Extra Cellular Matrix-based en extra cellular matrix-vrije generatie van Murine Testiculaire Organoïden

Summary

Hier worden vier methoden beschreven voor het genereren van testiculaire organoïden uit primaire neonatale murine-testiculaire cellen, d.w.z. extracellulaire matrix (ECM) en ECM-vrije 2D- en 3D-cultuuromgevingen. Deze technieken hebben meerdere onderzoekstoepassingen en zijn vooral nuttig voor het bestuderen van testiculaire ontwikkeling en fysiologie in vitro.

Abstract

Testiculaire organoïden bieden een hulpmiddel voor het bestuderen van testiculaire ontwikkeling, spermatogenese, en endocrinologie in vitro. Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om testiculaire organoïden te maken. Veel van deze methoden vertrouwen op extracellulaire matrix (ECM) ter bevordering van de novo weefselassemblage, maar er zijn verschillen tussen methoden in termen van biomimetische morfologie en functie van weefsels. Bovendien zijn er weinig directe vergelijkingen van gepubliceerde methoden. Hier wordt een directe vergelijking gemaakt door verschillen in organoïde generatieprotocollen te bestuderen, met verstrekte resultaten. Vier archetypische generatiemethoden: (1) 2D ECM-vrij, (2) 2D ECM, (3) 3D ECM-vrij en (4) 3D ECM-cultuur worden beschreven. Drie primaire benchmarks werden gebruikt om de testiculaire organoïde generatie te beoordelen. Dit zijn cellulaire zelfassemblage, opname van grote celtypen (Sertoli, Leydig, kiem, en peritubulaire cellen), en adequaat gecompartimenteerde weefselarchitectuur. Van de vier geteste omgevingen genereerden 2D ECM- en 3D ECM-vrije culturen organoïden met interne morfologieën die het meest lijken op inheemse teelballen, waaronder de de novo compartimentering van buisvormige versus interstitiële celtypen, de ontwikkeling van tubule-achtige structuren en een gevestigde langdurige endocriene functie. Alle bestudeerde methoden gebruikten ongesorteerde, primaire murine testiculaire celsuspensies en gebruikten algemeen toegankelijke kweekmiddelen. Deze testiculaire organoïde generatietechnieken bieden een zeer toegankelijke en reproduceerbare toolkit voor onderzoeksinitiatieven op het gebied van testiculaire organogenese en fysiologie in vitro.

Introduction

Testiculaire organoïden zijn een baanbrekende techniek voor het bestuderen van testiculaire ontwikkeling, spermatogenese en fysiologie in vitro^1,2,3,4. Verschillende methoden zijn onderzocht voor organoïde generatie; deze omvatten een verscheidenheid aan extracellulaire matrix (ECM) en ECM-vrije kweeksystemen, zowel in tweedimensionale (2D) als in driedimensionale (3D) oriëntaties. Verschillende generatiemethoden kunnen verschillende cellulaire assemblagestrategieën bevorderen; dit resulteert in een hoge mate van morfologische en functionele....

Protocol

Alle muis experimenten werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Northwestern University, en alle procedures werden uitgevoerd onder IACUC-goedgekeurde protocollen.

1. Bereiding van enzymatische oplossingen voor weefselesociatie

1. Gebruik twee verschillende enzymatische oplossingen (Solution 1 en Solution 2), beide gemaakt met behulp van een basale cultuur medium oplossing (BM).
2. Voeg voor de voorbereiding van BM serum en penicilline-streptomycine toe aan minimale essentiële medium tot eindconcentraties van respectievelijk 10% en 1% (zie tabel met materialen voor ....

Results

Organoïde generatie werd beschouwd als niet succesvol als testiculaire cellen niet zelf assembleren binnen 72 uur van de cultuur, echter, alle methoden hier gepresenteerd verzamelen binnen 24 uur bij het gebruik van jonge (5 dpp) murine cellen. Falen van biologische constructgeneratie gepresenteerd als een voortzetting van vrij zwevende cellen (0 h kolom in figuur 1) zelfs na uitgebreide cultuur (72 h). Bij afwezigheid van zelfassemblage van weefsel, alle schijnbare celclusters gemakkelijk v.......

