Methodenartikel

Extra Cellular Matrix-based en extra cellular matrix-vrije generatie van Murine Testiculaire Organoïden

6.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61403

⸱

7 oktober 2020

 ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

In dit artikel

Samenvatting

Hier worden vier methoden beschreven voor het genereren van testiculaire organoïden uit primaire neonatale murine-testiculaire cellen, d.w.z. extracellulaire matrix (ECM) en ECM-vrije 2D- en 3D-cultuuromgevingen. Deze technieken hebben meerdere onderzoekstoepassingen en zijn vooral nuttig voor het bestuderen van testiculaire ontwikkeling en fysiologie in vitro.

Samenvatting

Testiculaire organoïden bieden een hulpmiddel voor het bestuderen van testiculaire ontwikkeling, spermatogenese, en endocrinologie in vitro. Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om testiculaire organoïden te maken. Veel van deze methoden vertrouwen op extracellulaire matrix (ECM) ter bevordering van de novo weefselassemblage, maar er zijn verschillen tussen methoden in termen van biomimetische morfologie en functie van weefsels. Bovendien zijn er weinig directe vergelijkingen van gepubliceerde methoden. Hier wordt een directe vergelijking gemaakt door verschillen in organoïde generatieprotocollen te bestuderen, met verstrekte resultaten. Vier archetypische generatiemethoden: (1) 2D ECM-vrij, (2) 2D ECM, (3) 3D ECM-vrij en (4) 3D ECM-cultuur worden beschreven. Drie primaire benchmarks werden gebruikt om de testiculaire organoïde generatie te beoordelen. Dit zijn cellulaire zelfassemblage, opname van grote celtypen (Sertoli, Leydig, kiem, en peritubulaire cellen), en adequaat gecompartimenteerde weefselarchitectuur. Van de vier geteste omgevingen genereerden 2D ECM- en 3D ECM-vrije culturen organoïden met interne morfologieën die het meest lijken op inheemse teelballen, waaronder de de novo compartimentering van buisvormige versus interstitiële celtypen, de ontwikkeling van tubule-achtige structuren en een gevestigde langdurige endocriene functie. Alle bestudeerde methoden gebruikten ongesorteerde, primaire murine testiculaire celsuspensies en gebruikten algemeen toegankelijke kweekmiddelen. Deze testiculaire organoïde generatietechnieken bieden een zeer toegankelijke en reproduceerbare toolkit voor onderzoeksinitiatieven op het gebied van testiculaire organogenese en fysiologie in vitro.

Inleiding

Testiculaire organoïden zijn een baanbrekende techniek voor het bestuderen van testiculaire ontwikkeling, spermatogenese en fysiologie in vitro1,2,3,4. Verschillende methoden zijn onderzocht voor organoïde generatie; deze omvatten een verscheidenheid aan extracellulaire matrix (ECM) en ECM-vrije kweeksystemen, zowel in tweedimensionale (2D) als in driedimensionale (3D) oriëntaties. Verschillende generatiemethoden kunnen verschillende cellulaire assemblagestrategieën bevorderen; dit resulteert in een hoge mate van morfologische en functionele variabiliteit tussen gepubliceerde organoïde modellen. Het doel van dit artikel is om de huidige toestand van in vitro testiculaire modellen te bespreken, en om te dienen als een sjabloon voor toekomstige onderzoekers, bij het ontwerpen van testiculaire organoïde experimenten. Binnen deze studie worden vier verschillende cultuursysteemarchetypen gedefinieerd en gekenmerkt in experimenteel proces en biologische uitkomst. Deze omvatten: 2D ECM-Free, 2D ECM, 3D ECM-Free en 3D ECM cultuurmethoden. De hierin gepresenteerde strategieën zijn bedoeld om eenvoudig, toegankelijk en zeer reproduceerbaar te zijn tussen verschillende laboratoria en onderzoeksgroepen.

Historisch voor de testis, de benaming "in vitro", is gebruikt voor verschillende cultuurmethoden van testiculaire weefsels en cellen. Deze omvatten organotypische weefsel/orgaankweekmethoden (d.w.z. explantcultuur)5, geïsoleerde halfnifereuze tubulicultuur6, testiculaire celkweek7, en methoden van de novo weefselmorfogenese (d.w.z., biologische constructies en organoïden)1. De eerste onderzoeken naar in vitro spermatogenese werden ongeveer 100 jaar geleden uitgevoerd, met de cultuur van konijn testis explants in 19208, en later in 1937 met muis explants9. Binnen deze eerste experimenten spermatogonia werden waargenomen om grotendeels te degenereren in de eerste week van de cultuur, hoewel sommige meiotically differentiërende cellen werden geïdentificeerd. Doet denken aan deze historische rapporten, testis explant cultuur werd nieuw leven ingeblazen en geoptimaliseerd in 2011 om een haalbare techniek voor het bestuderen van de testis10. Sinds 2011 produceert de explantcultuur vruchtbaarheidsge competent sperma in meerdere rapporten11,12,13. Toch, als gevolg van explant cultuur afhankelijkheid van reeds bestaande inheemse testis tubuli, deze recente vooruitgang worden nauwkeuriger beschreven als voorbeelden van "ex vivo" testiculaire functie en spermatogenese, weefsel functie die werd gehandhaafd of hervat bij verwijdering uit het lichaam van een organisme. Ondanks de prevalentie in de literatuur, lange termijn kiemcel onderhoud en differentiatie binnen testiculaire explants is een uitdaging om te repliceren14,15,16,17,18, vooral over termijnen lang genoeg om volledig te observeren in vitro spermatogenese (~ 35 dagen bij muizen19 en 74 bij de mens20). Het is intrigerend om te begrijpen dat veel van dezelfde uitdagingen ervaren 100 jaar geleden, zijn nog steeds ervaren binnen ex vivo spermatogenese vandaag.

