Ingeschakeld' in het tabblad regelsoftware van het reometerinstrument om automatische detectie van de geometrie mogelijk te maken (zie aanvullende figuur 4).
    6. Draai de as bovenop de rheometer om de geometrie vast te schroeven. De software detecteert in dit stadium de geometrie van de kegelhoek van 40 mm,1 ◦ 0'11'' (zie tabel 1 en materiaaltabel).
    7. Herhaal stap 2.2.5 – 2.2.6 om ervoor te zorgen dat de geometrie wordt gedetecteerd.
    8. Selecteer'Gap'onder het'Control Panel'van de reometerinstrumentbesturingssoftware, klik op het pictogram'Opties'en kies de optie'Axial Force'. Stel de axiale kracht in op '1 Newton'; dit is om ervoor te zorgen dat de kegelgeometrie de Peltier-plaat raakt voor nulspleetinitialisatie (zie aanvullende figuur 5).
  3. Voer de kalibratie van de geometrie van de reometer uit.
    1. Selecteer het tabblad'Geometrie'in het softwarevenster. Klik op'Kalibreren'onder'Traagheid'. Noteer de geometrie traagheidskalibratiewaarde in μN.m.s2 en herhaal dit 2-3 keer om ervoor te zorgen dat de kalibratiewaarden binnen 10% van elkaar liggen.
    2. Klik op'Kalibreren'onder'Wrijving'in het softwarevenster. Noteer de geometriewrijvingskalibratiewaarde in μN.m/rad/s) en herhaal dit 2-3 keer om ervoor te zorgen dat de kalibratiewaarden zich binnen 10% van elkaar bevinden (zie aanvullende figuur 6).
  4. De zero-gap initialisatie uitvoeren
    OPMERKING: Aangezien de geometrie niet nauwkeurig boven de Peltier-plaat kan worden geheven om metingen uit te voeren zonder een referentiepositie "nul", wordt initialisatie met nulspleet uitgevoerd. Voor de meetdoeleinden heeft de geometrie een ingebouwde geometriespleet van 24 μm en een trimspleet van 28 μm. De trimspleet is ingesteld om de overtollige vloeistof die buiten het oppervlak van de geometrie kan morsen, effectief te reinigen. Deze hiaten zijn noodzakelijk voor het nauwkeurig meten van gegevens met behulp van het monster en de reometer. Stap 2.4.1 is absoluut vereist om ervoor te zorgen dat de geometrie is ingesteld op nul opening voor het bereiken van de geometrie en trim openingen van respectievelijk 24 μm en 28 μm.
    1. Klik op het pictogram'Nulkloof'onder het tabblad'Kloof'in het'Configuratiescherm'in het softwarevenster. De initialisatie is voltooid wanneer de axiale kracht die door de geometrie wordt ervaren groter is dan of gelijk is aan 1 N, omdat deze de Peltier-plaat raakt. Zorg ervoor dat de rheometerkloof op nul is gezet, zodat de referentiepositie nauwkeurig is (zie aanvullende figuur 7 en aanvullende figuur 8).
    2. Druk op de knoppen'omhoog en omlaag'op het reometerinstrument of op de pictogrammen'Geometrie verhogen en verlagen'onder het tabblad'Gap'in de regelsoftware van het reometerinstrument om de geometrie tot een willekeurige hoogte te verhogen. Het bedieningsscherm op het reometerinstrument en het bedieningspaneel van de regelsoftware van het reometerinstrument geven de (dezelfde) spleethoogte weer.
  5. Stel de experimentele procedure in de regelsoftware van het reometerinstrument in. Voer de karakterisering van reologische eigenschappen uit met behulp van een kegel-op-Peltier plaatgeometrie bij 22 °C.
    OPMERKING: De website van de US Geological Survey werd gebruikt om de rivierwatertemperatuur van de rivier vast te stellen op 20 september 2018, toen de zilverkarpers die werden gebruikt voor de GR-slijmexperimenten werden bevist op de Hart Creek-locatie36. De temperatuur van het slijm kan de reologische eigenschappen beïnvloeden. Het belang van het aanpassen van de waarden aan de riviertemperatuur is om ongeveer overeen te komen met de temperatuur waaronder de slijmeigenschappen realistisch kunnen worden geschat.
