RNA Blot Analyse voor de detectie en kwantificering van Plant MicroRNAs

Summary

Deze methode toont het gebruik van de noordelijke hybridisatie techniek om miRNAs te detecteren van de totale RNA extract.

Abstract

MicroRNAs (miRNAs) zijn een klasse van endogene uitgedrukte niet-codering, ~ 21 nt kleine RNAs die betrokken zijn bij de regulering van genexpressie in zowel planten als dieren. De meeste miRNAs fungeren als negatieve schakelaars van genexpressie gericht op belangrijke genen. In planten worden primaire miRNAs (pri-miRNAs) transcripties gegenereerd door RNA polymerase II, en ze vormen verschillende lengtes van stabiele stam-lusstructuren genaamd pre-miRNAs. Een endonuclease, Dicer-like1, verwerkt de pre-miRNAs tot miRNA-miRNA* duplexen. Een van de strengen van miRNA-miRNA* duplex wordt geselecteerd en geladen op Argonaute 1-eiwit of de homologs ervan om het decolleté van doelmrnas te bemiddelen. Hoewel miRNAs belangrijke signaalmoleculen zijn, wordt hun detectie vaak uitgevoerd door minder dan optimale PCR-gebaseerde methoden in plaats van een gevoelige noordelijke vlekanalyse. We beschrijven een eenvoudige, betrouwbare en uiterst gevoelige noordelijke methode die ideaal is voor de kwantificering van miRNA-niveaus met een zeer hoge gevoeligheid, letterlijk van elk plantweefsel. Bovendien kan deze methode worden gebruikt om de grootte, stabiliteit en de overvloed aan miRNAs en hun precursoren te bevestigen.

Introduction

De recente ontdekking van kleine regulerende RNAs, microRNAs, heeft geleid tot onderzoek in het begrijpen van hen en hun rol in planten en dieren¹. Lange voorlopers van miRNAs worden verwerkt tot 21 tot 24 nt volwassen miRNAs door HYL1 en specifieke dicer-achtige eiwitten^2,3. Een miRNA van 22 nt kan cascade-uitschakeling initiëren door secundaire siRNAs⁴te genereren. Studies hebben aangetoond dat de rol van miRNAs en secundaire siRNAs in ontwikkeling, cellot en stress reacties^5,6.

Protocol

1. Voorbereiding van een 15% denaturering polyacrylamide gel

1. Weeg en voeg 4,8 g ureum toe, voeg 3,75 mL acrylamide toe van 40% acrylamide: bisacrylamide (19:1) oplossing en 1 mL van 10x TBE pH 8.2 in een steriele 50 mL buis.
2. Los het ureum op met een waterbad van 60 °C tot een duidelijke oplossing.
3. Maak het volume op tot 10 mL met vers automatisch geautolaveerd steriel water en koel het gelmengsel af tot kamertemperatuur.
4. Bereid verse 10% (w/v) ammonium persulfate oplossing.

2. Montage van de glasplaten en elektroforese-eenheid

1. Was alle apparaten die nodig zijn voor de gel elektroforese....

Results

In deze demonstratie hebben we de expressie van miR397 ontdekt en gekwantificeerd in verschillende weefsels van indica rijst var whiteponni (figuur 1). miR397 is een 22 nt miRNA en geconserveerd miRNA. De expressie van miR397 kan worden gedetecteerd in alle geteste monsters. Volgens de volgende generatie sequencing gegevens, monster 1 (zaailing weefsel) heeft miR397 op 5 leest per miljoen (rpm). We ontdekten het signaal comfortabel, wat aangeeft dat de methode zeer gevoelig.......

Discussion

Deze methode kan op grote schaal worden gebruikt voor detectie en kwantificering van kleine RNAs, waaronder minder overvloedige miRNAs. Het protocol beschrijft voornamelijk de stappen voor het denatureren van het totale RNA in een laadbuffer, groottescheiding door gel elektroforese, overdracht van RNA naar een membraan, kruis-link het RNA op membraan en hybridiseren met behulp van de gewenste radiolabeled oligo sondes.

De cruciale stap voor elk blotting experiment is het gebruik van goede kwal.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
40% Acrylamide-bisacrylamide solution	Sigma	A9926
Ammonium persulphate (APS)	BioRad	1610700
Blotting paper	whatmann blotting paper I	1001-125
Bromophenol blue	Sigma	B5525-5G
Capillary loading tips	BioRad	2239915
Deionized formamide	Ambion	AM9342
Heating block	Eppendorff	5350
Hybond N+nylon membrane	GE	RPN203B
Hybridization bottle	Sigma	Z374792-1EA
Hybridization Oven	Thermo Scientific	1211V79
N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma	T7024-25ml
PhosphorImager	GE- Typhoon scanner	29187194
PhosphorImager screen and cassette	GE healthcare	GE28-9564-75
Pipettes	Gilson, models: P20 and P10	FA10002M, FA10003M
Plastic pipette	Falcon	357550
Polyacrylamide gel apparatus	BioRad	1658003EDU
Sephadex G-25 column	GE healthcare	27532501
Speed Vac Concentrator	Thermo Scientific	20-548-130
Spinwin	Tarsons	1010
T4 Polynucleotide Kinase (PNK)	NEB	M0201S
Transblot apparatus	BioRad	1703946
ULTRAHyb hybridization buffer	Ambion	AM8670
Urea	Fischer Scientific	15985
UV-crosslinker	UVP	CL-1000L
Vortex	Tarsons	3020
Water bath	NEOLAB	D-8810
Xylene cyanol	Sigma	X4126-10G