Discussion

Met de voltooiing van dit organoïde generatieprotocol heeft de gebruiker vier verschillende cultuurtechnieken tot hun beschikking voor het assembleren van testiculaire constructies en organoïden in ECM- of ECM-vrije omgevingen. Belangrijk is dat alle vier de methoden de onderzoeker in staat stellen om organoïde zelfassemblage in de loop van de tijd niet te observeren door middel van time-lapse beeldvorming of video-opname, en om niet-invasief geconditioneerde media te verzamelen voor analyse van uitgescheiden hormonen en.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 um Media Sterile Filters	Millipore Sigma	scgpu05re	For sterile filtering media
3βHSD primary antibody	Cosmo Bio Co	K0607	Leydig cell marker, 1:500 dilution
AlexaFluor 568 α-Mouse	Thermo Fisher Scientific	A-21202	Fluorescence-tagged secondary antibody
AlexaFluor 568 α-Rabbit	Thermo Fisher Scientific	A10042	Fluorescence-tagged secondary antibody
Alpha Minimum Essential Medium	Thermo Fisher Scientific	11-095-080	Base of culture media
Collagenase I	Worthington Bio	LS004197	For dissociation solution 1
Corning Matrigel Membrane Matrix, LDEV-free	Corning	354234	Extracellular matrix used for casting 2D and 3D ECM culture gels
Countess Cell counter	Thermo Fisher Scientific	C10227	Autmated cell counter (hemacytometer machine)
Countess Cell Counting Chamber Slides	Thermo Fisher Scientific	C10228	Hemacytometer slide for use with Countess automated counter
DDX4 primary antibody	Abcam	138540	Spermatogonia marker, 1:500 dilution
Deoxyribonuclease I (2,280 u/mgDW)	Worthington Bio	LS002140	For dissociation solution 1
DPBS 1X, + CaCl + MgCl	Thermo Fisher Scientific	14040182	For reconstituting Hyaluronidase
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline +Ca/+Mg	Thermo Fisher Scientific	14040117	PBS
Embryo Grade H2O	MIllipore Sigma	W1503	For reconstituting Collagenase I and Dnase I
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	16000044	For quencing enzyme dissocation solutions
Follicle stimulating hormone	Abcam	ab51888	For long-term organoid culture
Human chorionic gonadotropin	Millipore Sigma	C1063	For long-term organoid culture
Hyaluronidase, from bovine testes	Millipore Sigma	H4272	For dissociation solution 2
Inhibin B Enzyme-linked Immunosorbent Assay	Ansh Labs	AL-107	Inhibin B ELISA Kit
KnockOut Serum Replacement	Thermo Fisher Scientific	10828-028	Serum source for Basal media
MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids (24-35, 5x7 array)	Millipore Sigma	Z764051	For 3D ECM-Free organoid fabrication
Nunc, Lab Tek II Chamber Slide System, 4-well	Thermo Fisher Scientific	12-565-7	For 2D ECM-free, and 2D, 3D ECM culture
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15-140-122	Antibiotic for media
Richard-Allan Scientific; Histogel, Specimen processing gel	Thermo Fisher Scientific	HG-4000-012	For aiding paraffin embedding
SOX9 primary antibody	Millipore Sigma	AB5535	Sertoli Marker, 1:500 dilution
Tedklad Global Mouse Chow (Breeder)	Teklad Global	2920	Mouse food without phytoestrogens
Tedklad Global Mouse Chow (Maintenance)	Teklad Global	2916	Mouse food without phytoestrogens
Testosterone Enzyme-linked Immunosorbent Assay	Calbiotech	TE373S	Testosterone ELISA Kit
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250061	For cell counting
αSMA primary antibody	Millipore Sigma	A2547	Peritubular marker, 1:500 dilution
βCatenin primary antibody	BD Biosciences	610154	Sertoli Cytoplasm marker, 1:100 dilution