Anders dan ex vivo benaderingen, testiculaire organoïden zijn de novo geassembleerde microtissues die volledig in vitro worden gegenereerd uit cellulaire bronnen (d.w.z. primaire testiculaire cellen). Testiculaire organoïden bieden een creatieve strategie om de historische afhankelijkheid van het veld van reeds bestaand inheems weefsel te omzeilen en testiculaire biologie volledig in vitro samen te vatten. Er zijn meerdere eisen gedeeld door de meeste organoïde weefselmodellen; deze omvatten (1) in vivo-mimetische weefselmorfologie of architectuur, (2) meerdere belangrijke celtypen van het vertegenwoordigde weefsel, (3) zelfassemblage of zelforganisatie in hun generatie, en (4) de mogelijkheid om een bepaald niveau van de functie en fysiologie van het vertegenwoordigde weefsel te simuleren21,22,23,24. Voor de testis kan dit worden vastgelegd in vier belangrijke kenmerken: (1) de opname van belangrijke soorten testiculaire cellen, kiem,Sertoli, Leydig, peritubulaire, en andere interstitiële cellen, (2) cel-gerichte weefsel assemblage, (3) adequaat gecompartimenteerde celtypen in afzonderlijke buisvormige compartimenten (kiem en Sertoli) en interstitiële gebieden (alle andere celtypes), en (4) een zekere mate van weefselfunctie (bijvoorbeeld, reproductieve hormoon secretie of weefselreacties, en kiemcel onderhoud en differentiatie). Gezien de historische uitdagingen bij het handhaven van kiemceldifferentiatie ex vivo en in vitro, zijn de recapitulatie van in vivo-mimetische testiculaire architecturen (d.w.z. structuren die lijken op seminiferous tubuli) met extra markers die simulatie van testiculaire fysiologie suggereren (bijvoorbeeld endocriene functie), prioritaire mijlpalen zijn ten aanzien van het genereren van organoïden die op een dag in vitro spermatogenese zouden kunnen ondersteunen.

De meeste gepubliceerde testiculaire organoïde methoden maken gebruik van commercieel beschikbare ECM (bv. collageen of gepatenteerde ECM-formuleringen)25,26,27 of op maat gemaakte ECU's (d.w.z. gedecelluleerde testis ECM-afgeleide hydrogels)28,29,30. Exogene ECM bevordert de novo weefselvorming door het verstrekken van een assemblage-ondersteunende steiger voor weefsel generatie. ECM-methoden hebben een indrukwekkend niveau van weefselvorming geboden, waaronder enige aanwezigheid van kiemcelcellen en weefselmimetische morfologie25,28. De ECM's die zij gebruiken zijn echter niet altijd universeel beschikbaar (d.w.z. gedecelluleerde ECM-afgeleide hydrogels) en sommige methoden vereisen geavanceerde gel- en celzaaioriëntaties (bijvoorbeeld 3-laaggradiënten van ECM en 3D-printen)25,31,32. Steigervrije methoden (bijvoorbeeld hangende val en niet-loodzhemende kweekplaten)33,34,35 hebben ook robuuste en zeer reproduceerbare organoïden gegenereerd zonder de noodzaak van ECM-gels of steigers. De weefselmorfologie van deze steigervrije organoïden is echter vaak ongelijk aan in vivo teelballen, en de meeste van deze rapporten bevatten een biochemisch ECM-additief ter bevordering van weefselvorming33,34,36, of als alternatief, vertrouwen op centrifugatie voor geforceerde celaggregatie en verdichting34, waardoor ze minder ideaal zijn voor het bestuderen van celgestuurde migratie en zelforganisatie.

De vier organoïde generatie methoden gepresenteerd in dit manuscript omvatten zowel ECM-afhankelijke en onafhankelijke strategieën, elk met behulp van eenvoudige cel zaaien die de observatie van cel-gedreven organoïde zelfassemblage mogelijk maakt. Alle vier de technieken kunnen worden uitgevoerd vanuit dezelfde cel suspensies of kan gebruik maken van aangepaste en cel-type verrijkte populaties. Een kracht van deze methoden is het vermogen om organoïden zelf te assembleren in real-time te observeren, en om direct te vergelijken hoe testiculaire structuren zelf assembleren tussen verschillende cultuurmicro-omgevingen. De fenotypische verschillen tussen deze vier cultuurmethoden moeten worden overwogen voor hun impact op de onderzoeksvraag of het onderwerp van de onderzoeker. Elke methode produceert biologische constructies of organoïden binnen 24 uur of minder. Tot slot, de hier gepresenteerde methoden bieden een toolkit van organoïde assemblagetechnieken voor het bestuderen van testiculaire organoïde assemblage, weefselontwikkeling en testiculaire fysiologie in vitro.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle muis experimenten werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Northwestern University, en alle procedures werden uitgevoerd onder IACUC-goedgekeurde protocollen.

