Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Neisseria meningitidis Infectie van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide endotheelcellen in de hersenen

2.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61400

⸱

14 juli 2020

 ,  ,  , 
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg, 2Department of Biological Sciences, University of Alabama

In dit artikel

Erratum-melding

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Samenvatting

Het hier beschreven protocol belicht de belangrijkste stappen in de differentiërende geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide hersenachtige endotheelcellen, de voorbereiding van Neisseria meningitidis voor infectie en het verzamelen van monsters voor andere moleculaire analyses.

Samenvatting

Meningokokkenmeningitis is een levensbedreigende infectie die optreedt wanneer Neisseria meningitidis (meningokokken, Nm) toegang kan krijgen tot het centrale zenuwstelsel (CZS) door zeer gespecialiseerde endotheelcellen van de hersenen (BEC's) binnen te dringen. Aangezien Nm een mensspecifieke ziekteverwekker is, maakt het gebrek aan robuuste in vivo modelsystemen de studie van de gastheer-pathogeen interacties tussen Nm en BEC's een uitdaging en stelt het vast dat er behoefte is aan een op mensen gebaseerd model dat inheemse BEC's nabootst. BEC's hebben strakkere barrière-eigenschappen in vergelijking met perifere endotheelcellen die worden gekenmerkt door complexe tight junctions en verhoogde trans-endotheliale elektrische weerstand (TEER). Veel in vitro modellen, zoals primaire BEC's en onsterfelijke BEC's, missen of verliezen echter snel hun barrière-eigenschappen na verwijdering uit de oorspronkelijke neurale micro-omgeving. Recente ontwikkelingen in menselijke stamceltechnologieën hebben methoden ontwikkeld voor het afleiden van hersenachtige endotheelcellen uit geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) die BEC's beter fenokopiëren in vergelijking met andere in vitro menselijke modellen. Het gebruik van iPSC-afgeleide BEC's (iPSC-BEC's) om Nm-BEC-interactie te modelleren, heeft het voordeel dat menselijke cellen worden gebruikt die BEC-barrière-eigenschappen bezitten, en kan worden gebruikt om barrièrevernietiging, aangeboren immuunactivering en bacteriële interactie te onderzoeken. Hier laten we zien hoe iPSC-BEC's kunnen worden afgeleid uit iPSC's, naast bacteriële voorbereiding, infectie en monsterverzameling voor analyse.

Inleiding

De bloed-hersenbarrière (BBB) en de meningeale bloed-CSF-barrière (mBCSFB) zijn extreem strakke cellulaire barrières die de bloedsomloop scheiden van het centrale zenuwstelsel (CZS) en bestaan voornamelijk uit zeer gespecialiseerde hersenendotheelcellen (BEC's)1,2. Samen handhaven BEC's een goede hersenhomeostase door voedingsstoffen en afvalproducten in en uit de hersenen te reguleren, terwijl veel gifstoffen, medicijnen en ziekteverwekkers wordenuitgesloten1,2. Bacteriële meningitis treedt op wanneer door bloed overgedragen bacteriën in staat zijn om te interageren met en door de barrière te dringen die wordt gevormd door BEC's en ontstekingen te veroorzaken. Neisseria meningitidis (Nm, meningokokken) is een Gram-negatieve bacterie die de neusdarm van 10-40% van de gezonde personen koloniseert, maar in sommige gevallen ernstige systemische ziekten kanveroorzaken3. Bij getroffen personen kan Nm toegang krijgen tot de bloedbaan, waar het purpura fulminans kan veroorzaken en BEC's kan binnendringen en toegang kan krijgen tot het CZS enmeningitis kan veroorzaken. Nm is wereldwijd een belangrijke oorzaak van bacteriële meningitis en ondanks vaccinatie-inspanningen is het nog steeds een primaire oorzaak van meningitis4. Moderne medische interventies, zoals antibioticabehandeling, hebben deze aandoeningen overleefbaar gemaakt, maar degenen die getroffen zijn door meningitis blijven vaak achter met permanente neurologische schade 5,6.

Eerdere studies hebben bacteriële factoren en gastheersignalering geïdentificeerd die bijdragen aan Nm-BEC-interacties 7,8,9,10,11. De geïdentificeerde adhesinen en invasinen zoals het opaciteitseiwit Opc en type-IV pili, evenals receptoren zoals CD147, zijn in vitro uitgevoerd op verschillende BEC-modellen, maar deze modellen missen veel bepalende BBB-eigenschappen 7,9,11,12. Volledig begrip van Nm-BEC-interacties blijft ongrijpbaar, deels vanwege het onvermogen om in vivo modellen te gebruiken, onvolledige vaccinatiebescherming en het ontbreken van robuuste menselijke BEC-modellen in vitro.

