Generatie en kwantitatieve karakterisering van functionele en gepolariseerde galeelcyten

Summary

Driedimensionale (3D) cellulaire systemen zijn relevante modellen voor het onderzoeken van organogenese. Een hydrogel-gebaseerde methode voor biliaire cysten productie en hun karakterisering wordt voorgesteld. Dit protocol ontrafelt de barrières van 3D-karakterisering, met een eenvoudige en betrouwbare methode om de efficiëntie, maten en grootte van cystevorming te beoordelen en hun functionaliteit te testen.

Abstract

Cholangiocyten, de epitheelcellen die de galwegen in de lever line-up, toezicht houden op galvorming en modificatie. In de afgelopen twintig jaar zijn in de context van leverziekten 3-dimensionale (3D)-modellen op basis van cholangiocyten ontstaan, zoals cysten, sferoïden of buisachtige structuren om weefseltopologie na te bootsen voor organogenese, ziektemodellering en onderzoeken naar geneesmiddelenscreening. Deze structuren zijn voornamelijk verkregen door het inbedden van cholangiocyten in een hydrogel. Het belangrijkste doel was om zelforganisatie te bestuderen door epitheliale polariteit, functionele en morfologische eigenschappen aan te pakken. Echter, zeer weinig studies richten zich op cyste vorming efficiëntie. Wanneer dit het geval is, wordt de efficiëntie vaak gekwantificeerd uit afbeeldingen van een enkel vlak. Functionele testen en structurele analyse worden uitgevoerd zonder de potentiële heterogeniteit van cystedistributie als gevolg van hydrogelpolymerisering heterogeniteiten en bijwerkingen weer te vertegenwoordigen. Daarom kan de kwantitatieve analyse, wanneer gedaan, niet worden gebruikt voor vergelijking van het ene artikel naar het andere. Bovendien staat deze methode geen vergelijkingen toe van 3D-groeipotentieel van verschillende matrices en celtypen. Bovendien is er geen melding gemaakt van de experimentele probleemoplossing voor immunostaining cysten. In dit artikel bieden we een betrouwbare en universele methode om aan te tonen dat de initiële celverdeling gerelateerd is aan de heterogene verticale verdeling van cystevorming. Cholangiocyte cellen ingebed in hydrogel worden gevolgd met Z-stacks analyse langs de hydrogel diepte in de tijd van 10 dagen. Met deze methode wordt een robuuste kinetiek van cystevormingsefficiëntie en -groei verkregen. We presenteren ook methoden om cyste polariteit en secretoire functie te evalueren. Tot slot worden aanvullende tips gegeven voor het optimaliseren van immunostaining protocollen om cyste-instorting voor beeldvorming te beperken. Deze aanpak kan worden toegepast op andere 3D-celkweekstudies, waardoor de mogelijkheden worden geopend om het ene systeem met het andere te vergelijken.

Introduction

In de afgelopen drie decennia is het gebied van in vitro onderzoek gevorderd in de richting van 3D-cultuursystemen. Er zijn een aantal protocollen opgedoken voor het kweken van cellen in 3D als sferoïden of aggregaten in aanwezigheid of afwezigheid van een steiger/matrix, in een druppel, in agitatie, in microfluïde apparaten of drijvend¹. Het gebruik van 3D-cultuurmethoden heeft zijn voordelen bewezen ten opzichte van 2-dimensionale (2D) culturen, met name voor epitheliale cellen, waarvan werd aangetoond dat ze zichzelf organiseren in 3D-structuren, cysten of acini. In dit geval vormen de cellen een monolaag die een lumen omringt, waar cellen h....

Protocol

1. Generatie van cysten

OPMERKING: Dit protocol kan worden uitgevoerd met elk type hydrogel, als de gelatie het mogelijk maakt inbedding van cellen.

1. Hydrogel coating
   OPMERKING: Een goede hydrogelcoating van de kamerdia is een kritieke stap om de vorming van 2D-cellagen op de bodem van de put te voorkomen, die de daaropvolgende cystebeeldvorming kunnen verstoren en de berekening van cystevormingsefficiëntie kunnen aantasten.
   1. Om de homogeniteit van de geloplossing te garanderen, ontdooit u de hydrogel 's nachts bij 4 °C (O/N).
   2. Precool pipettips op ijs of O/N bij -20 °C en een 8-put kamer schuif bij -20 °C O/N.<....