1. Bereiding van enzymatische oplossingen voor weefselesociatie

  1. Gebruik twee verschillende enzymatische oplossingen (Solution 1 en Solution 2), beide gemaakt met behulp van een basale cultuur medium oplossing (BM).
  2. Voeg voor de voorbereiding van BM serum en penicilline-streptomycine toe aan minimale essentiële medium tot eindconcentraties van respectievelijk 10% en 1% (zie tabel met materialen voor specifieke reagentia). Vervolgens steriel filter de BM door een 0,22 μm filter. Voor gebruik met cellen, pre-equilibrate steriele BM naar een neutrale pH door uit te geven in een kweekschaal en het plaatsen in een bevochtigde, 5% CO2 incubator op 37 °C voor een minimum van 1 uur.
    LET OP: BM kan maximaal 1 week bij 4 °C worden bewaard, waarna verse BM moet worden gemaakt.
  3. Om collagenase I stock oplossingen voor te bereiden, los eerst 100 mg collagenase I op in 1 mL steriele embryo kwaliteit H2O (uiteindelijke concentratie 10% m/v), omkeren of wervelen om op te lossen, en sla 20 μL aliquots op bij -20 °C voor later gebruik. Aliquots mogen slechts één keer ontdooid worden.
  4. Om deoxyribonuclease I (DNase I) voorraadoplossingen voor te bereiden, voegt u 20 mg DNase I toe in 1 mL steriel embryoniveau H2O (eindconcentratie 2% m/v), omkeren of wervelen om op te lossen (niet vortex), en 20 μL aliquots op te slaan bij -20 °C voor later gebruik. Aliquots mogen slechts één keer ontdooid worden.
  5. Voeg voor hyaluronidase-voorraadoplossingen 30 mg toe in 1 mL steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; eindconcentratie 3% m/v hyaluronidase in PBS met Ca++/Mg++), omkeren of wervelen om op te lossen, en bewaar 100 μL aliquoten bij -20 °C voor later gebruik. Aliquots kunnen meerdere keren ontdooid en opnieuw worden ingevroren zonder verlies van enzymatische activiteit.
  6. Voeg 10 Solution 1μL collagenase I en 10 μL DNase I toe in 1 mL steriele, vooraf geëquilibreerde BM (Definitieve concentraties: 1 mg/mL collagenase I en 5 μg/mL DNase I). Trituraat voorzichtig met een pipet om de oplossing te mengen, en voorverwarmen tot 37 °C voor gebruik met het weefsel.
    OPMERKING: Oplossing 2 wordt bereid door 33 μL hyaluronidase (voorverwarmd tot 37 °C) per 1 mL van oplossing 1 (toe te voegen aan een uiteindelijke concentratie van 1 mg/mL). Dit gebeurt halverwege door enzymatische dissociatie van testisweefsel bij stap 2.5 hieronder.

2. Testis weefseldissociatie

LET OP: Alle muizen waren gehuisvest in polypropyleen kooien en voorzien van voedsel en water ad libitum. Dieren werden gevoed chow die geen fyto-oestrogenen bevat gevoed. Jonge CD-1 muizen, 5 dagen post-partum (dpp), werden gebruikt voor alle experimenten en verdoofd voorafgaand aan euthanasie en weefselverzameling, binnen een anesthesiekamer die is bevestigd aan een isoflurane vaporizer (2.5 L/min in O2). Muizen werden bevestigd voor volledige anesthesie via het ontbreken van een reactie op teen-prik, waarna muizen werden geëuthanaseerd via onthoofding.