Het modelleren van hBEC's in vitro was een uitdaging vanwege de unieke eigenschappen van BEC's. Vergeleken met perifere endotheelcellen hebben BEC's een aantal fenotypes die hun barrière-eigenschappen versterken, zoals een hoge trans-endotheliale elektrische weerstand (TEER) als gevolg van complexe tight junctions12. Eenmaal verwijderd uit de micro-omgeving van de hersenen, verliezen BEC's snel hun barrière-eigenschappen, waardoor het nut van primaire of onsterfelijke in-vitromodellen die slechts een zwakke barrière vormen, wordt beperkt12,13. De combinatie van de menselijke specificiteit van Nm-infecties, het gebrek aan robuuste in vivo modellen en uitdagingen bij het modelleren van menselijke BEC's in vitro creëert een behoefte aan betere modellen om de complexe gastheer-pathogeen interactie tussen Nm en BEC's te begrijpen. Onlangs zijn met behulp van modeltechnologieën voor menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) BEC-achtige cellen afgeleid van iPSC's die BEC's beter nabootsen in vivo12,13,14,15. iPSC-BEC's zijn van menselijke oorsprong, gemakkelijk schaalbaar en bezitten verwachte BEC-fenotypes in vergelijking met hun primaire of onsterfelijke tegenhangers12,13,14,15. Bovendien hebben wij en anderen aangetoond dat iPSC-BEC's nuttig zijn voor het modelleren van verschillende ziekten van het CZS, zoals gastheer-pathogeen interactie, de ziekte van Huntington en MCT8-deficiëntie die het Allan-Hurndon-Dudley-syndroom veroorzaakt 16,17,18,19,20,21. Hier demonstreren we hoe iPSC-BEC's kunnen worden afgeleid uit hernieuwbare iPSC-bronnen en de infectie van iPSC-BEC's met Nm die leidt tot activering van de aangeboren immuunrespons. Wij zijn van mening dat dit model nuttig is om gastheer-pathogeen interactie te ondervragen die niet kan worden gerecapituleerd in andere in vitro modellen en vooral nuttig is bij het onderzoeken van interacties met mensspecifieke pathogenen zoals Nm.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Alle stappen voor de bereiding van media/reagens, het onderhoud van stamcellen en de differentiatie zijn overgenomen van Stebbins et al.22.

1. Voorbereiding van materialen die nodig zijn voor iPSC-cultuur en BEC-differentiatie.

  1. Matrixcoating van weefselkweek (TC) kunststof voor IMR90-4 iPSC-kweek
    1. Aliquot basale membraanmatrixgel (bijv. Matrigel) in aliquots van 2,5 mg en bewaren bij -20 °C.
      OPMERKING: Werk snel bij het hanteren van de matrixgel en aliquot op ijs, aangezien het een gel vormt boven 4 °C en niet kan worden gealiquoteerd als het eenmaal gestold is.
    2. Voeg voor het coaten van TC-plastic snel een aliquot matrixgel toe aan 30 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/F12-medium in een conische buis van 50 ml. Voeg 1 ml van het medium toe aan de bevroren matrixgel, pipetteer op en neer totdat het ontdooid is en breng onmiddellijk over naar de conische buis van 50 ml met het resterende medium.
    3. Gebruik 1 ml van deze matrix-gelcoatingoplossing per putje van een plaat met 6 putjes en 12 ml per T75-kolf.
      NOTITIE: Matrix gel-gecoat TC-plastic kan tot twee weken voor gebruik worden bereid. Het is echter van cruciaal belang om te voorkomen dat de matrixgeloplossing uitdroogt, waardoor af en toe meer DMEM/F12 bovenop de putjes moet worden toegevoegd.
  2. Bereid stamcelonderhoudsmedium voor door 50 ml 50x-supplement toe te voegen aan 450 ml stamcelonderhoudsbasaal medium in de steriele omgeving van een bioveiligheidskast.
    OPMERKING: Andere onderhoudsmedia voor stamcellen (mTeSR en E8) zijn gebruikt in andere onderzoeken 13,14,15, 22,23,24,25.
  3. Om 500 ml ongeconditioneerd medium (UM) te bereiden, combineert u 392,5 ml DMEM/F12 met 100 ml knock-out serumvervanging (KOSR), 5 ml niet-essentiële aminozuren, L-glutamine in een eindconcentratie van 1 mM en 3,5 μL β-mercaptoethanol. Filter en steriliseer en bewaar maximaal 2 weken bij 4 °C.
  4. Om 200 ml endotheelcelmedium (EC) plus retinoïnezuur (RA) plus bFGF te bereiden, combineert u 198 ml humaan endotheelserumvrij medium (hESFM), 2 ml filtergesteriliseerd bloedplaatjesarm afgeleid serum (PDS) en 20 ng/ml bFGF. Filter, steriliseer en bewaar maximaal 2 weken bij 4 °C. Voeg vlak voor toevoeging aan cellen 10 μM RA toe aan EC-medium.
    OPMERKING: Aangezien PDS is stopgezet en daarom beperkt kan zijn, is dit protocol met succes uitgevoerd met B27 in plaats van PDS 15,23,26.
  5. Om 200 ml EC-medium zonder RA of bFGF te bereiden, combineert u 198 ml hESFM en 2 ml filter gesteriliseerde PDS en steriliseert u het filter. Maximaal 4 weken bewaren bij 4 °C.