    1. Selecteer het tabblad'Experimenten'in de regelsoftware van het reometerinstrument en vul de relevante informatie in zoals'Naam','Operator','Project'enz.  (zie aanvullende figuur 9)
    2. Selecteer het tabblad'Geometrie'en zorg ervoor dat de informatie overeenkomt met stap 2.2.5. - 2.2.7. (zie aanvullende figuur 10).
    3. Selecteer het tabblad'Procedure'en gebruik de pijltjestoetsen die zijn ingesteld op de procedure'1: Oscillation Amplitude'. (zie aanvullende figuur 11).
    4. Initialiseer de instellingen voor'Omgevingscontrole'als volgt: 'Temperatuur = 22 °C'; 'Soak Time = 120 s' en vink het vakje 'Wait for Temperature' aan (zie aanvullende figuur 11).
    5. Initialiseer de instellingen van'Testparameters'als volgt: 'Frequentie = 1 Hz'; stel 'Logaritmische sweep' in; "Koppel = 10 tot 10000 μN.m"; "Punten per decennium = 5" (zie aanvullende figuur 11).
  6. Het experiment opzetten om het lineaire visco-elastische bereik (LVR) van het slijm met een bekende concentratie (100 mg / ml) te bepalen
    1. Trek met behulp van een geschikte micropipette en pipetpunt ongeveer 0,3 ml visslijmoplossing met een concentratie van 100 mg /ml (zie stap 1.2, Materiaaltabel).
    2. Introduceer de slijmoplossing op de Peltier-plaat met behulp van de micropipette (zie figuur 2).
    3. Druk op de knop'Trim Gap'op de rheometer om de geometrie op de Peltier-plaat te verlagen. U kunt ook op het pictogram'Trim Gap'klikken onder het tabblad'Gap'in de optie'Configuratiescherm'in de bedieningssoftware van het reometerinstrument (zie aanvullende figuur 12).
    4. Gebruik de micropipette met de pipetpunt om overtollig slijmoplossing te verwijderen en ervoor te zorgen dat de vloeistof zich onder de geometrie bevindt zonder morsen in de buurt van de omrand van de geometrie.
      OPMERKING: Onjuiste belasting van de vloeistof zal leiden tot fouten in de metingen. Ondergevuld monster zal de koppelverdeling verlagen en overgevuld monster zal leiden tot foutieve spanningsverdelingen als gevolg van morsen langs de randen.
    5. Selecteer afwisselend de tabbladen'Motor'en'Snelheid'tot 5 rad/s en 0 rad/s, totdat er minimale traagheid en snelheid is in het monster onder de geometrie. Het bedieningsscherm op het reometerinstrument en het bedieningspaneel van de regelsoftware van het reometerinstrument geven de snelheid weer (zie aanvullende figuur 13).
    6. Druk op de knop'Geometry Gap'op de rheometer om de geometrie te verlagen tot de vooraf ingestelde geschikte opening per specifieke geometrie. U kunt ook op het pictogram'Geometry Gap'onder het tabblad'Gap'klikken in de optie'Configuratiescherm'in de regelsoftware van het reometerinstrument (zie aanvullende figuur 14).
  7. Voer het experiment uit om het lineaire visco-elastische bereik (LVR) van het slijm van de bekende concentratie (100 mg / ml) te bepalen.
    1. Klik op het pictogram'Start'op de bedieningssoftware van het reometerinstrument (zie aanvullende figuur 15).
      OPMERKING: De rheometer voert automatische metingen uit; zodra de knop'Start'is ingedrukt, duurt het ongeveer 20 minuten voor de rheometer om de test te voltooien. De instelling 'Punten per decennium' in stap 2.5.5 bepaalt hoeveel tijd de reometer nodig heeft om metingen uit te voeren.
    2. Voer het experiment uit door op'Ja'te klikken in het pop-upvenster dat verschijnt en stelt voor dat de geometriekloof wordt verlaagd tot de juiste afstand om het experiment te starten, indien nog niet verlaagd.