  1. Verdoof muizen in een isofluranekamer, zorg voor anesthesie via een teenprik en onthoofd de muis vervolgens met een scherpe schaar. Plaats de geëuthanaseerde muis supine op een dissectie mat en steriliseren de buik met 70% ethanol. Tent de huid van de onderbuik met tangen en open de buik met een schaar.
  2. Zoek de teelballen in de linker- en rechter inguinale gebieden van de buik. Snijd hun verbindingen met de vas deferens en eventuele verankering bindweefsel, dan til de hele testis (met epididymis nog steeds bevestigd) van het dier. Plaats teelballen in een petrischaaltje van vooraf geëquilibreerde BM.
  3. Onder een dissectiemicroscoop en binnen een steriel veld, maak een kleine incisie in de tunica albuginea aan de ene kant van elke testis met ofwel een kleine microdissectie schaar of door zachtjes scheuren met behulp van twee fijne tangen.
    1. Vervolgens knijpt u tijdens het vasthouden van de testis aan het andere uiteinde van de incisie voorzichtig met fijne tangen en duw in een zachte vegende beweging naar het gat in de tunica; dit zal het testiculaire weefsel als één samenhangend stuk vrijgeven.
  4. Snijd de teelballen in kleinere stukken (≤ 2 mm3)en leg ze in 1 mL voorverwarmde (37 °C) dissociatieoplossing 1.
    1. Incubeer bij 37 °C gedurende 10 minuten.
    2. Voor meer dan 10 teelballen verhoog u het totale volume van de dissociatieoplossing met 1 mL, waarbij een minimum van 1 mL dissociatieoplossing per 10 teelballen wordt gegarandeerd (bijvoorbeeld 2 mL voor 20 teelballen, 3 mL voor 30 teelballen, enz.).
    3. Triturate de testis stukken 50 keer (50x) in oplossing 1 met behulp van een P1000 pipet. Zorg ervoor dat de tubuli scheiden van elkaar en van interstitiële weefsel op dit punt. Als klonten blijven, incubeer voor een extra 5 min en trituraat nogmaals (50x).
  5. Voeg 33 μL hyaluronidase-voorraadoplossing (voorverwarmd bij 37 °C, vanaf stap 1,5) per 1 mL van oplossing 1 dissociatiemengsel (met het gedeeltelijk gescheiden testiculaire weefsel en de tubuli) toe. Na toevoeging van hyaluronidase wordt dit oplossing 2 genoemd.
    1. Trituraat (50x) met behulp van een P1000 en incubaal bij 37 °C gedurende 5 minuten.
    2. Trituraat (50x) met behulp van een P200 pipet.
    3. Zorg ervoor dat op dit punt geen zichtbare tubuli of klonten cellen aanwezig zijn. Als klonten aanhouden, incubeer voor maximaal 5 min, met verdere trituratie met behulp van een P200 pipet (50x).
  6. Blus de dissociatieenzymen door foetaal runderserum (FBS) toe te voegen aan 10% van het totale volume van oplossing 2. Trituraat meerdere malen met behulp van een P200 pipet om ervoor te zorgen geen klonten blijven, en filter door een 40 μm cel zeef om een eencellige suspensie te produceren.
  7. Centrifugecellen op 100 x g gedurende 7 minuten, gooi de supernatant weg en roep de cellen opnieuw op in verse BM.
  8. Tel de totale en levensvatbare celconcentraties met trypan blauwe uitsluiting op een hemocytometer. Voeg 10 μL van 1:1 verdund, celsuspensie: trypan blauwe oplossing, in de hemocytometerceltelkamer toe (zie Tabel van Materialen).
    1. Re-centrifuge cellen op 100 x g gedurende 7 min en resuspend in verse BM.
      OPMERKING: Gebruik alleen levensvatbare cellen voor het berekenen van celconcentratie en -getal. Gebruik alleen celsuspensies van ≥ 80% levensvatbaarheid voor het genereren van organoïden.
    2. Bereid de suspensie van één cel in celconcentraties zoals beschreven voor om 280.000 cellen te verwerken, gezien de volumes die worden gebruikt in de onderstaande protocolspecifieke stappen in punt 3: 2D ECM-Vrij – 0,56 x 106 cellen/mL, 2D ECM – 0,56 x 106 cellen/mL, 3D ECM-Vrij – 4,66 x 106 cellen/mL, 3D ECM – 2,8 x 106 cellen/mL.
      LET OP: Alle hier gepresenteerde cultuurexperimenten beginnen met 280.000 cellen die per cultuur goed zijn gezaaid. Deze nummers komen overeen met de representatieve gegevens in figuur 1, figuur 2, figuur 3 en figuur 4.

3. Bereiding van organoïde kweekgerechten en zaaien van cellen

OPMERKING: Om een homogene ECM te garanderen, vóór ontdooien bevroren aliquots van ECM 's nachts voor het experimenteren. ECM-aliquoten moeten worden ondergedompeld in een emmer ijs in een koelkast van 4 °C of een koude ruimte om een langzame, geleidelijke temperatuurstijging te garanderen. Alle ECM wordt gebruikt bij een 1:1 definitieve verdunning in BM voor cultuur. Houd ontdooide ECM en 1:1 verdunde ECM op ijs tot vlak voor gebruik, anders zou de ECM voortijdig kunnen polymeriseren.