2. Onderhoud IMR90-4 celkweek

OPMERKING: Hier gebruiken we de IMR90-4-cellijn als voorbeeld, maar andere geïnduceerde pluripotente stamcellijnen zoals CC3, CD10, CD12, DF19-9-11T, 83iCTR, 00iCTR en CS03iCTRn2 zijn met succes gebruikt voor differentiatie in BEC's 13,14,15,16,17,23,27,28.

  1. Kweek iPSC's bij 37 °C in 5% CO 2 en blijf doorgaans op platen met 6 putjes bij verschillende dichtheden met2 ml stamcelonderhoudsmedium per putje.
  2. Voor het behoud van de iPSC-cultuur kiest u een enkele put voor doorgang die niet samenvloeit en open ruimtes tussen kolonies heeft.
    1. Zuig het kweekmedium op, voeg 1 ml niet-enzymatische celdissociatiereagens toe en incubeer gedurende 7 minuten bij 37 °C. Terwijl de incubatie aan de gang is, vervangt u de matrixgeloplossing, op een nieuwe plaat met 6 putjes, door 2 ml vers stamcelonderhoudsmedium per putje.
    2. Zuig het niet-enzymatische celdissociatiereagens voorzichtig op en zorg ervoor dat u de cellen die nog aan de plaat vastzitten niet opzuigt.
    3. Voeg 6 ml stamcelonderhoudsmedium toe en spoel de bodem van het putje een paar keer totdat alle cellen volledig zijn losgemaakt. Zaai vervolgens de nieuwe plaat met 6 putjes met verschillende dichtheden, meestal 1:6 of 1:12 voor normaal onderhoud.
      OPMERKING: Met behulp van de bovengenoemde verhoudingen worden de cellen ongeveer twee keer per week gesplitst.
    4. Verplaats de plaat naar de incubator en verdeel de gezaaide cellen gelijkmatig over de putjes door de plaat heen en weer en van links naar rechts te schudden, waarbij u tussen afwisselende schudbewegingen pauzeert totdat het medium is bezonken.