    3. Observeer de real-time plot gegenereerd door de rheometer die de opslag (G') en verlies (G'') moduli rapporteert.
      OPMERKING: De G' en G" zijn respectievelijk de opslag- en verliesmodulus. De opslagmodulus vertegenwoordigt de neiging van het materiaal om zijn oorspronkelijke vorm te herstellen na door spanning veroorzaakte vervorming en is gelijk aan elasticiteit. De verliesmodulus vertegenwoordigt de mate waarin het materiaal bestand is tegen de neiging om te stromen en is representatief voor de viscositeit van de vloeistof (zie figuur 4).
    4. Stel de X-as van de plot in op'Oscillation strain percentage'. Klik hiervoor met de rechtermuisknop op de gepresenteerde grafiek en kies hettabblad 'Grafiekvariabelen' (zie Aanvullende figuur 16).
    5. Noteer het oscillatiebelastingspercentagebereik van de plot voordat materiaal het niet-lineaire visco-elastische bereik betreedt, zodra de test is voltooid.
    6. Druk op deknoppen 'omhoog en omlaag'op het reometerinstrument of op de pictogrammen'Geometrie verhogen en verlagen'onder het tabblad'Gap'in de regelsoftware van het reometerinstrument om de geometrie tot een willekeurige hoogte boven de Peltier-plaat te verhogen.
    7. Sla het bestand dat zowel de experimentele procedure als de resultaten bevat op in het oorspronkelijke bestandsformaat van de reometerinstrumentbesturingssoftware om het lineaire visco-elastische gebied (LVR) van het slijmmonster te bepalen.
      OPMERKING: Dit kan worden gedaan door de X-as van de plot in te stellen op rekamplitude (%) en/of oscillatiespanning figure-protocol-1 voordat de gegevens het niet-lineaire visco-elastische gebied (NLVR) binnenkomen (zie aanvullende figuur 16).
  8. Voer de dynamische sweeps en steady state shear rate flow-tests uit in Linear Viscoelastic Range (LVR) voor het slijm met een bekende concentratie 100, mg / ml om resultaten te genereren van drie onafhankelijke slijmmonsters van 100 mg / ml. Voer deze stappen afzonderlijk uit op de beschikbare slijmconcentratiemonsters.
    1. Herhaal stap 2.5.1 – 2.5.4.
    2. Initialiseer de instellingen van'Testparameters'als volgt: 'Frequentie = 1 Hz'; stel 'Logaritmische sweep' in; "Stam % = 100 tot 10000 %; 'Punten per decennium = 10'.
    3. Selecteer het tabblad'Procedure'en gebruik de pijltoetsen die zijn ingesteld op de procedure '2: Oscillation Frequency'.
    4. Initialiseer de instellingen voor'Omgevingscontrole'als volgt: 'Temperatuur = 22 °C'; 'Soak Time = 0,0 s'.
    5. Initialiseer de instellingen van'Testparameters'als volgt: 'Stam % = 1 %'; stel 'Logaritmische sweep' in; "Frequentie = 20 tot 1 Hz"; 'Punten per decennium = 10'.
    6. Selecteer het tabblad'Procedure'en gebruik de pijltoetsen die zijn ingesteld op de procedure '3: Flow Sweep'.
    7. Initialiseer de instellingen voor'Omgevingscontrole'als volgt: 'Temperatuur = 22 °C'; 'Soak Time = 0,0 s'.
    8. Initialiseer de instellingen van'Testparameters'als volgt: 'Schuifsnelheid = 1 tot 10000 1/s'; 'Punten per decennium = 10'; selectievakje 'Steady state sensing'.
    9. Herhaal stap 2.7.1 tot en met 2.7.2 en wacht tot het experiment is voltooid, ongeveer 45 minuten.
    10. Druk op deknoppen 'omhoog en omlaag'op het reometerinstrument of op de pictogrammen 'geometrie verhogen en verlagen' onder het tabblad 'Gap' in de besturingssoftware van het reometerinstrument om de geometrie naar een willekeurige hoogte te verhogen.
    11. Gebruik wegwerpdoekjes en handschoenen om het slijm op de Peltier-plaat te verwijderen en schoon te maken met isopropanoloplossing (zie Tabel met materialen).
