Methodenartikel

Isolatie van L-vormige bacteriën uit urine met behulp van filtratiemethode

3.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61380

⸱

13 juni 2020

 ,  , 
1Centre for Bacterial Cell Biology, Biosciences Institute, Medical School, Newcastle University

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van L-vormige bacteriën uit urine, met behulp van een filtratiemethode. Aanvullende methoden voor de bereiding van L-vormmedium, observatie van L-vormen door fasecontrastmicroscopie en inductie van L-vormen onder laboratoriumomstandigheden worden ook beschreven.

Samenvatting

Aangenomen wordt dat de overgang van bacteriën naar de L-vormtoestand een mogelijke rol speelt bij het ontwijken van het immuunsysteem en bacteriële persistentie tijdens de behandeling met celwandgerichte antibiotica. Het isoleren en hanteren van L-vormige bacteriën is echter een uitdaging, voornamelijk vanwege hun hoge gevoeligheid voor veranderingen in osmolariteit. Hier beschrijven we gedetailleerde protocollen voor de bereiding van L-vormig medium, isolatie van L-vormen uit urine met behulp van een filtratiemethode, detectie van L-vormen in urinemonsters door fasecontrastmicroscopie en inductie van L-vormen in vitro. De exacte vereisten voor overleving en groei van L-vormen kunnen variëren van soort tot soort. Daarom zijn de hier gepresenteerde methoden bedoeld als basisrichtlijnen voor het opstellen van L-vormprotocollen binnen individuele laboratoria, in plaats van als nauwkeurige instructies. De filtratiemethode kan leiden tot een vermindering van het aantal L-vormen in een monster en mag niet worden gebruikt voor kwantificering. Het is echter de enige methode die tot nu toe is gebruikt voor een effectieve scheiding van celwanddeficiënte varianten van hun ommuurde tegenhangers en voor de identificatie van bacteriestammen die in staat zijn tot L-vormomschakeling bij patiënten met urineweginfecties. De filtratiemethode heeft het potentieel om te worden aangepast voor de isolatie van L-vormen uit patiënten met andere categorieën bacteriële infecties en uit omgevingsmonsters.

Inleiding

Vrijwel alle bacteriën zijn omgeven door een structuur die de celwand wordt genoemd. De muur is belangrijk voor de bescherming tegen omgevingsstress, helpt bij regelmatige deling en geeft bacteriën hun vorm1. De wand is echter ook een doelwit voor delen van het immuunsysteem en enkele van de beste en meest gebruikte antibiotica, waaronder penicilline 2,3. Ondanks het belang ervan kunnen zowel Gram-positieve als Gram-negatieve bacteriën af en toe overleven zonder de wand 4,5,6,7,8. Als de omgevingsomstandigheden voldoende osmoprotectie bieden om te voorkomen dat ze barsten en er ook celwandgerichte middelen aanwezig zijn, kunnen bacteriën overgaan in een wandloze toestand, ook wel een L-vorm 4,5,6,7,8 genoemd.

Talrijke rapporten geven aan dat het overschakelen naar een L-vormige toestand en terug naar een ommuurde toestand in vivo belangrijk kan zijn als een mechanisme voor bacteriën om zowel de aanval van het immuunsysteem van de gastheer als de behandeling met celwandgerichte antibioticate overleven 9,10,11,12,13,14,15. Een dergelijke overgang biedt mogelijk een krachtige strategie voor de herhaling van bacteriële infectie 9,10,11,12,13,14,15. Inzicht in de basisbiologie van L-vormige bacteriën en hun interacties met de gastheer is van cruciaal belang om hun rol in de pathogenese te ontcijferen. Het omgaan met L-vormige bacteriën is echter een uitdaging.

Ten eerste zijn L-vormige bacteriën, vanwege het ontbreken van de celwand, vatbaar voor barsten als reactie op veranderingen in osmolariteit. Bovendien delen L-vormen zich op een zeer onregelmatige manier, hebben ze onvoorspelbare groeipatronen (meestal veel langzamer dan hun ommuurde tegenhangers) en, afhankelijk van de soort, kunnen ze zich beter voortplanten op halfvloeibare dan op vaste of vloeibare media. Al deze overwegingen maken het moeilijk om groeipercentages te kwantificeren en te vergelijken. Verschillende bacteriesoorten (of zelfs stammen) hebben verschillende metabolische vereisten voor L-vormomschakeling en groei. L-vormen van bepaalde Gram-positieve bacteriën, die afhankelijk zijn van aërobe ademhaling, zijn bijvoorbeeld gevoeliger voor reactieve zuurstofsoorten dan hun ommuurde tegenhangers16.