3. Differentiatie van endotheelcellen in de hersenen van menselijke iPSC's

  1. Plateren van iPSC's voor differentiatie (dag -3 van het differentiatieprotocol)
    1. Per IMR90-4 onderhoudskweekputje dat wordt gebruikt om te platen voor differentiatie, zuigt u het kweekmedium op, voegt u 1 ml enzymatische celdissociatiereagens per putje toe en incubeert u gedurende 7 minuten bij 37 °C.
    2. Inactiveer het enzymatische celdissociatiereagens door de 1 ml gedissocieerde celsuspensie over te brengen in een conische buis van 15 ml met ten minste 2 ml vers stamcelonderhoudsmedium per 1 ml cellen. Draai de celsuspensie gedurende 5 minuten rond bij 1.500 x g .
    3. Resuspendeer de celpellet in 1 ml stamcelonderhoudsmedium per putje gebruikte IMR90-4-cellen en tel de cellen met een hemocytometer.
      OPMERKING: Het kan nuttig zijn om 1:1 te verdunnen met 0,4% trypanblauw om onderscheid te maken tussen levende en dode cellen bij het tellen. Afhankelijk van de dichtheid van iPSC's levert één putje van een plaat met 6 putjes meestal 1\u20122 x 106 cellen op.
    4. Voeg voor differentiatie in een T75-kolf 7,5 x 10,5 cellen toe aan 12 ml stamcelonderhoudsmedium en ROCK-remmer (Y27632-dihydrochloride) in een eindconcentratie van 10 μM. Aspireer de matrix-gelcoatingoplossing uit een T75-kolf en breng de celsuspensie over in de kolf. Verdeel de cellen gelijkmatig door de kolf heen en weer en van links naar rechts te schudden (zie stap 2.2.4) en incubeer bij 37 °C en 5 % CO2 .
      OPMERKING: Het is van cruciaal belang om bij deze stap ROCK-remmer toe te voegen om de overleving van de gedissocieerde enkelvoudige stamcellen te verbeteren25,29. Cellen moeten gelijkmatig verdeeld zijn over de kolf en in enkeltjes die een gespreide, mesenchymale morfologie vertonen als gevolg van de behandeling met ROCK-remmers22.
  2. Verander op dag -2 en dag -1 van media naar vers stamcelonderhoudsmedium; 12 ml per T75.
  3. Begin op dag 0 met differentiatie door media te veranderen in UM; 12 ml per T75.
  4. Verander UM dagelijks (dag 1 – dag 5).
    OPMERKING: De cellen bereiken meestal confluentie na 2 tot 3 dagen in UM, wat kan worden waargenomen met het blote oog of door een omgekeerde helderveldmicroscoop. Naarmate de differentiatie vordert, worden nestin+ "neurale kanalen" zichtbaar met PECAM-1+ cellen ertussenin, zoals eerder beschreven13,14.
  5. Breid de endotheelcelpopulatie selectief uit door over te schakelen op EC-medium met 20 ng/ml bFGF en 10 μM retinoïnezuur (RA) (dag 6) en gedurende twee dagen te incuberen. EC-medium met bFGF kan tot twee weken van tevoren worden bereid. RA wordt toegevoegd uit bevroren bouillon op de dag van gebruik (bijv. 1 μL 10 mM RA-bouillon per 1 ml EC + bFGF).
    OPMERKING: Succesvolle differentiatie kan ook worden bereikt zonder suppletie van RA op dag 6 en 8. Het weglaten van RA levert echter BEC's op met verlaagde TEER12,13,14.
  6. Smeer celkweekplaten en membraaninzetstukken (bijv. Transwell) in met collageen IV en fibronectine (dag 7), voor zuivering van de BEC's en volgende experimenten.
    1. Combineer voor het coaten van membraaninzetstukken 4 delen collageen IV (1 mg/ml in 0,5 mg/ml azijnzuur), 1 deel fibronectine (1 mg/ml) en 5 delen steriel water van weefselkwaliteit. ECM-oplossing kan 1:5 worden verdund voor het coaten van celkweekplaten (d.w.z. 4 delen collageen IV, 1 deel fibronectine, 45 delen water). Incubeer gedurende een nacht met coatingoplossing bij 37 °C.
      OPMERKING: Platen en membraaninzetstukken kunnen ook gedurende ten minste 4 uur voorafgaand aan de subcultuur op dezelfde dag van de zuiveringsstap worden gecoat.
  7. Zuiver BEC's door de gedifferentieerde cellen te subcultiëren op collageen IV en met fibronectine beklede platen of membraaninzetstukken (dag 8).
    1. Zuig het EC-medium op en voeg het enzymatische celdissociatiereagens toe (12 ml per T75). Incubeer bij 37 °C totdat 90% van de cellen uit de kolf is losgekomen.
      OPMERKING: Celdissociatie kan tot 1 uur duren.
    2. Verwijder tijdens de incubatietijd de collageen IV/fibronectine-coatingoplossing van eerder voorbereide platen/inzetstukken en laat ze drogen in een steriele hoes. Het duurt ongeveer 20 minuten voordat de inzetstukken droog zijn.
    3. Zodra de cellen zijn losgekomen, spoelt u ze van de kolf met een pipet van 10 ml. Pipeteer op en neer om een eencellige suspensie te bereiken.
      OPMERKING: Eencellige suspensie is belangrijk voor een betrouwbare celtelling en om vaste monolagen te verkrijgen.
    4. Verdun met ten minste een gelijk volume vers hESFM in een conische buis van 50 ml en tel de cellen met behulp van een hemocytometer.
    5. Pellet de cellen op 1.500 x g gedurende 10 min.
    6. Resuspendeer de cellen in het juiste volume vers bereide EC + bFGF + RA om een suspensie van 2 x 106 cellen/ml te verkrijgen voor het zaaien op membraaninzetstukken. Voeg 500 μl (1 x 106 cellen) toe aan een inzetstuk met 12 putjes en 1,5 ml EC + bFGF + RA-medium aan de onderkant. Voor het zaaien op platen met 24 en 48 putjes verdunt u de celsuspensie 1:2 en voegt u respectievelijk 500 μl (5 x 10 5 cellen) en 250 μl (2,5 x 105 cellen) per putje toe. Verdeel de cellen gelijkmatig over het putje/de insert (zie stap 2.2.4) en incubeer bij 37 °C onder 5% CO2.
  8. Vervang media op platen/transwells naar EC zonder bFGF of RA (dag 9).
  9. Voer infectie-experimenten, TEER-metingen en immunofluorescentiekleuring uit zoals beschreven in de volgende secties (dag 10).
    OPMERKING: Succesvol gedifferentieerde en gezuiverde BEC's bereiken doorgaans de piek TEER op dag 10 en brengen karakteristieke markers tot expressie van endotheelcellen in de hersenen, zoals PECAM-1 (CD31) en VE-cadherine, de glucosetransporter GLUT-1, effluxtransporters zoals p-glycoproteïne en tight junction-componenten ZO-1, Occludine en Claudin-5 13,14,16,17,19,22 . Raadpleeg Lippmann et al., Stebbins et al. en anderen voor meer details en afbeeldingen van de celtypen, morfologieën en expressie van celtypespecifieke markers tijdens het differentiatieproces 13,14,15,16,17,19,22. Representatieve beelden van de IMR90-4-cellen in verschillende stadia van het BEC-differentiatieproces zijn te vinden in aanvullende figuur 1.

4. Transendotheliale elektrische weerstand (TEER) als maat voor de dichtheid van de barrière

OPMERKING: TEER wordt meestal afgelezen op membraaninzetstukken op dag 9 en 10 van differentiatie om het succesvol genereren van barrièrevormende iPSC-BEC's te bevestigen (Figuur 1A).

  1. Plaats de epitheliale volt-ohmmeter (EVOM) in de steriele omgeving van een bioveiligheidskap en sluit de elektrode aan op de EVOM.
  2. Desinfecteer de elektrode door deze gedurende ten minste 5 minuten onder te dompelen in 70% EtOH en volledig te laten drogen.
    OPMERKING: Langere incubatie in 70% EtOH of decontaminatie van de elektrode met 5% hypochlorietoplossing is mogelijk indien nodig.
  3. Haal de iPSC-BEC's op membraaninzetstukken uit de incubator en meet TEER.
    NOTITIE: Het is belangrijk om TEER snel af te lezen nadat u uit de incubator bent gehaald, aangezien temperatuurveranderingen van invloed kunnen zijn op de TEER-meting.
  4. Lees TEER af door de elektrode in het medium te dompelen, zodat de kortere elektrode bovenop het inzetstuk wordt geplaatst en de langere elektrode in het medium rond het inzetstuk reikt.
    NOTITIE: Zorg ervoor dat de elektroden aan de uiteinden van de "eetstokjes" volledig bedekt zijn met vloeistof. Kantel indien nodig de put om dit te bereiken voordat u de plaat weer neerzet om te meten.