    12. Sla het bestand op dat zowel de experimentele procedure als de resultaten bevat in het oorspronkelijke bestandsformaat van de rheometerinstrumentbesturingssoftware.

3. Herhaal het protocol voor andere concentraties slijmoplossingen van 200 mg/ml en 400 mg/ml.

  1. Voer stappen 2.5 – 2.8 uit inclusief alle daarin vermelde substappen voor de resterende twee concentraties slijmoplossingen, 200 mg / ml en 400 mg / ml.

4. Grafische weergave en data-analyse

OPMERKING: De code in het aanvullende codebestand voert gegevensmiddeling uit en genereert herhaalbaarheidsfouten, overlays de gegevens van alle experimenten. De standaardafwijkingsberekeningsfuncties zijn niet beschikbaar in de regelsoftware van het reometerinstrument. De code is geschreven in een programmeertaal voor data-analyse, nabewerking en grafische weergave (zie Tabel met materialen voor details).

  1. Exporteer gegevens gegenereerd uit stap 2.8 met betrekking tot de 100 mg / ml GR slijmconcentratie en stap 3.1 met betrekking tot de 200 mg / ml en 400 mg / ml GR slijmconcentraties in spreadsheetformaat door op het tabblad'Bestand | | exporteren Excel' in de regelbesturingssoftware van het reometerinstrument (zie aanvullende figuur 17).
  2. Voer aanvullende codes uit om plots van schijnbare viscositeit (η) te genereren voor variërende afschuifspanningssnelheden ( figure-protocol-2 ) en verliesmodulus (G), opslagmodulus (G') en fasehoek (δ) voor variërende oscillatiespanning ( figure-protocol-3 ) en representatieve resultaten te genereren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In deze sectie presenteren we de resultaten van de experimenten met GR-slijm met behulp van een rotatiereometer met een kegelgeometrie (40 mm diameter, 1° 0' 11'') en een Peltierplaat. De experimenten hielpen bij het karakteriseren van het niet-Newtoniaanse, afschuifverdunnende gedrag van het GR-slijm en de schijnbare opbrengstspanning die de slijmovergang van een gelachtig materiaal naar een vloeistofachtig materiaal weergeeft. De representatieve resultaten omvatten kwantitatieve beschrijvingen van lage koppelgrenzen en...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Een van de belangrijkste doelstellingen van de ontwikkeling van dit protocol is om vast te stellen dat het zeer geschikt is voor reologische karakterisering van GR-slijm wanneer zeer kleine monstervolumes beschikbaar zijn. We erkennen dat er meer monsters van een school zilverkarpers nodig zijn om de reologische eigenschappen van het GR-slijm volledig te karakteriseren en de hierin gepresenteerde gegevens zijn geen generalisatie over de hele zilverkarperpopulatie. Onze techniek is gerechtvaardigd vanwege de werkzaamheid ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen belangenconflicten aangegeven.

Dankbetuigingen

De auteurs erkennen de steun en financiering van het GW Center for Biomimetics and Bioinspired Engineering. We bedanken professor L. Patricia Hernandez van de afdeling Biologische Wetenschappen van de George Washington University voor het inspireren van het onderzoek en de voortdurende samenwerking, het bieden van biologische expertise over de fysiologie van de zilverkarper en het verstrekken van de slijmmonsters. Wij danken de studenten, de heer David Palumbo, mevrouw Carly Cohen, de heer Isaac Finberg, de heer Dominick Petrosino, de heer Alexis Renderos, mevrouw Priscilla Varghese, de heer Carter Tegen en de heer Raghav Pajjur voor hulp in het laboratorium en de heer Thomas Evans en de heer James Thomas van TA Instruments, New Castle, DE voor ondersteuning bij het trainen en onderhouden van de reometer. Beelden voor figuren 5A,C werden genomen tijdens een dissectie uitgevoerd door professor L. Patricia Hernandez van de afdeling Biologische Wetenschappen van de George Washington University.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Materialen
Kim WipesVWR470224-038Om het monster van de plaat te reinigen
HandschoenenVWR89428-750Om besmetting van het monster te voorkomen
PipetVWR89079-974Om het monster van de flacon naar de reometer te vervoeren
PipetpuntenThermo Scientific72830-042Om het monster van de flacon naar de reometer te vervoeren
SchudderaarVWR89032-094Om het slijmmonster homogeen te mengen
FlessenVWR66008-750Bevat gemeten monstersvolumes
WeegschaalOhausScout –SPX BalancesOm de massa van de slijmmonsters te wegen
Chemische reagentia
Gedeïoniseerd Water (H20)--Vloeistof
Steriel 70% Isopropanol (C3H8O)VWR89108-162Vloeistof
GR Slijm
100 mg/mL concentratie, 2mL--Visco-elastisch materiaal
400 mg/mL concentratie, 1mL--Visco-elastisch materiaal
200 mg/mL concentratie, 1mL--Visco-elastisch materiaal
Software
MATLABMathworksR2017aData-analyse, nabewerking en grafische weergave
TriosTA Instrumentsv4.5.042498Reometer instrumentbesturings- en analysesoftware

Referenties

  1. Cohen, K. E., Hernandez, L. P. The complex trophic anatomy of silver carp, Hypophthalmichthys molitrix, highlighting a novel type of epibranchial organ. Journal of Morphology. 279, 1615-1628 (2018).