  1. Voor 2D ECM-vrije cultuur is geen speciale voorbereiding nodig, plaat eencellige suspensies (500 μL van 0,56 x 106 cellen/mL in BM) direct op 4- goed kamerdia's, en plaats in een 35 °C incubator voor cultuur.
    OPMERKING: Cellen moeten zich aan de onderkant van het kweekgerecht houden binnen de eerste 24 uur van de cultuur en kunnen binnen deze zelfde tijd enkele kleine 3D-celclusters vertonen.
  2. Voor 2D ECM cultuur, afzien van 100 μL koude 1:1 verdunde extracellulaire kelder matrix medium in een 4 put kamer glijbaan, zodat de gel dekt het geheel van de schotel bodem.
    1. Plaats de schuifkamer in een couveuse van 35 °C gedurende minimaal 30 minuten, zodat de ECM in een gel kan polymeriseren.
    2. Voeg de celsuspensie (500 μL van 0,56 x 106 cellen/mL in BM) direct toe aan de bovenkant van de 2D-gel zodra deze is gepolymeriseerd.
      OPMERKING: Cellen moeten samen clusteren tot kleine 3D-clusters binnen de eerste 24 uur van de cultuur.
  3. Voor 3D ECM-vrije cultuur, bereiden agarose 3D Petri schotel inserts voordat u begint met de celcultuur.
    1. Ten eerste, autoclave 1,5 g agarose poeder in een 100 mL beker, voeg dan 75 mL steriel, gedestilleerd water en magnetron te produceren gesmolten 2% agarose voor 3D Petri schotel gieten.
    2. Binnen een steriele werkruimte, afzien gesmolten agarose in de 3D Petri schotel schimmel totdat de meniscus is niveau met de zijkanten van de mal.
    3. Laat de agarose afkoelen en stollen. Wanneer solide, draai de mal ondersteboven en voorzichtig voorzichtig buigen herhaaldelijk tot de agarose 3D Petri schotel valt vrij van de mal.
      OPMERKING: Op dit punt kan men veel agarose 3D Petri gerechten bereiden en ze opslaan in steriele H2O of DPBS op 4 °C gedurende meer dan een maand.
    4. Voorafgaand aan het kweken, plaats agarose 3D Petri gerechten in een 24 goed cultuur gerecht, en bedek ze met 1 mL van BM. Laat de 3D Petri gerechten minstens 30 minuten in BM equilibrate in een 37 °C kweekcubator. Gooi de BM weg en herhaal het evenwicht nogmaals met 1 mL verse BM. Na evenwicht van 3D Petri gerechten in BM, zullen ze verschijnen dezelfde kleur als de BM (dat wil zeggen, roze).
    5. Om voor te bereiden op celzaaien, verwijder alle BM uit de put en doe 200 μL verse BM rond, maar niet in het midden uitsparing van de 3D Petri schotel. Verzamel ook de resterende BM vanuit het midden celzaaien uitsparing van de microwell insert.
    6. Doe de suspensie van één cel (4,66 cellen/mL in 60 μL BM) in de middenuitsparing van de agarose 3D Petri schotel. Voorzichtig tritureren op en neer om cellen te mengen en een enkele cel suspensie te garanderen aan het begin van de cultuur.
    7. Plaats in een bevochtigde 35 °C incubator voor cultuur. De volgende dag verwijdert u de 200 μL BM uit de microwell wisselplaat en vervangt u deze door 1 mL verse BM. Dit brengt het vloeistofniveau boven het vlak van de insert, het onderdompelen van de hele cultuur.
    8. Langzaam en voorzichtig verwijderen / voeg media van buiten de agarose 3D Petri schotel. De organoïden moeten 's nachts verdicht zijn, zodat ze aan de onderkant kunnen rusten en mediawisselingen ongestoord kunnen laten.
  4. Bereid voor 3D ECM-cultuur een eencellige suspensie door in gelijke delen de celsuspensie in BM te combineren met koude, voorbedachte ECM (uiteindelijke concentratie = 2,8 x 106 cellen/mL).
    1. Breng het cel-ECM mengsel onmiddellijk in een 4 put kamer schuif, zodat het mengsel de gehele bodem van de plaat bedekt.
    2. Plaats de kamerglijbanen op 35 °C in een couveuse en laat de inhoud ervan polymeriseren. Dit duurt minstens 30 minuten. Voeg na de polymerisatie 500 μL BM toe aan de bovenkant van de cultuur.
      OPMERKING: Cellen moeten zijn geclusterd om kleine 3D-aggregaten te vormen binnen de eerste 24 uur van de cultuur.

4. Organoïde onderhoud

  1. Cultuur alle organoïde modeltypes bij 35 °C. Voor Alle cultuur types wisselen de helft van hun media met verse BM elke 2 dagen. Om ervoor te zorgen dat organoïden niet per ongeluk worden verzameld tijdens het uitwisselen van medium, altijd verzamelen media langzaam uit een hoek van de kamer dia schotel, en vanaf een extern punt buiten agarose 3D Petri gerechten. Alle media kunnen worden opgeslagen bij -20 °C voor gebruik met immunoassays of andere analyses later (d.w.z. kwantificering van uitgescheiden voortplantingshormonen of cytokinen).
  2. Gebruik na 7 dagen in cultuur BM met follikelstimulerend hormoon (eindconcentratie 20 mIU/mL) en menselijke chorionic gonadotropine (laatste concentratie 4,5 IE/mL). Dit geldt voor alle organoïde cultuurtypes.
  3. Routinematig beeld alle organoïde culturen (dat wil zeggen, time-lapse imaging) voor het karakteriseren van organoïde vorming en het kwantificeren van statistieken van zelfassemblage, ontwikkeling en groei in de tijd.

5. Organoid Collection

OPMERKING: Alle organoïden kunnen met 4% paraformaldehyde in PBS worden bevestigd voor downstream immunolabeling en histologische analyses. Fix for 2 h at room temperature with rotation, or overnight at 4 °C.