5. Immunofluorescentie (IF)-kleuring om het BEC-fenotype te valideren

OPMERKING: Om de kwaliteit van de volledig gedifferentieerde en gezuiverde cellen te valideren, worden iPSC-BEC-monolagen gekleurd voor de karakteristieke markers van endotheelcellen in de hersenen op dag 10 van het differentiatieproces zoals eerder beschreven (Figuur 1B\u2012G) 13,14,15,16,17,19,22.

  1. Zuig het medium op en was 1x met PBS.
  2. Fixeer de cellen met ijskoude methanol gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT).
  3. 3x wassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en 1 uur blokkeren met 10% foetaal runderserum (FBS) in PBS bij RT.
  4. Aspireer en voeg primaire antilichamen toe die zijn verdund in een blokkerende oplossing. Incubeer gedurende een nacht bij 4 °C.
    OPMERKING: Raadpleeg de tabel met materialen en Stebbins et al. voor informatie met betrekking tot de bron en verdunning van de antilichamen22.
  5. Was 3x met PBS voordat u secundair antilichaam verdund in blokkerende oplossing toevoegt. Incubeer bij RT gedurende 1 uur. Bescherm monsters vanaf dit punt tegen licht.
  6. 2x wassen met PBS. Voeg vervolgens DAPI toe in een verdunning van 1:5.000 in PBS en kleur gedurende 15 minuten bij RT.
  7. Was 1x terwijl u de PBS aan laat en foto's maakt met een fluorescentiemicroscoop.

6. Bereiding van bacteriën en infectie van iPSC-BEC's

  1. Start op de dag voor het infectie-experiment (dag 9 van de differentiatie) een nachtelijke kweek van de bacteriën uit bevroren bouillon. Voor infectie met Nm, streep bacteriën op Columbia-agar met 5% schapenbloed (bloedagar). Incubeer bacterieculturen bij 37 °C en 5% CO2 's nachts.
  2. Bereid de volgende dag (dag 10) verse PPM+ door Protease pepton media (PPM) aan te vullen met 50 μL 2 M MgCl 2, 50 μL2 M NaHCO3 en 100 μL Kellogg's supplement per 10 ml. Inoculeer 10 ml PPM+ medium in een conische buis van 50 ml met Nm van de nachtelijke kweekplaat met behulp van een steriel wattenstaafje. Incubeer schudden bij 200 tpm bij 37 °C gedurende 1,5 uur (d.w.z. totdat de bacteriën zich in de logaritmische groeifase bevinden).
  3. Bereid tijdens de bacteriële incubatie iPSC-BEC's in een plaat met 24 putjes of op membraaninzetstukken voor infectie door het oude medium te vervangen door 400 μL vers EC-medium (zonder bFGF of RA) per putje/bovenkant van het membraaninzetstuk.
  4. Centrifugeer de bacteriecultuur bij 4000 x g gedurende 10 minuten en zuig de media op. Resuspendeer de bacteriekorrel in 250 μL PBS.
  5. Gebruik in 4 ml verse PBS een deel van de bacteriële celsuspensie en pas deze aan tot een OD600 van 0,4 (ongeveer 1 x 108 CFU/ml).
  6. Verdun vervolgens de bacteriën in celkweekmedium (EC-medium) volgens de gewenste multipliciteit van infectie (MOI).
    OPMERKING: Bijvoorbeeld, voor een MOI van 10, verdun 1:10 of 1:5 bij het infecteren van iPSC-BEC's in respectievelijk een plaat met 24 putjes of op membraaninzetstukken (1 x 105 cellen per monolaag in een plaat met 24 putjes). Toevoeging van humaan serum is niet opgenomen in de bereiding van Nm voor infectie, zoals beschreven in andere manuscripten, omdat werd waargenomen dat het een schadelijk effect had op het iPSC-BEC-barrièrefenotype zoals gemeten met TEER (gegevens niet getoond)30,31. De interactie van Nm en iPSC-BEC's wordt echter niet beïnvloed met of zonder humaan serum (gegevens niet getoond).
  7. Infecteer iPSC-BEC's in elk putje met 100 μL van de bereide bacteriesuspensie en incubeer gedurende de gewenste infectieduur.
    OPMERKING: De expressie van een aantal pro-inflammatoire cytokines en chemokinen is verhoogd in iPSC-BEC's bij infectie met Nm, het meest prominent na 8 uur infectie, zoals eerder beschreven door Martins-Gomes et al (Figuur 2)19.

7. Aangeboren immuunactivatie door kwantitatieve PCR

OPMERKING: Gebruik een voorkeurs-RNA-isolatie, cDNA-synthese en qPCR-protocol, verzamel monsters en voer qPCR uit op geselecteerde cytokines.