Inductie van L-vormen onder laboratoriumomstandigheden en in de gastheer wordt meestal aangedreven door celwandgerichte middelen, zoals antibiotica en lysozym9. Een dergelijke behandeling kan resulteren in slechts een gedeeltelijk verlies van de celwand en daarom kunnen er enkele ommuurde (of gedeeltelijk omwandige) bacteriën in de monsters aanwezig zijn, waardoor het moeilijk is om te onderscheiden of waargenomen experimentele resultaten te wijten zijn aan de aanwezigheid van L-vormen of ommuurde vormen van bacteriën. De frequentie van in vivo geïnduceerde L-vormen is meestal laag, wat betekent dat ze moeilijk te vinden en te isoleren kunnen zijn. Ten slotte kunnen L-vormen, vanwege hun polymorfe morfologie, in situ gemakkelijk worden verward met structuren van eukaryote oorsprong, zoals apoptotische lichamen of verschillende korrels.

Sinds hun ontdekking in 193517 zijn er verschillende methoden ontwikkeld om L-vormen in het laboratorium te hanteren. De meeste hiervan zijn afhankelijk van de toevoeging van een osmoprotectief middel aan het groeimedium; meestal een suiker of een zout 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Zoals hierboven vermeld, komen L-vormen vaak zij aan zij voor met ommuurde bacteriën in patiëntenmonsters en kan het moeilijk zijn om de twee populaties te scheiden. Het is echter aangetoond dat L-vormen, in tegenstelling tot ommuurde bacteriën, door een filter van 0,45 μm kunnen gaan vanwege hun flexibiliteit en variabele afmetingen. Een methode met behulp van een dergelijk filter is gebruikt om L-vormen uit urine te isoleren 10,19,20,21.

Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van L-vormige bacteriën uit urine, met behulp van een filtratiemethode (Figuur 1). Aanvullende protocollen voor de bereiding van L-vormmedium, microscopische waarneming van L-vormen en inductie van L-vormen in vitro worden ook beschreven.

Protocol

1. Bereiding van L-form medium (LM)

  1. Weeg sucrose (hoeveelheid aangepast om een eindconcentratie van 0,58 M te bereiken), MgSO4 (eindconcentratie 8 mM) en hersenhartinfusie (BHI) (hoeveelheid aanbevolen door de leverancier) af in een glazen fles die tweemaal zo groot is als het gewenste volume medium. Weeg voor de bereiding van 0,5 l van het medium 100 g sacharose, 1 g MgSO4 en 18,5 g BHI af en doe dit in een glazen fles van 1 l. Dit zorgt ervoor dat de ingrediënten gemakkelijker kunnen worden geresuspendeerd voordat ze worden geautoclaveerd.
  2. Als vaste of halfvaste media nodig zijn, voeg dan een gewenste hoeveelheid agar toe. Voeg voor vaste media 5 g agar toe om een uiteindelijke concentratie van 1% in 0,5 l medium te verkrijgen. Voeg voor halfvaste media 1 g agar toe om een uiteindelijke concentratie van 0,2% in 0,5 l medium te verkrijgen.
  3. Vul aan met gedeïoniseerd (DI) water tot het uiteindelijke gewenste volume.
  4. Sluit de fles en meng goed door te schudden. Het is niet nodig om de ingrediënten volledig opnieuw te suspenderen, zorg er wel voor dat ze niet samenklonteren op de bodem van de fles. Maak de dop los en autoclaaf op een cyclus voor gevoelige media (115 °C gedurende 15 min). Het wordt aanbevolen om de ingrediënten vóór het autoclaveren te mengen en een cyclus van gevoelige media te gebruiken om klonteren van de ingrediënten en karamellisatie van sucrose te voorkomen.
  5. Onderzoek het medium visueel na het autoclaveren. Er mogen geen klontjes aanwezig zijn en het medium moet amberkleurig zijn (figuur 2A).
  6. Laat het medium na het autoclaveren afkoelen tot een temperatuur waarbij de fles comfortabel in de hand kan worden gehouden.
  7. Als het medium nodig is voor de inductie van L-vormen, voeg dan op dit punt een antibioticum en/of een lyticum toe (bijvoorbeeld fosfomycine in een eindconcentratie van 400 μg/ml, penicilline G in 200 μg/ml, D-cycloserine in 400 μg/ml, ampicilline bij 100 μg/ml, moenomycine bij 50 μg/ml, lysozym bij 100 μg/ml of lysostaphine bij 5 μg/ml). Bepaal empirisch het type L-vorm-inducerend middel (of middelen als er meer dan één nodig is) en de concentratie ervan voor elk van de geteste bacteriesoorten.
  8. Draag handschoenen om individuele aliquots te bereiden en werk in een microbiologische veiligheidskast of gebruik een bunsenbrander. Het medium kan gedurende langere tijd moeten worden geïncubeerd en steriliteit is van het grootste belang.
    1. Om aliquots van vast medium te bereiden, brengt u 25 ml over op individuele petrischaaltjes van 92/16 mm en laat u ze opstijven. Het wordt aanbevolen om een pipettor te gebruiken in plaats van platen rechtstreeks te gieten om het risico op besmetting te verkleinen. Droog de platen niet te droog.
    2. Om halfvloeibare aliquots te bereiden, brengt u 5 ml medium over in meerdere universele polystyreencontainers van 30 ml met behulp van een pipettor en laat u ze opstijven.
  9. Gebruik de media onmiddellijk of bewaar ze voor gebruik maximaal een week bij 4 °C. Controleer de aanbevelingen van de fabrikant voordat u een medium met antibiotica opbergt, aangezien de concentratie kan afnemen omdat de verbinding na verloop van tijd verslechtert.