  1. Voor 2D ECM-vrije culturen, eerst spoelen het monster met verse PBS, en voeg fixatief direct op de top van de aangehangen constructies.
  2. Voor ECM (2D en 3D) cultuurmethoden, spoel een keer met PBS, en voeg vervolgens fixatief direct op de top van de ECM-organoïde monster (om de ECM gel en organoïden samen vast te stellen), of als alternatief, zachtjes pipette de organoïden op en neer om ze te bevrijden uit de omliggende ECM, en over te dragen aan een aparte buis voor fixatie.
  3. Voor 3D ECM-vrije cultuur, voorzichtig pipette de organoïden op en neer binnen het centrum uitsparing van de agarose 3D Petri schotel; dit zal spoelen de organoïden uit het vergemakkelijken van hun gemakkelijke collectie met een pipet. Breng vervolgens organoïden over naar een aparte buis voor fixatie.
  4. Voordat u tot paraffine wordt verwerkt, sluit u veel organoïden (≥ 20) in een klein volume (~ 30 μL) van weefselverwerkingsgel; dit helpt bij het oriënteren en concentreren van organoïden in een klein gebied binnen paraffineblokken, waardoor gemakkelijker wordt geobserveerd bij het doorsneed en gemakkelijker visuele identificatie binnen paraffinesecties.
    OPMERKING: Organoïden kunnen een uitdaging zijn om te identificeren na paraffine inbedding en sectie op een microtome.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Organoïde generatie werd beschouwd als niet succesvol als testiculaire cellen niet zelf assembleren binnen 72 uur van de cultuur, echter, alle methoden hier gepresenteerd verzamelen binnen 24 uur bij het gebruik van jonge (5 dpp) murine cellen. Falen van biologische constructgeneratie gepresenteerd als een voortzetting van vrij zwevende cellen (0 h kolom in figuur 1) zelfs na uitgebreide cultuur (72 h). Bij afwezigheid van zelfassemblage van weefsel, alle schijnbare celclusters gemakkelijk v...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Met de voltooiing van dit organoïde generatieprotocol heeft de gebruiker vier verschillende cultuurtechnieken tot hun beschikking voor het assembleren van testiculaire constructies en organoïden in ECM- of ECM-vrije omgevingen. Belangrijk is dat alle vier de methoden de onderzoeker in staat stellen om organoïde zelfassemblage in de loop van de tijd niet te observeren door middel van time-lapse beeldvorming of video-opname, en om niet-invasief geconditioneerde media te verzamelen voor analyse van uitgescheiden hormonen en...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door het National Institutes of Health, National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) F31 HD089693, het National Institute for Environmental Health Sciences / National Center for Advancing Translational Sciences (NIEHS/NCATS) UH3TR001207 en 4UH3ES029073-03, en het Thomas J. Watkin's Memorial Professorship.

De auteurs zouden Eric W. Roth voor hun hulp met transmissieelektronenmicroscopie willen danken. Dit werk maakte gebruik van de BioCryo faciliteit van Northwestern University NUANCE Center, die steun heeft ontvangen van de Soft and Hybrid Nanotechnology Experimental (SHyNE) Resource (NSF ECCS-1542205); het MRSEC-programma (NSF DMR-1720139) van het Materials Research Center; het Internationaal Instituut voor Nanotechnologie (IIN); en de staat Illinois, via het IIN. Het maakte ook gebruik van de CryoCluster apparatuur, die steun heeft ontvangen van het MRI-programma (NSF DMR-1229693). Afbeeldingen in figuur 1 zijn ontworpen met behulp van BioRender.com.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.22 um Media Sterile FiltersMillipore Sigmascgpu05reVoor steriele filtermedia
3βHSD primary antibodyCosmo Bio CoK0607Leydig cel marker, 1:500 verdunning
AlexaFluor 568 α-MouseThermo Fisher ScientificA-21202Fluorescent gelabelde secundaire antilichaam
AlexaFluor 568 α-RabbitThermo Fisher ScientificA10042Fluorescent gelabelde secundaire antilichaam
Alpha Minimum Essential MediumThermo Fisher Scientific11-095-080Basis van kweekmedia
Collagenase IWorthington BioLS004197Voor dissociatie oplossing 1
Corning Matrigel Membrane Matrix, LDEV-freeCorning354234Extracellulaire matrix gebruikt voor het casten van 2D en 3D ECM kweekgels
Countess Cell counterThermo Fisher ScientificC10227Automatische celteller (hemacytometer machine)
Countess Cell Counting Chamber SlidesThermo Fisher ScientificC10228Hemacytometer dia voor gebruik met Countess geautomatiseerde teller
DDX4 primary antibodyAbcam138540Spermatogonia marker, 1:500 verdunning
Deoxyribonuclease I (2,280 u/mgDW)Worthington BioLS002140Voor dissociatie oplossing 1
DPBS 1X, + CaCl + MgClThermo Fisher Scientific14040182Voor het reconstitueren van Hyaluronidase
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline +Ca/+MgThermo Fisher Scientific14040117PBS
Embryo Grade H2OMIllipore SigmaW1503Voor het reconstitueren van Collagenase I en Dnase I
Fetal Bovine SerumThermo Fisher Scientific16000044Voor enzymen die quencing dissociatie oplossingen
Follicle stimulating hormoneAbcamab51888Voor langdurige organoid kweek
Human chorionic gonadotropinMillipore SigmaC1063Voor langdurige organoid kweek
Hyaluronidase, from bovine testesMillipore SigmaH4272Voor dissociatie oplossing 2
Inhibin B Enzyme-linked Immunosorbent AssayAnsh LabsAL-107Inhibin B ELISA Kit
KnockOut Serum ReplacementThermo Fisher Scientific10828-028Serumbron voor basismedia
MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids (24-35, 5x7 array)Millipore SigmaZ764051Voor 3D ECM-vrije organoid fabricage
Nunc, Lab Tek II Chamber Slide System, 4-wellThermo Fisher Scientific12-565-7Voor 2D ECM-vrij en 2D, 3D ECM kweek
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific15-140-122Antibioticum voor media
Richard-Allan Scientific; Histogel, Specimen processing gelThermo Fisher ScientificHG-4000-012Voor het ondersteunen van paraffine inbedding
SOX9 primary antibodyMillipore SigmaAB5535Sertoli Marker, 1:500 verdunning
Tedklad Global Mouse Chow (Breeder)Teklad Global2920Muisvoer zonder fyto-oestrogenen
Tedklad Global Mouse Chow (Maintenance)Teklad Global2916Muisvoer zonder fyto-oestrogenen
Testosterone Enzyme-linked Immunosorbent AssayCalbiotechTE373STestosteron ELISA Kit
Trypan Blue Solution, 0.4%Thermo Fisher Scientific15250061Voor celtelling
αSMA primary antibodyMillipore SigmaA2547Peritubulair marker, 1:500 verdunning
βCatenin primary antibodyBD Biosciences610154Sertoli Cytoplasm marker, 1:100 verdunning