  1. 7.1. Verzamel het RNA uit BEC-monsters na infectie op dag 10 van het differentiatieprotocol, met behulp van reagentia uit een in de handel verkrijgbare RNA-isolatiekit (zie de materiaaltabel).
    OPMERKING: Voorkom nucleasebesmetting van monsters door voorzichtig te werken in een gereinigde en gesteriliseerde omgeving.
    1. Bereid lysisbuffer voor en voeg 350 μL toe aan elk putje/monolaag van iPSC-BEC's.
    2. Verzamel de monsters door meerdere keren op en neer te pipetteren (bijv. 20x) en de suspensie over te brengen naar een steriele microcentrifugebuis.
      OPMERKING: Monsters kunnen worden bewaard bij -80 °C totdat ze klaar zijn voor RNA-isolatie.
    3. Volg het protocol dat bij de RNA-isolatiekit wordt geleverd voor RNA-zuivering uit gekweekte cellen en weefsels.
    4. Bewaar RNA-monsters na elutie in nucleasevrij water op ijs om mogelijke RNase-activiteit te minimaliseren.
    5. Schat RNA-concentraties op een spectrofotometer (bijv. Nanodrop).
  2. Genereer een cDNA-bibliotheek van het verzamelde RNA met behulp van een cDNA-synthesekit (zie Tabel met materialen).
    1. Stel reacties op die bestaan uit cDNA-synthesemastermix, ten minste 200 ng (idealiter 500 ng) monster-RNA en nucleasevrij water in een bepaald totaal reactievolume zoals beschreven in het protocol van de cDNA-synthesekit.
    2. Voer op een standaard thermocycler een programma uit dat geschikt is voor de gebruikte reagentia van de gebruikte cDNA-synthesekit. Bijvoorbeeld: 25 °C gedurende 2 min, 55 °C gedurende 10 min, 95 °C gedurende 1 min.
    3. Verdun het cDNA na synthese tot 1:10 in nucleasevrij water en verplaats de monsters naar 4 °C voor korte termijn of -20 °C voor langdurige opslag.
      OPMERKING: Een lagere verdunning kan nodig zijn als de RNA-concentratie laag was (bijv. minder dan 50 ng). Het verdunde cDNA kan tot een jaar lang bij -20 °C worden bewaard.
  3. Voer qPCR uit op de cDNA-monsters gericht op transcripten van aangeboren immuunresponsgenen zoals cytokines en chemokinen met zorgvuldig ontworpen en gevalideerde primers.
    OPMERKING: Aangezien het ontwerp van de primer erg belangrijk is voor de kwaliteit van de qPCR-resultaten, moet de efficiëntie van de primer worden getest door middel van een verdunningsreeks en moet de afwezigheid van meerdere producten worden bevestigd op een DNA-gel.
    1. Gebruik per reactie van 25 μL 0,5 μL voorwaartse en 0,5 μL omgekeerde primer (10 mM in nucleasevrij water), 1 μL cDNA, 10,5 μL nucleasevrije H2O en 12,5 μL qPCR mastermix.
    2. Voer de reactie uit op een qPCR-machine met behulp van het volgende cyclerprotocol: (a) 4 °C gedurende 2 min; b) 95 °C gedurende 15 min; c) 95 °C gedurende 15 s; d) 60 °C gedurende 1 min; 45 keer door (c) en (d) te fietsen; e) facultatieve smeltcurve: 30-99 °C in stappen van 1 °C; 25 °C gedurende 5 min.
    3. Gebruik voor gegevensanalyse de ΔΔCT-berekening om de expressieniveaus van cytokines en chemokine te vergelijken met een referentie-huishoudgen, zoals 18S of GAPDH.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het hier beschreven protocol is aangepast van Stebbins et al. en belicht het proces om iPSC's te differentiëren in hersenachtige endotheelcellen die BBB-eigenschappen bezitten, en hoe dit model kan worden gebruikt voor infectiestudies met behulp van iPSC-BEC's met Nm19,22. De iPSC-BEC's vertonen, wanneer ze op de juiste manier worden gedifferentieerd, strakke barrière-eigenschappen gemeten met TEER die vaak groter zijn dan 2000 Ω·cm2, en brengen endoth...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het modelleren van BEC's en de BBB heeft uitdagingen gekend, aangezien primaire en onsterfelijke menselijke BEC's, in vitro, de neiging hebben om robuuste barrièrefenotypes te missen. De komst van menselijke stamceltechnologieën heeft het mogelijk gemaakt om van iPSC afgeleide BEC-achtige cellen te genereren die de verwachte kenmerkende BBB-fenotypes behouden, zoals endotheelmarkers, tight junction-expressie, barrière-eigenschappen, respons op andere CZS-celtypen en functionele effluxtransporters 12,13,14,15,