2. Isolatie van L-vormen uit urine

OPMERKING: Draag handschoenen en een laboratoriumjas tijdens de laboratoriumprocedures. Werk in een microbiologische veiligheidskast of gebruik een bunsenbrander. Draag veiligheidsbrillen tijdens het filteren.

  1. Veeg ten minste 1 uur voor de voorspelde aankomst van de urinemonsters het werkgebied af met 70% ethanol en vermeld het vereiste aantal halfvloeibare LM-mediumaliquots.
    OPMERKING: Een suspensie van E. coli ST14410 L-vormen geïnduceerd in het laboratorium in vloeibaar LM-medium, in plaats van menselijke urinemonsters, zal worden gebruikt om het protocol te demonstreren.
  2. Veeg het werkgebied opnieuw af met 70% ethanol voordat u de monsters verwerkt. Leg aan de ene kant van de bank het gewenste aantal afgesneden filters van 0,45 μl, spuiten van 20 ml en verschillende lege steriele universele containers van 30 ml polystyreen die gelijk zijn aan het aantal monsters. Voeg meerdere reservefilters toe bovenop het aantal verwachte urinemonsters, voor het geval er meer dan één filter nodig is om sommige monsters te verwerken. Plaats de LM middelgrote aliquots en lege steriele universele containers van 30 ml polystyreen in een stabiel rek in het midden van de bank. Als microscopisch onderzoek parallel moet worden uitgevoerd, maak dan ook glazen microscoopglaasjes, dekglaasjes van 22 x 22 mm, pipetten van 2 μl en 1 ml, steriele tips van 10 μl en 1 ml en steriel buisjes van 1,5 ml klaar en zorg ervoor dat er een bankmicrocentrifuge beschikbaar is.
  3. Transporteer urinemonsters van de donor naar het laboratorium zo snel mogelijk na donatie, om mogelijke verslechtering van de L-vormige bacteriën in het monster te voorkomen.
  4. Trek handschoenen en een veiligheidsbril aan, verwijder de urinemonsters uit de veiligheidszak, besproei ze met ethanol, veeg ze af en plaats ze in het rek, in de buurt van de LM medium aliquots en steriele reserve 30 ml polystyreencontainers. Verwerk vanaf dit punt één monster tegelijk.
  5. Draai de doppen los van een tube met LM-medium, een reserve polystyreen universele container en een tube met urine.
  6. Haal de spuit uit de verpakking, verwijder de zuiger en plaats deze rechts van u.
  7. Trek het veiligheidspapier uit de achterkant van de filterverpakking en bevestig de spuit stevig aan het filter (houd het filter met de voorkant naar beneden in de plastic houder van de individuele fabrikant om er zeker van te zijn dat het steriel blijft).
  8. Ga snel maar voorzichtig te werk, verwijder de dop van de tube LM-medium en gooi deze weg en plaats het filter met de spuit op de buis.
  9. Verwijder de dop van het urinemonster en giet voorzichtig ~10 ml in de spuit (slechts 2 ml wordt gefilterd, maar overtollig volume voorkomt spatten), zorg ervoor dat er meer dan 1 ml overblijft voor een microscopisch onderzoek. Er wordt slechts 0,5 ml gebruikt, maar het is onpraktisch om een dergelijk volume nauwkeurig te meten tijdens het uitvoeren van filtratie, daarom wordt een geschat overtollig volume behouden.
  10. Plaats de zuiger heel voorzichtig in de achterkant van de spuit. Een kleine hoeveelheid weerstand kan worden gevoeld voordat de zuiger in een volledig operationele positie wordt geplaatst en het is gemakkelijk om het monster voorbij dit punt te morsen. Oefen meerdere keren met het gebruik van water voordat u urinemonsters verwerkt.
  11. Druk voorzichtig op de zuiger en laat 2 ml urine door het filter lopen totdat u een toenemende weerstand voelt. Zorg ervoor dat u niet te veel druk uitoefent om te voorkomen dat het monster overloopt en het filter breekt. Als het monster bijzonder dicht is en te veel weerstand genereert, haal het monster dan door meerdere filters in plaats van het door één filter te persen.
  12. Tik het filter voorzichtig tegen de buis met LM-media om het resterende gefilterde monster los te maken, til het filter en de spuit op en plaats snel de dop van de reserve universele polystyreencontainer van 30 ml op de buis met LM-medium en gefilterde urine, zorg ervoor dat u de binnenkant van de buis niet aanraakt met de rand van de dop. Gooi het filter, de spuit en de reservecontainer van polystyreen veilig weg.
  13. Incubeer de monsters in een stationaire positie bij 30 °C gedurende maximaal 1 maand. Hierdoor kunnen L-vormen die door het filter zijn gegaan, hun wanden regenereren en beginnen te groeien als ommuurde bacteriën.
  14. Observeer de monsters elke dag op tekenen van groei en houd de buisjes met gefilterde monsters tegen een lichtbron. Voor positieve monsters treedt de groei meestal binnen 3 tot 7 dagen op.
  15. Zodra de groei is gedetecteerd, brengt u het monster over naar een microbiologische veiligheidskast of in de buurt van een bunsenbrander. Open het monster en dompel het voorzichtig in een plastic lus van 5 μl, gericht op het groeigebied, en streep de monsters vervolgens op standaard vast BHI-medium zonder osmoprotectie, met als doel enkele kolonies22 te verkrijgen.
  16. Onderzoek tegelijkertijd een kleine hoeveelheid van het monster, samen met een fractie halfvloeibaar medium (~5 μL), microscopisch zoals beschreven in stap 3. Door het monster samen met het medium op een microscopisch objectglaasje over te brengen, worden alle L-vormen die nog in het monster aanwezig zijn, niet gebarsten en kunnen worden gedetecteerd. Er wordt echter verwacht dat de meerderheid van de bacteriën op dit punt is teruggekeerd naar ommuurde vormen en verschijnen als gewone staafjes of kokken.
  17. Incubeer de monsters op de BHI-platen een nacht in een stationaire positie bij 37 °C.
  18. Onderzoek op tekenen van groei, kies een enkele kolonie van elke plaat met behulp van een lus van 5 μL en inoculeer in 5 ml vloeibare BHI. Incubeer een nacht bij 37 °C en schud.
  19. Gebruik de nachtculturen om glycerolvoorraden te bereiden of om DNA te isoleren voor soortidentificatie met behulp van een voorkeursmethode (bijv. Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit).