  2. Cohen, K. E., Hernandez, L. P. Making a master filterer: Ontogeny of specialized filtering plates in silver carp (Hypophthalmichthys molitrix). Journal of Morphology. 279, 925-935 (2018).
  3. Cremer, M., Smitherman, R. Food habits and growth of silver and bighead carp in cages and ponds. Aquaculture. 20 (1), 57-64 (1980).
  4. Battonyai, I., et al. Relationship between gill raker morphology and feeding habits of hybrid bigheaded carps (Hypophthalmichthys spp.). Knowledge and Management of Aquatic Ecosystems. 416, 36(2015).
  5. Zhou, Q., Xie, P., Xu, J., Ke, Z., Guo, L. Growth and food availability of silver and bighead carps: Evidence from stable isotope and gut content analysis. Aquaculture Research. 40 (14), 1616-1625 (2009).
  6. Freedman, J. A., Butler, S. E., Wahl, D. H. Impacts of invasive Asian carps on native food webs (Final Report). , University of Illinois, Kaskaskia Biological Station. Urbana-Champaign, IL. (2012).
  7. Nico, L., Fuller, P., Li, J. Silver carp (Hypophthalmichthys molitrix)-FactSheet. , (2017).
  8. Walleser, L., Howard, D., Sandheinrich, M., Gaikowski, M., Amberg, J. Confocal microscopy as a useful approach to describe gill rakers of Asian species of carp and native filter-feeding fishes of the upper Mississippi River system. Journal of Fish Biology. 85 (5), 1777-1784 (2014).
  9. Nelson, A. Z., Ewoldt, R. H. Design of yield-stress fluids: a rheology-to-structure inverse problem. Soft Matter. 13, 7578-7594 (2017).
  10. Chen, T. Rheological Techniques for Yield Stress Analysis. TA Instruments Applications Note, RH025. , (2020).
  11. Ewoldt, R. H., Johnston, M. T., Caretta, L. M. Experimental challenges of shear rheology: how to avoid bad data. Complex Fluids in Biological Systems. Spagnolie, S. , Springer. (2015).
  12. Thornton, D. J., Sheehan, J. K. From Mucins to Mucus: Toward a more coherent understanding of this essential barrier. Proceedings of the American Thoracic Society. 1, 54-61 (2004).
  13. Shepard, K. L. Functions for fish mucus. Reviews in Fish Biology and Fisheries. 4, 401-429 (1994).
  14. Fernández-Alacid, L., et al. Skin mucus metabolites in response to physiological challenges: A valuable non-invasive method to study teleost marine species. Science of the Total Environment. 644, 1323-1335 (2018).
  15. Wagner, C. E., Wheeler, K. M., Ribbeck, K. Mucins and Their Role in Shaping the Functions of Mucus Barriers. Annual Reviews in Cell and Developmental Biology. 34, 189-215 (2018).
  16. Bird, R. B., Armstrong, R. C., Hassager, O. Dynamics of Polymeric Liquids, Volume 1: Fluid Mechanics. , Wiley. New York. 1255-1284 (1987).