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

L.M.E. wordt ondersteund door het DFG-onderzoekstrainingsprogramma GRK2157 getiteld "3D Tissue Models for Studying Microbial Infections by Human Pathogens", toegekend aan A.S-U. B.J.K. wordt ondersteund door een postdoctoraal fellowship van de Alexander von Humboldt Stichting. Daarnaast erkennen we Lena Wolter voor haar technische assistentie bij het genereren van de iPSC-BEC's in cultuur.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Accutase (1x)SigmaA6964Enzymatische celdissociatie reagens
AzijnzuurSigmaA6283
All-trans retinoïnezuur (RA)SigmaR2625
Anti-CD31 (PECAM-1)Thermo Scientific (Labvision)RB-10333
Anti-Claudin-5Invitrogen4C3C2
Anti-Glut-1Thermo Scientific (Labvision)SPM498 (MA5-11315)
Anti-OccludinInvitrogen33-1500
Anti-VE-cadherinSanta Cruzsc-52751
Anti-ZO-1Invitrogen33-9100
Bacto Proteose PeptoneBD211684
b-MercaptoethanolMerck (Sigma-Aldrich)805740
Celcultuur platen en flaconsSarstedt
Centrifuge (Heraeus Megafuge 1.0R)Thermo Scientific
Klasse II bioveiligheidskabinetNuaireNU-437-400E
CO2 Incubator (DHD Autoflow CO2 Air-Jacketed Incubator)Nuaire
Collageen IVSigmaC5533
Columbia ager + 5% schapenbloedBiomerieux43049
Costar Transwell polyester filters (12- of 24-well)Corning3460, 3470
D(+)-GlucoseMerck (Sigma-Aldrich)G8270
DAPIInvitrogenD1306
DMEM/F12Gibco31330-038
DMSOROTHA994.1
Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS)Gibco21600-069
Epitheliaal Volt-Ohm Meter (Millicell ERS-2) met STX-elektrodeMerck (Millipore)MERS00002
Fe(NO3)3ROTH5632.1
FibronectineSigmaF1141
Fluorescerende microscoop (Eclipse Ti)Nikon
Hemacytometer (Neubauer)A. HartensteinZK06
Human basic fibroblast growth factor (bFGF)PeproTech100-18B
Human Endotheel Serum Free Medium (hESFM)Gibco11111-044
Inverteer microscoop (Wilovert)Hund (Will Wetzlar)
iPS(IMR90)-4 cellenWiCell
Kellogg's supplementOm 110 ml Kellogg's supplement te bereiden, bereid 100 ml van 4 g/ml glucose, 0,1 g/ml glutamine en 0,2 mg/ml thiamine pyrofosfaat en 10 ml van 5 mg/ml Fe(NO3)3 en combineer de oplossingen. Filter steriliseren en in gealiquoteerde porties op -20 °C bewaren.
Knockout serum vervanger (KOSR)Gibco10828-028
L-glutamine (GlutaMAX)Invitrogen35050-038
LunaScript RT SuperMix KitNEBE3010LcDNA-synthesekit
Matrigel MatrixCorning354230
MethanolROTH4627.5
MgCl2ROTHKK36.1
Micropipetten (Research Plus)Eppendorf
NaHCO3ROTH6329
Non-essentiële aminozuren (NEAA)Gibco11140-035
NucleoSpin RNA isolatiekitMachery-Nagel740955RNA isolatiekit
Pipette boy (Accu-Jet Pro)Brand
Plasma-afgeleid serum, bovien (PDS) met een laag trombocytengehalteFisher50-443-029
PowerUp SYBR Green Master MixApplied BiosystemsA25742qPCR master mix
qPCR film (MicroAmp Optical Adhesive Film)Applied Biosystems4211971
qPCR platen (MicroAmp Fast 96-well)Applied Biosystems4346907
ROCK-remmer, Y27632 dihydrochlorideTocris1254
RT-PCR thermo cycler (StepOnePlus)Applied Biosystems4376600
Serologische pipettenSarstedt
StemFlex basaal medium + 50x StemFlex supplementGibcoA3349401Stamcellenonderhoudsmedium
Swinging Bucket Rotor (Heraeus #2704)Thermo Scientific
Thiamine pyrofosfaatSigmaC8754-5G
Trypan Blauw oplossing, 0,4%Gibco15250061
VerseneGibco15040-033Niet-enzymatische celdissociatie reagens (EDTA)