3. Onderzoek van urinemonsters op de aanwezigheid van L-vormen door middel van fasecontrastmicroscopie

  1. Doe de resterende 0,5 ml urinemonster in een microcentrifugebuisje en draai gedurende 1 minuut op 8.000 x g in een bankmicrocentrifuge.
  2. Verwijder voorzichtig het supernatant, laat ongeveer 20 μl achter en suspendeer de pellet opnieuw door 3 keer voorzichtig op en neer te pipetteren.
  3. Plaats 1 μl op een glazen microscoopglaasje en dek af met een dekglaasje van 22 x 22 mm (gebruik voor het onderzoeken van een monster van 5 μl (zie stap 2.16) een dekglaasje van 22 x 50 mm om er zeker van te zijn dat het dekglaasje goed aan het objectglaasje hecht). Druk voorzichtig op het dekglaasje met een steriel wattenschijfje om een afdichting te creëren en om te controleren of het dekglaasje niet kan bewegen. Gooi het wattenschijfje weg.
  4. Onderzoek het objectglaasje met een microscoop die is uitgerust met een 100x fasecontrastobjectief op de aanwezigheid van L-vormachtige structuren (Figuur 3).
    OPMERKING: Om de bacteriële oorsprong van L-vormachtige structuren in patiëntmonsters te bevestigen, wordt aanbevolen de monsters te onderzoeken door middel van fluorescerende in situ hybridisatie (FISH) met behulp van oligonucleotide-sondes die specifiek zijn voor bacteriële sequenties10,23.