  17. Mantle, M., Allen, A. Isolation and characterisation of the native glycoprotein from pig small intestinal mucus. Biochemical Journal. 195, 267-275 (1981).
  18. Allen, A., Hutton, D. A., Pearson, J. P., Sellers, L. A. Mucus glycoprotein structure, gel formation and gastrointestinal mucus function. Mucus and Mucosa (Ciba Foundation Symposium). Nugent, J., O'Conner, M. , Pitman. London. 137-156 (1984).
  19. Asakawa, M. Histochemical studies of the mucus on the epidermis of eel, Anguillajaponica. Bulletin of Japanese Society of Scientific Fisheries. 36, 83-87 (1970).
  20. Fletcher, T. C., Jones, R., Reid, L. Identification of glycoproteins in goblet cells of epidermis and gill of plaice (Pleuroneces platessa L.), flounder (Platichthys flesus (L.)) and rainbow trout (Salmo gairdneri Richardson). Histochemical Journal. 8, 597-608 (1976).
  21. Silberberg, A. Mucus glycoprotein, its biophysical and gel forming properties. Symposia of the Society for Experimental Biology. 43, 43-64 (1989).
  22. Hills, B. The Biology of Surfactants. , Cambridge Univ. Press. Cambridge. 408(1988).
  23. Aubert, H., Brook, A. J., Shephard, K. L. Measurement of the adhesion of a desmid to a substrate. British Phycology Journal. 24, 293-295 (1989).
  24. Sanderson, S. L., Cech, J. J., Patterson, M. R. Fluid dynamics in suspension feeding black fish. Science. 251, 1346-1348 (1991).
  25. Lai, S. K., Wang, Y. Y., Wirtz, D., Hanes, J. Micro- and macrorheology of mucus. Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (2), 86-100 (2009).
  26. Chaudhary, G., Ewoldt, R. H., Thiffeault, J. L. Unravelling hagfish slime. Journal of Royal Society Interface. 16 (150), 20180710(2019).
  27. Downing, S., Salo, W., Spitzer, R., Koch, E. The hagfish slime gland: a model system for studying the biology of mucus. Science. 214, 1143-1145 (1981).
  28. Hwang, S. H., Litt, M., Forsman, W. C. Rheological properties of mucus. Rheologica Acta. 8, 438-448 (1969).
  29. Litt, M. Mucus rheology. Archives of Internal Medicine. 126, 417-423 (1970).
  30. Quarishi, M. S., Jones, N. S., Mason, J. The rheology of nasal mucus: a review. Clinical Otolaryngology. 23, 403-413 (1998).
  31. Nordgård, C. T., Draget, K. I., Seternes, T. Rheology of salmon skin mucus. Annual Transactions - The Nordic Rheology Society. 23, 175-179 (2015).
  32. Fernández-Alacid, L., et al. Comparison between properties of dorsal and ventral skin mucus in Senegalese sole: Response to an acute stress. Aquaculture. 513, 734410(2019).
  33. Yüce, C., Willenbacher, N. Challenges in Rheological Characterization of Highly Concentrated Suspensions - Case Study for Screen-printing Silver Pastes. Journal of Visualized Experiments. (122), e55377(2017).
  34. Sultan, S., Mathew, A. P. 3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds. J. Vis. Exp. (146), (2019).
  35. Barnes, H. A., Hutton, J. F., Walters, K. An Introduction to Rheology. , Elsevier. Amsterdam. (1989).
  36. National Water Information System. USGS Current Conditions for USGS 06910450 Missouri River at Jefferson City, MO. U.S. Geological Survey. , Available from: https://nwis.waterdata.usgs.gov/usa/nwis/uv/?cb_00010=on&cb_00060=on&cb_00065=on&format=gif_default&site_no=0691045&p09-19&end_date=2018-09-21 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Reologische karakteriseringniet Newtoniaanse vloeistoffenschatting van de vloeigrensrotatierheometerviscoelastische eigenschappenshear thinning gedragoscillatieamplitudeflow sweep procedureschijnbare viscositeit
Macro-reologie Karakterisering van Gill Raker Mucus in de Zilverkarper, Hypophthalmichthys molitrix
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.