Results

Vorming en karakterisering van cysten
3D-celkweeksystemen zijn een belangrijk instrument om organogenese en ziektemodellering te bestuderen²⁵. Helaas zijn de meeste van deze methoden kwalitatieve of gebruik interne kwantificering uitgevoerd op een enkel vlak door het vergelijken van het aantal cysten versus niet-cysten, in variabele en vaak niet-gespecificeerde volumes, het voorkomen van een vergelijking in termen van cyste vorming efficiëntie tussen de verschillende studies

Discussion

Om organogenese en het onderhoud van 3D cellulaire structuren te bestuderen, zijn verschillende weefsels gemodelleerd, met behulp van verschillende cellulaire oorsprong, maar ook verschillende soorten extracellulaire matrices, waaronder synthetische hydrogels^8,9,10,21. Echter, als gevolg van gebrek aan 3D kwantitatieve analyse die het mogelijk maakt voor vergelijkingen tussen methoden in termen.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 µl- Pipette Eppendorf Research Plus	Thermo Fisher Scientific	3120000020
100 µl - Pipette Eppendorf Research Plus	Thermo Fisher Scientific	3120000046
1000 µl - Pipette Eppendorf Research Plus	Thermo Fisher Scientific	3120000062
1X PBS	Thermo Fisher Scientific	14190-094
200 µl - Pipette Eppendorf Research Plus	Thermo Fisher Scientific	3120000054
3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt	Sigma-Aldrich	T5516	NRC complete medium final concentration = 3.4 µg/mL
Acetic acid	VWR	20104-298	0.02N final
Aerosol barrier pipettes tips 10 µl (Fisherbrand)	Thermo Fisher Scientific	2707439
Aerosol barrier pipettes tips 1000 µl (Fisherbrand)	Thermo Fisher Scientific	2707404
Aerosol barrier pipettes tips 200 µl (Fisherbrand)	Thermo Fisher Scientific	2707430
Antibiotic Antimicotic Solution (100X)	Sigma-Aldrich	A5955	NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution
Bovine pituitary extract	Thermo Fisher Scientific	13028-014	NRC complete medium final concentration = 30 µg/mL
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A2153	1:1000 dilution
Chemically Defined Lipid Concentrate (100X)	Thermo Fisher Scientific	11905-031	NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution
Collagen high concentration, rat tail	Thermo Fisher Scientific	354249	50 µg/mL final concentration
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902	NRC complete medium final concentration = 0.393 µg/mL
DMEM F12	Thermo Fisher Scientific	21331-020	NRC complete medium final concentration = 1X
E-cadherin Rabbit anti-Human, Rat, Polyclonal	Thermo Fisher Scientific	PA5-32178	1:400 dilution
Eclipse TE300 inverted microscope	Nikon		imaging
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	E9508	NRC complete medium final concentration = 0.32 mM
Fetal calf serum	Thermo Fisher Scientific	10270-106	NRC complete medium final concentration = 5:100 dilution
Fluoroshield with DAPI (Mounting medium)	Sigma-Aldrich	F6057
Formaldehyde 16% (W/V)	Thermo Fisher Scientific	28906	4% (W/V)
Goat serum	Thermo Fisher Scientific	16210-064	1:10 dilution
Hamamatsu camera (Digital camera C11440 ORCA - flash 4.OLT)	Hamamatsu		imaging
Hoechst 33258	Sigma-Aldrich	B1155	5 µg/mL final concentration
IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor Plus 647	Thermo Fisher Scientific	A32733	1:500 dilution
ImageJ version 2.0.0-rc-69/1.52n			Open source image processing software
Insulin-Transferrin-Selenium (100X)	Thermo Fisher Scientific	51300-044	NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution
L-Glutamine (100X)	Thermo Fisher Scientific	25030-024	NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution
Matrigel GFR (stock concentration 9.7 mg/mL)	Thermo Fisher Scientific	356231	4:10 dilution
NIS Elements software version 4.50.00	Nikon		image acquisition and display
Non-Essential-Amino-Acids-Solution (100X)	Thermo Fisher Scientific	11140-035	NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution
Objective Plan Fluor 10X/0.30 Ph1 DL (∞/1.2 WD 15.2)	Nikon
Prolong Gold Antifade Reagent	Thermo Fisher Scientific	P36931
Propidium Iodide (PI)	Sigma-Aldrich	P4170	20 µg/mL final concentration
Rhodamine Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	R415	16.2 nM final concentration
Sir-Actin / Verapamil kit	Spirochrome	SC001	10 µM final concentration
Soybean trypsin inhibitor	Thermo Fisher Scientific	17075-029	NRC complete medium final concentration = 50 µg/mL
Sterile cell strainer 40 µm (Fisherbrand)	Thermo Fisher Scientific	22363547
Sterile pipettes 10 mL (Fisherbrand)	Thermo Fisher Scientific	1367811E
Sterile pipettes 5 mL (Fisherbrand)	Thermo Fisher Scientific	1367811D
Sterile tubes 1.5 mL (Fisherbrand)	Thermo Fisher Scientific	11926955
Sterile tubes 15 mL (Fisherbrand)	Thermo Fisher Scientific	7200886
Sterile tubes 50 mL (Fisherbrand)	Thermo Fisher Scientific	553913
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	5:100 dilution
Tissue culture treated flask 25cm2 (Falcon)	Thermo Fisher Scientific	353108
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	5:1000 dilution
Trypsin-EDTA (0.05%) phenol red	Thermo Fisher Scientific	25300-054	1X
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379	5:10000 dilution
Vitamin (100X)	Thermo Fisher Scientific	11120-037	NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution
μ-Slide 8 Well ibiTreat, Ibidi	Clinisciences	80826