4. Inductie van L-vormen in vitro

  1. Streak ommuurde bacteriën naar keuze uit naar afzonderlijke kolonies22 op een plaat met niet-osmoprotectief medium (bijvoorbeeld BHI) en broed ze 's nachts stationair uit bij 37 °C.
  2. Bereid de volgende dag osmoprotectief LM-medium voor, dat L-vormige inducerende middelen naar keuze bevat, zoals beschreven in stap 1. Bereid het gewenste aantal platen voor met stevig medium.
  3. Gebruik een steriele plastic lus van 5 μL of een tandenstoker om een royale hoeveelheid (~ 4-5 kolonies) van de niet-osmoprotectieve BHI-plaat te kiezen die de avond ervoor is geïncubeerd.
  4. Streep bacteriën op de LM-plaat met behulp van het platte oppervlak van de lus (in plaats van de rand). Streep de bacteriën met één doorlopende beweging over de rand van de plaat en draai de plaat vervolgens 90°. Raak de lus aan tot aan de rand van de eerste streep en verdeel met een continue beweging de streep over een kwadrant van de plaat, waarbij de bacteriën geleidelijk worden verdund met meerdere overlappende strepen (de hele plaat kan desgewenst worden gebruikt. Als alleen een kwadrant van de plaat wordt gebruikt, kunnen andere kwadranten worden gebruikt voor meerdere inducties).
    OPMERKING: Figuur 4A geeft schematisch de richting van de strepen weer. Het doel is hier om een groeigebied te verkrijgen met zoveel mogelijk zuivere L-vormen, in plaats van enkelvoudige kolonies. Om die reden is het niet nodig om de lussen tussen de strepen te veranderen. Enkelvoudige kolonies van L-vormen kunnen erg moeilijk te verkrijgen zijn en het gebruik van een te klein aantal bacteriën kan resulteren in helemaal geen groei van de L-vorm. Aan de andere kant, als er te veel ommuurde bacteriën zijn gebruikt voor de inductie, zullen niet alle bacteriën de omschakeling ondergaan en sommige kunnen de muur nog steeds behouden. Het beste L-vormige groeigebied kan meestal in het midden van de streep worden gedetecteerd.
  5. Plaats de plaat in een plastic zak of een andere container om te voorkomen dat deze uitdroogt en incubeer bij 30 °C (L-vormen van sommige bacteriesoorten kunnen beter groeien in anaërobe omstandigheden, dus een anaërobe kamer kan worden getest op efficiëntere L-vormige groei). Onderzoek de plaat elke dag op tekenen van groei. Dit verschijnt meestal binnen 3 tot 7 dagen. De hoeveelheid groei is soortspecifiek. Een voorbeeld van L-vormige groei wordt getoond in figuur 4B.
  6. Bevestig de aanwezigheid van L-vormen met behulp van een microscoop. Plaats een druppel LM-medium van 2 μl op een microscopisch glaasje en pluk met behulp van een pipetpunt een kleine hoeveelheid cellen uit het midden van de streep en suspendeer deze opnieuw in de druppel.
    1. Dek af met een dekglaasje van 22 x 22 mm en onderzoek op de aanwezigheid van L-vormen met behulp van een microscoop met een 100x fasecontrastobjectief. Een representatief voorbeeld is te vinden in Figuur 4C.

Resultaten

L-vormige media die sucrose bevatten, kunnen na autoclaveren verschillende gradaties van karamelisatie ondergaan, wat gepaard gaat met een kleurverandering. Figuur 2 toont representatieve resultaten van autoclavermedia die sacharose bevatten. Figuur 2A toont een typisch voorbeeld van LM-medium, dat na het autoclaveren amberkleurig is geworden. Figuur 2B toont een typisch voorbeeld van 1,16 M sacharoseoplossing (2 x concentratie vereist voor het maken van LM-medium) na autoclaveren. Af en toe kan LM-medium of sucrose tijdens het autoclaveren uitgebreid karamelliseren en het wordt niet aanbevolen om het medium te gebruiken als dit gebeurt. Figuur 2C toont een voorbeeld van overgekarameliseerd sucrosemedium.

L-vormige bacteriën kunnen zeer heterogeen zijn en Figuur 3 toont voorbeelden van L-vorm-achtige structuren die waarneembaar zijn in urinemonsters van patiënten. Om de bacteriële oorsprong van de L-vormachtige structuren in urinemonsters te bevestigen, wordt FISH met fluorescerende sondes gericht op bacteriële sequenties aanbevolen10,23.