Referenties

  1. Rua, R., McGavern, D. B. Advances in Meningeal Immunity. Trends in Molecular Medicine. 24 (6), 542-559 (2018).
  2. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  3. Rouphael, N. G., Stephens, D. S. Neisseria meningitidis: Biology, microbiology, and epidemiology. Methods in Molecular Biology. , (2012).
  4. Stephens, D. S., Greenwood, B., Brandtzaeg, P. Epidemic meningitis, meningococcaemia, and Neisseria meningitidis. Lancet. 369 (9580), 2196-2210 (2007).
  5. Le Guennec, L., Coureuil, M., Nassif, X., Bourdoulous, S. Strategies used by bacterial pathogens to cross the blood-brain barrier. Cellular Microbiology. , (2020).
  6. Doran, K. S., et al. Host-pathogen interactions in bacterial meningitis. Acta Neuropathologica. 131 (2), 185-209 (2016).
  7. Cunha, C. S. E., Griffiths, N. J., Virji, M. Neisseria meningitidis opc invasin binds to the sulphated tyrosines of activated vitronectin to attach to and invade human brain endothelial cells. PLoS Pathogens. , (2010).
  8. Coureuil, M., et al. Meningococcus hijacks a β2-adrenoceptor/β-arrestin pathway to cross brain microvasculature endothelium. Cell. 143 (7), 1149-1160 (2010).
  9. Bernard, S. C., et al. Pathogenic Neisseria meningitidis utilizes CD147 for vascular colonization. Nature Medicine. 20 (7), 725-731 (2014).
  10. Slanina, H., Hebling, S., Hauck, C. R., Schubert-Unkmeir, A. Cell invasion by neisseria meningitidis requires a functional interplay between the focal adhesion kinase, Src and cortactin. PLoS ONE. 7 (6), (2012).
  11. Unkmeir, A., et al. Fibronectin mediates Opc-dependent internalization of Neisseria meningitidis in human brain microvascular endothelial cells. Molecular Microbiology. 46 (4), 933-946 (2002).
  12. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2015).
  13. Lippmann, E. S., et al. Derivation of Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783-791 (2012).
  14. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160(2014).
  15. Hollmann, E. K., Bailey, A. K., Potharazu, A. V., Neely, M. D., Bowman, A. B., Lippmann, E. S. Accelerated differentiation of human induced pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. , (2017).
  16. Kim, B. J., et al. Modeling Group B Streptococcus and Blood-Brain Barrier Interaction by Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells. mSphere. , (2017).
  17. Kim, B. J., et al. Streptococcus agalactiae disrupts P-glycoprotein function in brain endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 26(2019).
  18. Kim, B. J., Shusta, E. V., Doran, K. S. Past and Current Perspectives in Modeling Bacteria and Blood–Brain Barrier Interactions. Frontiers in Microbiology. , (2019).
  19. Martins Gomes, S. F., et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells as a Cellular Model to Study Neisseria meningitidis Infection. Frontiers in Microbiology. , (2019).
  20. Vatine, G. D., et al. Modeling Psychomotor Retardation using iPSCs from MCT8-Deficient Patients Indicates a Prominent Role for the Blood-Brain Barrier. Cell Stem Cell. , (2016).
  21. Lim, R. G., et al. Huntington's Disease iPSC-Derived Brain Microvascular Endothelial Cells Reveal WNT-Mediated Angiogenic and Blood-Brain Barrier Deficits. Cell Reports. 19 (7), 1365-1377 (2017).
  22. Stebbins, M. J., Wilson, H. K., Canfield, S. G., Qian, T., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells. Methods. 101, 93-102 (2016).
  23. Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reports. 12 (6), 1380-1388 (2019).
  24. Wilson, H. K., Canfield, S. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Exploring the effects of cell seeding density on the differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. , (2015).
  25. Wilson, H. K., Faubion, M. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Cryopreservation of brain endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells is enhanced by rho-associated coiled coil-containing kinase inhibition. Tissue Engineering - Part C: Methods. , (2016).
  26. Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. , (2017).
  27. Sances, S., et al. Human iPSC-Derived Endothelial Cells and Microengineered Organ-Chip Enhance Neuronal Development. Stem Cell Reports. , (2018).
  28. Canfield, S. G., et al. An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Journal of Neurochemistry. , (2017).
  29. Kurosawa, H. Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. , (2012).
  30. Schubert-Unkmeir, A., Sokolova, O., Panzner, U., Eigenthaler, M., Frosch, M. Gene expression pattern in human brain endothelial cells in response to Neisseria meningitidis. Infection and Immunity. 75 (2), 899-914 (2007).
  31. Sokolova, O., et al. Interaction of Neisseria meningitidis with human brain microvascular endothelial cells: Role of MAP- and tyrosine kinases in invasion and inflammatory cytokine release. Cellular Microbiology. 6 (12), 1153-1166 (2004).
  32. Alimonti, J. B., et al. Zika virus crosses an in vitro human blood brain barrier model. Fluids and Barriers of the CNS. , (2018).
  33. Kim, B. J., Schubert-unkmeir, A. In vitro Models for Studying the Interaction of Neisseria meningitidis with Human Brain Endothelial Cells. Neisseria meningitidis: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. 1969, 135-148 (2019).
  34. Kim, B. J., et al. Bacterial induction of Snail1 contributes to blood-brain barrier disruption. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2473-2483 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Erratum


Formal Correction: Erratum: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells
Posted by JoVE Editors on 10/12/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells Larvae. The Authors section was updated from:

Leo M. Endres1
Alexandra Schubert-Unkmeir1
Brandon J. Kim1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg
2Department of Biological Sciences, University of Alabama

to:

Leo M. Endres1
Sarah F. Hathcock2
Alexandra Schubert-Unkmeir1
Brandon J. Kim1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg
2Department of Biological Sciences, University of Alabama

Tags

uit iPSC afgeleide hersenenendotheelcellenbloed-hersenbarrièremodeltransendotheliale elektrische weerstandstamceldifferentiatieendotheelcelmarkersprotocol voor bacteriële preparatieonderhoud van celculturenanalyse van barrièreeigenschappengastheer-pathogeeninteractie
Neisseria meningitidis Infectie van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide endotheelcellen in de hersenen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.