Dit protocol beschrijft een canonieke methode om de kritische genen te begrijpen die de osteoclastenactiviteit in vivo controleren. Deze methode maakt gebruik van een transgeen muismodel en enkele canonieke technieken om skeletfenotype te analyseren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Skelet fenotype analyse van een voorwaardelijke Stat3 verwijdering muismodel
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Transgene muismodellen zijn krachtig voor het begrijpen van de kritische genen die osteoclastendifferentiatie en -activiteit beheersen, en voor het bestuderen van mechanismen en farmaceutische behandelingen van osteoporose. Cathepsine K (Ctsk)-Cre muizen zijn veel gebruikt voor functionele studies van osteoclasten. De signaaltransducer en activator van transcriptie 3 (STAT3) is relevant bij bothomeostase, maar de rol ervan bij osteoclasten in vivo blijft slecht gedefinieerd. Om het in vivo bewijs te leveren dat STAT3 deelneemt aan osteoclastendifferentiatie en botmetabolisme, hebben we een osteoclastenspecifiek Stat3-deletiemuismodel gegenereerd (Stat3 fl/fl ; Ctsk-Cre) en analyseerde zijn skeletfenotype. Micro-CT-scanning en 3D-reconstructie impliceerden een verhoogde botmassa bij de voorwaardelijke knock-outmuizen. H&E-kleuring, calceïne en alizarine rode dubbele kleuring en tartraatresistente zuurfosfatase (TRAP) kleuring werden uitgevoerd om het botmetabolisme te detecteren. Kortom, dit protocol beschrijft enkele canonieke methoden en technieken om skeletfenotype te analyseren en de kritische genen te bestuderen die de osteoclastenactiviteit in vivo controleren.
Inleiding
Skeletbot is het belangrijkste dragende orgaan van het menselijk lichaam en staat onder druk van zowel de interne als externe omgeving tijdens het lopen en sporten1. Gedurende iemands hele leven ondergaan botten voortdurend zelfvernieuwing, die wordt gecompenseerd door osteoblasten en osteoclasten. Het proces van osteoclasten die oude botten en osteoblasten die nieuw bot vormen, zuivert de homeostase en mechanische functie van het skeletsysteem2. Verstoring van het evenwicht kan botmetabole ziekten veroorzaken, zoals osteoporose. Osteoporose, die wordt veroorzaakt door overmatige osteoclastische activiteit, komt wereldwi....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle methoden met betrekking tot de hier beschreven dieren zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Shanghai Jiaotong University School of Medicine.
1. Fokken van osteoclasten specifieke Stat3 deletie muizen
OPMERKING: Stat3fl/fl muizen werden commercieel verkregen. Ctsk-Cre muizen werden geleverd door S. Kato (Universiteit van Tokio, Tokio, Japan12). De muizen werden gefokt en onderhouden onder specifieke ziekteverwekkervrije (SPF) omstandigheden in de institutionele dierenfaciliteit onder gestandaard....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Met behulp van dit protocol werden osteoclastenspecifieke Stat3-deletiemuizen gegenereerd om de invloed van STAT3-deletie op osteoclastendifferentiatie te bestuderen. Stat3Ctsk muizen en hun wildtype (WT) nestgenoten werden gefokt en gehouden na genotypering. Beenmergmafagen werden geïsoleerd en gekweekt tot osteoclasten, en STAT3-deletie bij Stat3Ctsk-muizen werd aangetoond (figuur 1).
Femora-rec.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Genetisch gemanipuleerde muismodellen worden vaak gebruikt voor het bestuderen van het mechanisme en de farmaceutische behandeling van menselijke ziekten13. Ctsk-Cre muizen zijn veel gebruikt voor functionele studies van osteoclasten6. De huidige studie beschreef de protocollen van de methoden om skeletfenotype te analyseren en de kritische genen te bestuderen die de osteoclastische activiteit in vivo controleren.
Histologische analyse i.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Dankbetuigingen
Wij danken prof. Weiguo Zou en S. Kato voor reagentia en muizen en de leden van het Zou laboratorium voor nuttige discussies. We danken ook het Laboratorium voor Gedigitaliseerde Stomatologie en Onderzoekscentrum voor Craniofaciale Anomalieën van het Shanghai Ninth People's Hospital voor hulp. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (NSFC) [81570950,81870740,81800949], Shanghai Summit & Plateau Disciplines, het SHIPM-mu fonds van het Shanghai Institute of Precision Medicine, Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine [JC201809], het Incentive Project of High-Level....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
```html
```
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 4% Paraformaldehyde oplossing | Sangon biotech Co., Ltd. | E672002 | |
| Aceton | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 80000360 | |
| Alizarine | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Ammoniak oplossing | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | ||
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Ctsk-Cre muizen | een geschenk van S. Kato, Universiteit van Tokyo, Tokyo, Japan | ||
| DDSA | Electron Microscopy Sciences | 13710 | |
| DeCa RapidlyDecalcifier | Pro-Cure | DX1100 | |
| DMP-30 | Electron Microscopy Sciences | 13600 | |
| EDTA | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 60-00-4 | |
| EMBED 812 RESIN | Electron Microscopy Sciences | 14900 | |
| fluorescentiemicroscoop | Olympus | IX73 | |
| Hematoxyline oplossing | Beyotime Biotechanology | C0107 | |
| Micro-CT | Scanco Medical AG | μCT 80 | |
| NaHCO3 | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 10018918 | |
| Neutrale balsem | Sangon biotech Co., Ltd. | E675007 | |
| NMA | Electron Microscopy Sciences | 19000 | |
| Paraffine | Sangon biotech Co., Ltd. | A601889 | |
| roterende microtoom | Leica | RM2265 | |
| Stat3fl/fl muizen | GemPharmatech Co., Ltd | D000527 | |
| TRAP kleuringskit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| XYleen | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 1330-20-7 |
Referenties
- Zaidi, M. Skeletal remodeling in health and disease. Nature Medicine. 13 (7), 791-801 (2007).
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Cummings, S. R., Melton, L. J.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