De groeiniveaus van L-vormen die onder laboratoriumomstandigheden worden geïnduceerd, zijn stamspecifiek. Figuur 4B toont een voorbeeld van de groei van de L-vorm van Bacillus subtilis en Figuur 4C toont het microscopische uiterlijk van de geïnduceerde L-vormen in Figuur 4B.

figure-results-1
Figuur 1: Isolatie van L-vormen met behulp van filtratiemethode – schematische weergave. Het urinemonster wordt door een filter van 0,45 μm in een universele container van polystyreen geleid, die osmoprotectief LM-medium bevat, aangevuld met 0,2% agar. Het monster wordt vervolgens gedurende een maand in een stationaire positie bij 30 °C geïncubeerd en dagelijks visueel gecontroleerd op tekenen van groei. Deze incubatietijd zorgt ervoor dat alle L-vormen die in het monster aanwezig zijn, hun celwanden kunnen regenereren. Zodra de groei is gedetecteerd, kunnen de bacteriën opnieuw worden gestreept op een plaat met een normaal, vast, niet-osmoprotectief medium (zoals voedingsagar of hersen-hartinfusie) om afzonderlijke kolonies te isoleren, die vervolgens kunnen worden onderworpen aan DNA-extractie en sequencing om de geïsoleerde bacteriesoorten te identificeren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: L-vorm media. (A) LM-medium na autoclaveren. (B) 1,16 M sacharose (2 x concentratie) na autoclaveren. (C) Uitgebreid gekarameliseerd LM-medium. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Voorbeelden van L-vorm-achtige structuren die waarneembaar zijn in de urine van patiënten met recidiverende urineweginfecties door fasecontrastmicroscopie. (een, b) Structuren die typisch zijn voor het delen van bacteriële L-vormen die in de urine zijn gesuspendeerd. (C,D) Structuren die typisch zijn voor het delen van bacteriële L-vormen geassocieerd met eukaryote cellen. (E,F) Halvemaanvormige structuur die kenmerkend is voor Gram-negatieve L-vormen (rode pijl). (F,G) Structuren die typisch zijn voor tussenliggende overgangsstadia tussen de ommuurde cellen en L-vormen (rode pijl in G). (H) Intracellulaire blaasjes die typisch zijn voor grote L-vormen. Schaal balk = 5 μm. Dit cijfer is gewijzigd van10. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Streepplaattechniek voor inductie van L-vormen op vaste media. (A) Schematische weergave van strepende bacteriën met behulp van een kwart plaat voor inductie van L-vormen. De pijl geeft de richting aan waarin de bacteriën moeten worden gestreept. (B) Een voorbeeld van groei in de L-vorm van Bacillus subtilis na strepen, zoals weergegeven in (A), na 3 dagen incubatie bij 30 °C. (C) L-vormen geïnduceerd in (B) gevisualiseerd door fasecontrastmicroscopie. Schaalbalk = 5 μm. Panelen B en C zijn gewijzigd van16 Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussie

Protocollen die in dit manuscript worden beschreven, zijn gebruikt om L-vormen van verschillende bacteriesoorten uit menselijke urine te isoleren en te hanteren, waaronder E. coli, Streptococcus, Staphylococcus, Klebsiella, Pseudomonas, Enterococcus en Enterobacter spp, die allemaal typisch worden geassocieerd met urineweginfecties10,24. Het is echter mogelijk dat methoden voor het omgaan met L-vormen, die in het ene laboratorium zijn vastgesteld, niet onmiddellijk werken in een ander laboratorium en wat voor de ene bacteriestam werkt, werkt mogelijk niet voor een andere. Daarom vereisen de hier beschreven protocollen waarschijnlijk meerdere pogingen en aanvullende optimalisatie. Met name de behoefte aan voedingsstoffen, de beschikbaarheid van zuurstof, de concentratie osmoprotectiven en de vloeibaarheid van het medium moeten mogelijk worden getest. De omstandigheden die optimaal zijn voor de overgang en groei van de L-vorm kunnen verschillen van de omstandigheden die optimaal zijn voor de groei van ommuurde vormen van dezelfde soort. Bovendien kunnen er verschillende technische problemen optreden bij het proberen van de protocollen.

Een veelvoorkomend probleem bij de bereiding van L-vormige media is sucrosekaramelisatie na autoclaveren. Als het medium donkerbruin van kleur wordt, moet het worden weggegooid en moet een nieuwe batch worden bereid. Het kan nodig zijn om de sucrose in water in de ene fles te bereiden en de overige ingrediënten in een andere, beide in een concentratie van 2x. 2x geconcentreerde oplossingen kunnen vervolgens na het autoclaveren in een verhouding van 1:1 worden gecombineerd om de gewenste eindconcentraties te bereiken. Sucrose die afzonderlijk is geautoclateerd, kan enigszins geel van kleur worden (Figuur 2B), wat acceptabel is, maar als het donkerbruin wordt (Figuur 2C), mag het niet worden gebruikt voor experimenten. Het kan nodig zijn om de lengte en de temperatuur van de autoclaafcyclus aan te passen om de karamelisatie van sucrose te verminderen. Aanbevolen wordt de steriliteit van de met behulp van een aangepaste autoclaafcyclus bereide media te testen door een aliquot van elk van de media gedurende ten minste 3 dagen bij 37 °C te incuberen. Ten slotte kan het nodig zijn om een alternatief osmoprotectief middel, zoals zout, te testen als het probleem met karamelisatie aanhoudt18.