Referenties

  1. Alves-Lopes, J. P., Stukenborg, J. B. Testicular organoids: a new model to study the testicular microenvironment in vitro. Human Reproduction Update. 24 (2), 176-191 (2018).
  2. Komeya, M., Sato, T., Ogawa, T. In vitro spermatogenesis: A century-long research journey, still half way around. Reproductive Medicine and Biology. 17 (4), 407-420 (2018).
  3. Sakib, S., Goldsmith, T., Voigt, A., Dobrinski, I. Testicular organoids to study cell-cell interactions in the mammalian testis. Andrology. , 12680(2019).
  4. Gargus, E. S., Rogers, H. B., McKinnon, K. E., Edmonds, M. E., Woodruff, T. K. Engineered reproductive tissues. Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 381-393 (2020).
  5. Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
  6. Eddy, E. M., Kahri, A. I. Cell associations and surface features in cultures of juvenile rat seminiferous tubules. The Anatomical Record. 185 (3), 333-357 (1976).
  7. Dietrich, A., SCholten, R., Vink, A., Oud, J. Testicular cell suspensions of the mouse in vitro. Andrologia. 15, 236-246 (1983).
  8. Champy, C. De la méthode de culture des tissus. VI. Le testicule. Archives de Zoologie Experimentale Generale. 60, 461-500 (1920).
  9. Martinovitch, P. The development in vitro of the mammalian gonad. Ovary and ovogenesis. Proceedings of the Royal Society B of Biological Sciences. 125, 232-249 (1938).
  10. Sato, T., et al. In vitro production of fertile sperm from murine spermatogonial stem cell lines. Nature communications. 2, 472(2011).
  11. Komeya, M., et al. Long-term ex vivo maintenance of testis tissues producing fertile sperm in a microfluidic device. Scientific Reports. 6 (1), 21472(2016).
  12. Sanjo, H., et al. In vitro mouse spermatogenesis with an organ culture method in chemically defined medium. PLoS One. 13 (2), 0192884(2018).
  13. Komeya, M., et al. In vitro spermatogenesis in two-dimensionally spread mouse testis tissues. Reproductive Medicine and Biology. 18 (4), 362-369 (2019).
  14. Reda, A., et al. In vitro differentiation of rat spermatogonia into round spermatids in tissue culture. Molecular Human Reproduction. 22 (9), 601-612 (2016).
  15. Reda, A., et al. Knock-Out Serum Replacement and Melatonin Effects on Germ Cell Differentiation in Murine Testicular Explant Cultures. Annals of Biomedical Engineering. 45 (7), 1783-1794 (2017).
  16. Chapin, R. E., et al. Lost in translation: The search for an in vitro screen for spermatogenic toxicity. Birth Defects Research Part B - Developmental and Reproductive Toxicology. 107 (6), 225-242 (2016).
  17. Portela, J. M. D., et al. Strains matter: Success of murine in vitro spermatogenesis is dependent on genetic background. Developmental Biology. 456 (1), 25-30 (2019).
  18. Gholami, K., et al. The air-liquid interface culture of the mechanically isolated seminiferous tubules embedded in agarose or alginate improves in vitro spermatogenesis at the expense of attenuating their integrity. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 56 (3), 261-270 (2020).
  19. Oakberg, E. F. Duration of spermatogenesis in the mouse and timing of stages of the cycle of the seminiferous epithelium. American Journal of Anatomy. 99 (3), 507-516 (1956).
  20. Amann, R. P. The cycle of the seminiferous epithelium in humans: A need to revisit. Journal of Andrology. 29 (5), 469-487 (2008).
  21. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  22. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125(2014).
  23. Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
  24. Takahashi, T. Organoids for Drug Discovery and Personalized Medicine. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 59, 447-462 (2019).
  25. Alves-Lopes, J. P., Söder, O., Stukenborg, J. B. Testicular organoid generation by a novel in vitro three-layer gradient system. Biomaterials. 130, 76-89 (2017).
  26. Lee, J. H., Kim, H. J., Kim, H., Lee, S. J., Gye, M. C. In vitro spermatogenesis by three-dimensional culture of rat testicular cells in collagen gel matrix. Biomaterials. 27 (14), 2845-2853 (2006).
  27. Zhang, J., Hatakeyama, J., Eto, K., Abe, S. I. Reconstruction of a seminiferous tubule-like structure in a 3 dimensional culture system of re-aggregated mouse neonatal testicular cells within a collagen matrix. General and Comparative Endocrinology. 205, 121-132 (2014).
  28. Vermeulen, M., et al. Development of a Cytocompatible Scaffold from Pig Immature Testicular Tissue Allowing Human Sertoli Cell Attachment, Proliferation and Functionality. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 227(2018).
  29. Baert, Y., et al. Derivation and characterization of a cytocompatible scaffold from human testis. Human Reproduction. 0 (0), 1-12 (2014).
  30. Baert, Y., Rombaut, C., Goossens, E. Scaffold-Based and Scaffold-Free Testicular Organoids from Primary Human Testicular Cells. Methods in Molecular Biology. 1576, 283-290 (2019).
  31. Alves-Lopes, J. P., Söder, O., Stukenborg, J. B. Use of a three-layer gradient system of cells for rat testicular organoid generation. Nature Protocols. 13 (2), 248-259 (2018).
  32. Baert, Y., Dvorakova-Hortova, K., Margaryan, H., Goossens, E. Mouse in vitro spermatogenesis on alginate-based 3D bioprinted scaffolds. Biofabrication. 11 (3), 035011(2019).
  33. Pendergraft, S. S., Sadri-Ardekani, H., Atala, A., Bishop, C. E. Three-dimensional testicular organoid: a novel tool for the study of human spermatogenesis and gonadotoxicity in vitro. Biology of Reproduction. 96 (3), 720-732 (2017).
  34. Sakib, S., et al. Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture. Biology of Reproduction. 100 (6), 1648-1660 (2019).
  35. Cameron, D. F., et al. Formation of Sertoli Cell-Enriched Tissue Constructs Utilizing Simulated Microgravity Technology. Annals of the New York Academy of Sciences. 944 (1), 420-428 (2006).
  36. Strange, D. P., et al. Human testicular organoid system as a novel tool to study Zika virus pathogenesis. Emerging Microbes & Infections. 7 (1), 1-7 (2018).
  37. Edmonds, M. E., Woodruff, T. K. Testicular organoid formation is a property of immature somatic cells, which self-assemble and exhibit long-term hormone-responsive endocrine function. Biofabrication. 12 (4), 045002(2020).
  38. Baert, Y. Primary Human Testicular Cells Self-Organize into Organoids with Testicular Properties. Stem Cell Reports. 8 (1), 30-38 (2017).
  39. Pinto, M. P., Jacobsen, B. M., Horwitz, K. B., Maggiolini, M. An immunohistochemical method to study breast cancer cell subpopulations and their growth regulation by hormones in three-dimensional cultures. Front Endocrinol (Lausanne). 2, 15(2011).
  40. Brinster, R. L. Germline stem cell transplantation and transgenesis. Science. 296 (5576), New York, N.Y. 2174-2176 (2002).
  41. Hue, D., et al. Meiotic Differentiation of Germinal Cells in Three-Week Cultures of Whole Cell Population from Rat Seminiferous Tubules. Biology of Reproduction. 59 (2), 379-387 (1998).
  42. Zhou, Q., et al. Complete Meiosis from Embryonic Stem Cell-Derived Germ Cells in Vitro. Cell Stem Cell. 18 (3), 330-340 (2016).
  43. Kanatsu-Shinohara, M., et al. Long-Term Proliferation in Culture and Germline Transmission of Mouse Male Germline Stem Cells. Biology of Reproduction. 69 (2), 612-616 (2003).
  44. Helsel, A. R., Oatley, M. J., Oatley, J. M. Glycolysis-Optimized Conditions Enhance Maintenance of Regenerative Integrity in Mouse Spermatogonial Stem Cells during Long-Term Culture. Stem Cell Reports. 8 (5), 1430-1441 (2017).
  45. Sato, T., et al. In vitro spermatogenesis in explanted adult mouse testis tissues. PLoS One. 10 (6), 0130171(2015).
  46. Xiao, S., et al. A microfluidic culture model of the human reproductive tract and 28-day menstrual cycle. Nature Communications. 8 (1), 1-13 (2017).
  47. Skardal, A., et al. Drug compound screening in single and integrated multi-organoid body-on-a-chip systems. Biofabrication. 12 (2), 025017(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

ECM kweek2D ECM vrij3D ECM vrijcellulaire zelfassemblageSertoli cellenLeydig cellenkiemcellenperitubulaire cellenweefselarchitectuur

Gerelateerde artikelen