Er kunnen zich ook verschillende problemen voordoen tijdens het isoleren van L-vormen uit patiëntmonsters. Zoals vermeld in het protocol, kunnen L-vormen die in de monsters aanwezig zijn, mogelijk verslechteren; Daarom is het belangrijk om de monsters zo snel mogelijk na donatie naar het laboratorium te vervoeren. Om dezelfde reden wordt het sterk afgeraden om monsters bij lage temperaturen op te slaan of de samenstelling van het monster te wijzigen (bijvoorbeeld door toevoeging van PBS).

De filtratiemethode zelf heeft zijn beperkingen. Sommige L-vormen kunnen uit elkaar worden gescheurd als gevolg van schuifkrachten die worden gegenereerd door de mediastroom door het filter. In de studie van Mickiewicz et al. ging slechts 41% van de L-vormen in controlemonsters, die laboratoriumgeïnduceerde E. coli L-vormen bevatten, door het filter10. Dit toont aan dat de filtratiemethode kan leiden tot een onderschatting van het aantal positieve monsters en niet wordt aanbevolen voor kwantitatieve studies.

In zeer zeldzame gevallen, na filtratie, kan de volgende dag een aanzienlijke groei worden waargenomen in de semi-vloeibare media aliquots die worden gebruikt voor L-vormige isolatie. Dit kan een indicatie zijn dat het filter tijdens het protocol is gebroken, waardoor ommuurde bacteriën kunnen worden doorgelaten, of dat het monster besmet was. Het is een goede gewoonte om dergelijke monsters weg te gooien of op zijn minst met de nodige voorzichtigheid te behandelen. Dagelijks visueel onderzoek van de monsters is van cruciaal belang om valse positieven te voorkomen. Voordat urinemonsters door filtratie worden verwerkt, wordt aanbevolen om verschillende monsters van laboratoriumgeïnduceerde L-vormen, ommuurde bacteriën en steriel medium door het filter van uw keuze te laten lopen, om de efficiëntie van de L-vormscheiding te controleren, mogelijke doorgang van ommuurde bacteriën als gevolg van filterbreuk en om ervoor te zorgen dat de gebruikte steriele techniek goed werkt.

In zeldzame gevallen kunnen stabiele L-vormen worden geïsoleerd door filtratie, zonder dat er ommuurde vormen kunnen worden gedetecteerd door microscopie. Om levensvatbare L-vormige bacteriën te behouden, wordt aanbevolen om verschillende "loop-fulls" van het monster over te brengen naar een buis met vers semi-vloeibaar LM-medium of om elke 3-7 dagen opnieuw te strepen op een vast osmoprotectief medium, afhankelijk van de efficiëntie van de groei. Als er na verschillende passages geen ommuurde vormen verschijnen, kan worden geprobeerd monsters in te vriezen in 40% glycerol bij -80 °C om het isolaat te bewaren; sommige L-vormen verdragen een dergelijke procedure echter niet goed.

Ondanks de beperkingen is de filtratiemethode de enige die tot nu toe is gebruikt voor de scheiding van L-vormen van ommuurde vormen in patiëntenmonsters. Het maakt de identificatie mogelijk van bacteriestammen die in staat zijn om in vivo van L-vorm te wisselen. Er is het potentieel om de filtratiemethode te ontwikkelen en aan te passen voor de isolatie van L-vormen uit andere soorten menselijke of omgevingsmonsters (bijvoorbeeld bloed of planten).

Rekening houdend met alle bovenstaande overwegingen, raden we de protocollen in dit manuscript aan als een goed startpunt voor het ontwikkelen van op maat gemaakte L-vormige protocollen in individuele laboratoria, in plaats van als rigide instructies. Werken met L-vormen vereist veel zorg, toewijding en geduld, maar met oefening kan het zeer de moeite waard zijn. We hopen dat de richtlijnen die in dit manuscript worden uiteengezet, een maatstaf zullen worden voor het ontwikkelen van L-vormprotocollen en meer fundamentele en klinische onderzoeksgroepen zullen aanmoedigen om deze fascinerende bacteriële vormen te onderzoeken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door een Europese Onderzoeksraad (subsidienummer 670980) aan Jeff Errington (directeur van The Centre for Bacterial Cell Biology, Newcastle University).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.45 µL cut off filtersSarstedt83.1826
20 mL syringesFisher17955460
30 mL polystyrene universal tubesStarlabE1412-3010
92 x 16 mm Petri DishesStarstedt82.1473
AgarOxoidLP0011
AmpicillinSigma-AldrichA9518
Brain Heart InfusionOxoidCM1135
Cover slips (22 x 22 mm, 22 x 50 mm)VWR631-0137/-0125
D-cycloserineSigma-AldrichC6880
Glass microscope slidesVWR631-1550P
LysostaphinSigma-AldrichL7386
LysozymeSigma-AldrichL4919
MgSO4VWR25165.26
MoenomycinSigma-Aldrich32404
Penicillin GSigma-Aldrich13752
PhosphomycinSigma-AldrichP5396
SucroseSigma-Aldrich84100

Referenties

  1. Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W. From the regulation of peptidoglycan synthesis to bacterial growth and morphology. Nature Reviews Microbiology. 10, 123-136 (2011).
  2. Wolf, A. J., Underhill, D. M. Peptidoglycan recognition by the innate immune system. Nature Reviews Immunology. 18, 243-254 (2018).
  3. Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Collins, J. J. How antibiotics kill bacteria: from targets to networks. Nature Reviews Microbiology. 8 (6), 423-435 (2010).
  4. Leaver, M., et al. Life without a wall or division machine in Bacillus subtilis. Nature. 457, 849-853 (2009).
  5. Mercier, R., Kawai, Y., Errington, J. General principles for the formation and proliferation of a wall-free (L-form) state in bacteria. eLife. 3, 642(2014).
  6. Cross, T., et al. Spheroplast-Mediated Carbapenem Tolerance in Gram-Negative Pathogens. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (9), 00756(2019).
  7. Ramijan, K., et al. Stress-induced formation of cell wall-deficient cells in filamentous actinomycetes. Nature Communications. 9, 5164(2018).
  8. Errington, J., et al. L-form bacteria, chronic diseases and the origins of life. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 371, 20150494(2016).
  9. Kawai, Y., Mickiewicz, K., Errington, J. Lysozyme counteracts β-Lactam antibiotics by promoting the emergence of L-form bacteria. Cell. 172, 1038-1049 (2018).
  10. Mickiewicz, K. M., et al. Possible role of L-form switching in recurrent urinary tract infection. Nature Communications. 10, 4379(2019).
  11. Domingue, G. J. Sr, Woody, H. B. Bacterial persistence and expression of disease. Clinical Microbiology Reviews. 10, 320-344 (1997).
  12. Clasener, H. Pathogenicity of the L-phase of bacteria. Annual Review of Microbiology. 26, 55-84 (1972).
  13. Onwuamaegbu, M. E., Belcher, R. A., Soare, C. Cell wall-deficient bacteria as a cause of infections: a review of the clinical significance. Journal of International Medical Research. 33, 1-20 (2005).
  14. Allan, E. J., Hoischen, C., Gumpert, J. Bacterial L-forms. Advances in Applied Microbiology. 68, 1-39 (2009).
  15. Domingue, G. J. Demystifying pleomorphic forms in persistence and expression of disease: Are they bacteria, and is peptidoglycan the solution. Discovery Medicine. 10, 234-246 (2010).
  16. Kawai, Y., et al. Crucial role for central carbon metabolism in the bacterial L-form switch and killing by β-lactam antibiotics. Nature Microbiology. 4, 1716-1726 (2019).
  17. Klieneberger, E. The natural occurrence of pleuropneumonia-like organisms in apparent symbiosis with Streptobacillus moniliformis and other bacteria. The Journal of Pathology and Bacteriology. 40, 93-105 (1935).
  18. Osawa, M., Erickson, H. P. L form bacteria growth in low-osmolality medium. Microbiology. 165 (8), 842-851 (2019).
  19. Domingue, G. J., Schlegel, J. U. The possible role of microbial L-forms in pyelonephritis. The Journal of Urology. 104, 790-798 (1970).
  20. Braude, A. I., Siemienski, J., Jacobs, I. Protoplast formation in human urine. Transactions of the Association of American Physicians. 74, 234-245 (1961).
  21. Kalmanson, G. M., Hubert, E. G., Guze, L. B. Production and therapy of Proteus mirabilis pyelonephritis in mice undergoing chronic diuresis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 9, 458-462 (1969).
  22. Sanders, E. R. Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods. Journal of Visualized Experiments. 63, e3064(2012).
  23. Takada, T., Matsumoto, K., Nomoto, K. Development of multi-color FISH method for analysis of seven Bifidobacterium species in human feces. Journal of Microbiological Methods. 58, 413-421 (2004).
  24. Drage, L. K., et al. Elevated urine IL-10 concentrations associate with Escherichia coli persistence in older patients susceptible to recurrent urinary tract infections. Immunity & Ageing. 16, 1-11 (2019).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Urine isolatiefasecontrastmicroscopieL vorm mediumosmolariteitgevoeligheidcelwanddefici ntbacteri le persistentieurineweginfectiesL vorm inductie
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen