Generatie en kwantitatieve karakterisering van functionele en gepolariseerde galeelcyten

Summary

Driedimensionale (3D) cellulaire systemen zijn relevante modellen voor het onderzoeken van organogenese. Een hydrogel-gebaseerde methode voor biliaire cysten productie en hun karakterisering wordt voorgesteld. Dit protocol ontrafelt de barrières van 3D-karakterisering, met een eenvoudige en betrouwbare methode om de efficiëntie, maten en grootte van cystevorming te beoordelen en hun functionaliteit te testen.

Abstract

Cholangiocyten, de epitheelcellen die de galwegen in de lever line-up, toezicht houden op galvorming en modificatie. In de afgelopen twintig jaar zijn in de context van leverziekten 3-dimensionale (3D)-modellen op basis van cholangiocyten ontstaan, zoals cysten, sferoïden of buisachtige structuren om weefseltopologie na te bootsen voor organogenese, ziektemodellering en onderzoeken naar geneesmiddelenscreening. Deze structuren zijn voornamelijk verkregen door het inbedden van cholangiocyten in een hydrogel. Het belangrijkste doel was om zelforganisatie te bestuderen door epitheliale polariteit, functionele en morfologische eigenschappen aan te pakken. Echter, zeer weinig studies richten zich op cyste vorming efficiëntie. Wanneer dit het geval is, wordt de efficiëntie vaak gekwantificeerd uit afbeeldingen van een enkel vlak. Functionele testen en structurele analyse worden uitgevoerd zonder de potentiële heterogeniteit van cystedistributie als gevolg van hydrogelpolymerisering heterogeniteiten en bijwerkingen weer te vertegenwoordigen. Daarom kan de kwantitatieve analyse, wanneer gedaan, niet worden gebruikt voor vergelijking van het ene artikel naar het andere. Bovendien staat deze methode geen vergelijkingen toe van 3D-groeipotentieel van verschillende matrices en celtypen. Bovendien is er geen melding gemaakt van de experimentele probleemoplossing voor immunostaining cysten. In dit artikel bieden we een betrouwbare en universele methode om aan te tonen dat de initiële celverdeling gerelateerd is aan de heterogene verticale verdeling van cystevorming. Cholangiocyte cellen ingebed in hydrogel worden gevolgd met Z-stacks analyse langs de hydrogel diepte in de tijd van 10 dagen. Met deze methode wordt een robuuste kinetiek van cystevormingsefficiëntie en -groei verkregen. We presenteren ook methoden om cyste polariteit en secretoire functie te evalueren. Tot slot worden aanvullende tips gegeven voor het optimaliseren van immunostaining protocollen om cyste-instorting voor beeldvorming te beperken. Deze aanpak kan worden toegepast op andere 3D-celkweekstudies, waardoor de mogelijkheden worden geopend om het ene systeem met het andere te vergelijken.

Introduction

In de afgelopen drie decennia is het gebied van in vitro onderzoek gevorderd in de richting van 3D-cultuursystemen. Er zijn een aantal protocollen opgedoken voor het kweken van cellen in 3D als sferoïden of aggregaten in aanwezigheid of afwezigheid van een steiger/matrix, in een druppel, in agitatie, in microfluïde apparaten of drijvend¹. Het gebruik van 3D-cultuurmethoden heeft zijn voordelen bewezen ten opzichte van 2-dimensionale (2D) culturen, met name voor epitheliale cellen, waarvan werd aangetoond dat ze zichzelf organiseren in 3D-structuren, cysten of acini. In dit geval vormen de cellen een monolaag die een lumen omringt, waar cellen hun volledige epitheliale fenotype verwerven met verbeterde fysiologische specifieke functies².

Talrijke studies hebben bijgedragen aan de ontwikkeling van methoden voor de vorming van deze epitheliale organoïden in natuurlijke matrices. Dit heeft het mogelijk om te recapituleren in vivo cel-cel en cel-micro-omgeving interacties, om de oprichting en de stabiliteit van de epitheel fenotype^3,4,5,6,7. Onlangs, en met name met het oog op de ontwikkeling van transplanteerbare organoïden en het ontcijferen van de eis van de micro-omgeving voor het orkestreren van het epitheliale programma, synthetische hydrogels zijn ontwikkeld om de vorming van epitheel acini^8,9,10te verbeteren . Helaas rapporteren deze studies over kwalitatieve gegevens, of presenteren ze berekeningsmethoden met behulp van interne referenties, zoals de verhouding tussen cysten en niet-cysten in een 2D-vlak^8,9,10. Dit sluit elke vergelijking tussen verschillende studies in termen van efficiëntie, stabiliteit, of morfologische en fysiologische karakterisering van de epitheel organoïden.

Micro-inkapseling van epitheelcellen in kralen met behulp van microfluïde apparaten heeft gezorgd voor meer realistische kwantitatieve en vergelijkende resultaten. Met behulp van deze technologie werden organoïden van verschillende celtypen gevormd en gedifferentieerd op basis van de morfologie tussen verschillende 3D cellulaire structuren^11,12. Deze technologie is echter niet eenvoudig om mee te werken en vereist het gebruik van schone ruimten om de microfluïde apparaten te produceren. Deze technologie is opgezet voor een paar soorten hydrogels, maar vereist technische aanpassing toe te passen aan andere hydrogels, het beperken van de veelzijdigheid. Daarom zijn de meeste studies bedoeld om epitheliale organoïden te ontwikkelen afhankelijk van de inbedding van epitheliale cellen in een hydrogel bulk. Bij deze methoden wordt de hoge heterogeniteit van gelstructuratie en celverdeling in de hele 3D-cultuur vaak verwaarloosd. Daarom hebben de meeste analyses betrekking op enkele 2D-beelden, die slechts zeer ruwweg de verdeling van de verschillende cellulaire objecten in het hele 3D-volume vertegenwoordigen.

Ziekten die galwegen beïnvloeden, zoals cholangiocarcinoom, galatresie, primaire sclerosing cholangitis, onder andere, zijn een belangrijke oorzaak van mortaliteit en morbiditeit. Behalve voor levertransplantatie, zijn er geen effectieve behandelingen voor deze aandoeningen¹³. Inspanningen om galkanaalvorming, ziekteoorzaken en progressie te onderzoeken, zullen de ontwikkeling van nieuwe therapieën mogelijk maken¹⁴.

Biliaire organotypic modellen van cysten, sferoïden of buisachtige structuren met behulp van normale of patiënt-afgeleide, gedifferentieerde, of voorloper afgeleide cholangiocyten cellijnen zijn ontwikkeld^{15,16,17,18,19,20}. Verschillende studies hebben samengevat cholangiocyte polariteit, expressie van cholangiocyte markers, aanwezigheid van trilharen, cholangiocyte secretory en reabsorptief vermogen, en lumen vorming en obstructie; die allemaal belangrijke kenmerken van cholangiocyten fenotype, morfologie en functie^15,17,19vertegenwoordigen . Anderen hebben gemeld onderhoud van patiënt-afgeleide galorganoïden voor langere tijd²⁰. Onlangs onderzochten we de rol van biochemische en biofysische signalen op galcysten organogenese²¹. Belangrijk is dat de pathogenese van galatresie werd bestudeerd in galvormige sferoïden en buizen^7,22. Bovendien werden de belangrijkste kenmerken van primaire scleroserende cholangitis zoals cholangiocytenscentie, afscheiding van pro-inflammatoire cytokinen en macrofaagwerving met succes onderzocht met behulp van galsferoïden^15,20. Echter, reproduceerbare in vitro 3D kwantitatieve modellen die fysiologisch moduleren cholangiocyte fenotype, fysiologie, en micro-omgeving waar deze vragen kunnen worden aangepakt zijn nog steeds nodig. Bovendien hebben slechts weinig publicaties melding gemaakt van cystevorming efficiëntie^21,23. Dit is een belangrijk punt vast te stellen, met name bij het onderzoeken van organogenese, ziekte oorzaak, en correlatie van de reacties van geneesmiddelen met cholangiocyte functie en polarisatie. Bovendien, met verschillen in steiger / matrix gebruikt van protocol tot protocol, is het moeilijk te vergelijken tussen systemen. Om deze problemen op te lossen, stellen we een kwantitatieve, betrouwbare en universele methode voor om galcysten te genereren die de vorming van lumen, cholangiocytepolarisatie en cholangiocytensecretoire functie nabootsen. Belangrijk is dat we een systematische analyse presenteren die langs de Z-as over de 3D-gel wordt uitgevoerd bij de evaluatie in de tijd, cystevormingsefficiëntie, grootte, levensvatbaarheid, polarisatie en functionaliteit. Verder gebruikten we een natuurlijke hydrogel en normale rattencholangiocyten (NRC)s, als voorbeeld voor het protocol, maar andere natuurlijke of synthetische hydrogels, evenals epitheelcellen kunnen worden gebruikt voor de vorming van 3D-cystische structuren.

Protocol

1. Generatie van cysten

OPMERKING: Dit protocol kan worden uitgevoerd met elk type hydrogel, als de gelatie het mogelijk maakt inbedding van cellen.

1. Hydrogel coating
   OPMERKING: Een goede hydrogelcoating van de kamerdia is een kritieke stap om de vorming van 2D-cellagen op de bodem van de put te voorkomen, die de daaropvolgende cystebeeldvorming kunnen verstoren en de berekening van cystevormingsefficiëntie kunnen aantasten.
   1. Om de homogeniteit van de geloplossing te garanderen, ontdooit u de hydrogel 's nachts bij 4 °C (O/N).
   2. Precool pipettips op ijs of O/N bij -20 °C en een 8-put kamer schuif bij -20 °C O/N.
   3. Plaats de hydrogel en de 8-well kamer glijbaan op een ijsemmer gevuld met ijs.
   4. Bereid in een conische buis van 15 mL een oplossing met 40% hydrogel (V/V) in koud NRC compleet medium (zie Tabel van Materialen)en plaats de buis op ijs.
   5. Om een kamerglijbaan te coaten, met behulp van koude pipettips, voeg je 50 μL hydrogeloplossing toe aan het midden van elke put en verspreid over het hele oppervlak met behulp van een pipetpunt, terwijl je de kamerglijbaan op ijs houdt(figuur 1A).
      LET OP: Spreid de hydrogeloplossing zo gelijkmatig mogelijk uit om bellen te vermijden.
   6. Om de hydrogel te polymeriseren, moet de schuifruimte minstens 15 minuten bij 37 °C, 5% CO_{2 uitbroeden.}
2. Celvoorbereiding
   1. Verwarm NRC complete medium, fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en trypsine-ethyleenediamine tetraatisch zuur (trypsine-EDTA) in een waterbad voorverwarmd tot 37 °C.
   2. Terwijl de hydrogel polymeriseert, moet u ervoor zorgen dat NRC's tot 70% samenvloeiing worden geteeld in een kolf met collageencoating van²⁵ cm^{2 .} Was de cellen één keer met voorverwarmde 1x PBS.
   3. Broed de NRC's uit met 5 ml voorverwarmde 1x PBS (voor een T-25 cm² kolf) gedurende 20 minuten bij 37 °C, 5% CO₂.
      OPMERKING: Deze stap, die de incubatietijd verkort met trypsin-EDTA is instrumenteel in het behouden van de zelforganiserende eigenschappen van cellen.
   4. Gooi de PBS weg, voeg 1 mL trypsin-EDTA toe en broed gedurende 5-10 min bij 37 °C, 5% CO₂.
   5. Neutraliseren met 4 mL van voorverwarmd compleet NRC-medium. Verzamel en breng de celsuspensie over in een conische buis van 15 mL en draai gedurende 4 minuten op 150 x g.
   6. Gooi het medium weg en verhoog de celpellet opnieuw in 5 mL voorverwarmd medium.
   7. Met behulp van een 40 μm celzeef filtert u de celoplossing in een conische buis van 50 mL en tel de cellen.
      OPMERKING: Het doorgeven van de cellen door een zeef is een kritieke stap voor de kwantitatieve resultaten reproduceerbaar te zijn, dat wil zeggen, om bijna dezelfde grootte van cel aggregaten worden ingebed.
3. Inbedding van celsuspensie in hydrogeloplossing
   1. Bereid een oplossing voor van 1.600 μL van 80% hydrogel (V/V) in koud compleet NRC-medium (buis 1); in het ijs te houden. Verdun 5 x 10⁵ cellen/mL in 1.600 μL koud volledig NRC-medium (buis 2) en houd in ijs.
      OPMERKING: Deze stap moet snel worden uitgevoerd om polymerisatie van de hydrogel te voorkomen terwijl deze wordt gemengd met de celsuspensie en om de levensvatbaarheid van de cel te behouden.
   2. Om een celzaaioplossing van 2,5 x 10⁵ cellen/mL in 40% hydrogel (V/V) voor te bereiden, meng buis 1 en buis 2. Voeg 400 μL van de celoplossing toe aan elke put van de met hydrogel gecoate kamerglijbaan die bellen vermijdt (figuur 1B).
   3. Houd de schuifruimte in een couveuse op 37 °C met 5% CO₂ tot de media veranderen.
   4. Na 2 dagen in cultuur, verwijder 250 μL van het medium uit een hoek van elke put, wees voorzichtig om de hydrogel niet uit te pipetten. Voeg vervolgens langzaam 250 μL van het kweekmedium toe. Verander het medium om de 2 dagen.
      OPMERKING: Minimaliseer de beweging van de kamerglijbaan, vooral tijdens de cyste-initiatie.

2. Cystkwantificering

1. Cyste beeldvorming
   OPMERKING: Deze sectie moet snel worden uitgevoerd om de levensvatbaarheid van de cel niet in gevaar te brengen als de microscoop niet is uitgerust met een verwarmingskamer om CO₂ en temperatuur te regelen. Om een consistente kwantificering te garanderen, representatief voor de cystenverdeling in het volledige hydrogelvolume, worden cysten afgebeeld via fasecontrastmicroscopie en seriële beeldvorming (Z-stacks), met vooraf gedefinieerde parameters in verschillende tijdstippen.
   1. Neem een Z-stack langs de diepte van de hydrogel voor elk tijdstip(figuur 1C, D). In dit voorbeeld worden Z-stacks genomen op de dagen 1, 2, 4, 7 en 10.
      OPMERKING: Controleer of de initiële celverdeling uniform is in de hydrogel om de toepasbaarheid van deze methode te garanderen.
      1. Met een fase-contrastmicroscoop uitgerust met een beeldacquisitiesoftware, selecteert u de 10x objectieve vergroting in het handmatige neus-stuk padvenster (figuur 2B(1)).
      2. Schakel de witte lamp in en selecteer de brightfield-weergaveoptie.
      3. Schakel de camera in door de knopAfspelenin het submenu van de balk te selecteren. Focus op een gebied van cysten en stel de belichtingstijd in(figuur 2B(2)). Open het venster Automatisch vastleggen van afbeeldingen voor een automatische besparing van afbeeldingen(figuur 2B(3).
      4. Open het capture Z-serie venster en definieer met de Z schroef de boven- en onderkant van de Z-stack (dezelfde XY coördinaten, maar verschillende Z gescreend). Pas de Z-stap aan afhankelijk van de doelstelling, het resolutieniveau en druk op de knop "Nu uitvoeren" om de overname te starten (figuur 2B(4).
         OPMERKING: In dit voorbeeld worden cysten verspreid over een hydrogeldikte van 520 μm. 26 beelden worden langs de hydrogeldiepte verworven met een interval van 20 μm Z-stap. Afhankelijk van het doel moet de Z-stap worden aangepast om geen cyste te missen en om de detectie van enkele cellen en aggregaten te garanderen.
      5. Neem minstens 3 niet-overlappende Z-stacks per put.
         OPMERKING: Deze bemonstering is noodzakelijk wanneer cysten, zoals in dit voorbeeld, talrijker zijn in de diepte van de gel dan aan de randen als gevolg van heterogeniteiten in de hydrogelpolymeerisatie.
      6. Om een representatieve gegevensset te laten herhalen stap 2.1.1.5. voor 3 putten in totaal.
         OPMERKING: De heterogene verdeling van cysten is afhankelijk van het type hydrogel, de polymerisatie en de cellijn. Gezien drie Z-stacks per put en drie putten per experiment, zijn minimaal 200 cysten afgebeeld over negen Z-stacks om cystevorming en cystegroei op elk moment te karakteriseren.
2. Beeldverwerking
   OPMERKING: In een hydrogel kunnen NRC's worden gevonden als enkele cellen, cysten of aggregaten. Cysten worden geïdentificeerd door de aanwezigheid van een ronde en dunne contrasterende celshell die een lumen omsluit, terwijl celaggregaten een onregelmatige vorm vertonen en geen lumen hebben. Aggregaten en enkele cellen hebben een dichte en contrasterende uitstraling(figuur 3B( 4)).
   1. Open de Fiji-software, open de Z-stack en ga naar het Fiji-menu en klik op Bestand | Openen (Aanvullendefiguur 1). Selecteer de Z-stack die u wilt analyseren. Selecteer indien nodig de optie" Virtuele stapel"en klik op' Ja' voor opening (figuur 3A(1).
   2. Dupliceer de stapel via afbeelding | Dupliceren. Klik op het vak "Dubbele stapel" en klik op "OK" ( Aanvullendefiguur 2).
      OPMERKING: In dit voorbeeld zijn Z-stacks in .nd2-bestandsindeling gecodeerd in 16 bits.
   3. Maak een minimale intensiteitsprojectie van de gedupliceerde stapel. Ga naar het menu Afbeelding | Stapels | Z Project. Selecteer Projectietype "Min Intensiteit" en klik op "OK" (Figuur 3A(2)(Aanvullende figuur 3).
   4. Trek de achtergrond van de projectie af. Ga naar het menu Proces | Achtergrond aftrekken. Typ 500,0 pixels met een rolballenstraal en klik op "lichte achtergrond" om cysten meer contrasterend te maken dan de achtergrond (figuur 3A(3)(Aanvullende figuur 4).
      OPMERKING: De straal van de rollende bal definieert de grootte van het gebied waarop achtergrondaftrekken wordt gebruikt. Deze parameter moet zijn ingesteld op de grootte van het grootste object dat u wilt identificeren.
   5. Als contrastverbetering nodig is, gaat u naar het menu Afbeelding | Aanpassen | Helderheid/contrast | Auto | Solliciteer. Fiji optimaliseert automatisch de helderheid en het contrast. In (Figuur 3A(3)werden de lagere en bovenste grijze waarden vastgesteld op respectievelijk 49702 en 65452 (aanvullende figuur 5).
      OPMERKING: Als de projectie niet is gekalibreerd, gaat u naar het menu Analyseren | Stel schaal in en typ de bijbehorende kalibratie μm/pixelverhouding (Aanvullende figuur 6).
3. Cyst counting en cyste grootte metingen
   1. Om de geschatte cystediameter te meten, selecteert u het gereedschap Rechte lijn in het Fiji-menu en trekt u een lijn over de diameter van elke cyste op de uiteindelijke projectie(figuur 3B(4). Voeg de nieuwe regio van belang (ROI) die voor elke cyste is gemaakt toe aan de ROI-manager: druk op de "t" snelkoppeling op het toetsenbord voor het sneller tellen en openen van de ROI-manager. Klik op" Alles weergeven "om de getelde cysten te zien ( Aanvullende figuur7)
   2. Controleer of er geen cyste is achtergelaten zonder te tellen door de ingestelde ROI's uit de projectie op de Z-stack te overhouden. Klik hiervoor op het venster Z-stack om het te selecteren. Klik in de ROI Manager op'Alles weergeven'en verplaats de cursor langs de Z-stack om die afbeelding per afbeelding te controleren, alle cysten zijn geteld(aanvullende figuur 8).
   3. Zodra nieuwe cysten zijn geteld en ROI's zijn toegevoegd op stap 2.3.1., selecteert u de ROI-set en slaat u deze op via het venster ROI Manager door op Meer te klikken | Sparen (aanvullend figuur 9).
   4. Selecteer alle ROI's in de ROI Manager en klik op 'Meten'in de ROI Manager om de grootte van elke cyste te krijgen. Dit opent een nieuw venster met de naam "Resultaten" die elke cyste en de geschatte grootte nummeren. Sla vervolgens op in .csv-indeling door te klikken op het venster" Resultaten" en via het menu: Bestand | Opslaan als (aanvullend cijfer 10).
      OPMERKING: Er kan een macro worden gemaakt om stapels semi-automatisch te verwerken, cysteaantal/maten te schatten uit de projecties en de gegevens op te slaan voor een snellere telprocedure. Selecteer hiervoor het gereedschapOpnemenin het balkmenu door op Plug-ins te klikken | Macro's | Record.
4. Kwantificering van cystevorming efficiëntie
   1. Tel het aantal cysten op dag Y, op een projectie (Y=1, 2, 4, 7 of 10).
   2. Om de cystenvormingsefficiëntie voor 1000 cellen op dag Y te berekenen, deelt u het aantal cysten dat op dat moment werd geteld door het aantal cellen dat op dag 0 is ingezaaid, afgeleid van het hydrogelvolume en vermenigvuldigt u met 1000(figuur 3C, figuur 4).
      

3. Levensvatbaarheid van cellen

1. Bereid een voorraadoplossing van fluoresceïnediacetaat (FDA) voor op 5 mg/mL door 5 mg FDA op te lossen in 1 mL aceton en op te slaan bij -20 °C.
2. Bereid een voorraadoplossing van propidiumjodide (PI) voor bij een concentratie van 2 mg/mL in gedeïmiseerd water (dH₂O) en bewaar bij 4 °C.
3. Bereid NRC medium voor zonder foetaal kalfsserum (FCS).
4. Voeg voor de FDA/PI-kleuroplossing 4 μL FDA-voorraadoplossing (8 μg/mL eindconcentratie) en 25 μL PI-voorraadoplossing (20 μg/mL eindconcentratie) toe in 2,5 mL van NRC-medium zonder FCS.
5. Haal het medium uit de kamerdia, voeg 250 μL kleuroplossing toe in elke put en broed 4-5 min in het donker bij 37 °C, 5% CO₂. Pipette de kleuroplossing voorzichtig uit en was één keer met 250 μL 1x PBS.
6. Voeg voorzichtig 250 μL van compleet NRC-medium toe aan elke put en maak foto's met behulp van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop met Texas rood en fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) filters. Levende cellen zullen groen zijn en dode cellen zullen rood zijn(figuur 5A).
   OPMERKING: Om levende/dode cellen te kwantificeren, moet u Z-stacks na stap 2 over het hydrogelvolume nemen en de beeldverwerkingsmethode voor fluorescentie aanpassen.

4. Afscheidingsactiviteit

OPMERKING: De afscheidingsactiviteit door het apicale membraan van de cholangiocyten wordt beoordeeld door de afscheiding van fluoresceïne in het lumen. De specificiteit ervan kan worden geëvalueerd door het doen van dezelfde test met Verapamil, een multi-resistente (MDR) transporter remmer²⁴.

1. Voeg 0,83 μL hoechst-voorraadoplossing (15 mg/mL voorraadconcentratie in dH₂O) toe in 2,5 mL van NRC-medium zonder FCS om een kleuroplossing van Hoechst 33258 voor te bereiden op 5 μg/mL.
2. Voeg 250 μL Hoechst-oplossing toe in elke put en broed op 37 °C, 5% CO₂ gedurende 15 minuten.
3. Verwijder de Hoechst-oplossing en voeg 250 μL FDA-oplossing (8 μg/mL eindconcentratie) toe in elke put. Incubeer 4-5 min bij 37 °C, 5% CO₂.
   OPMERKING: Zodra cellen worden blootgesteld aan FDA kleuring oplossing, de follow-up van fluoresceïne secretie kinetiek kan nuttig zijn om de tijd die nodig is voor cysten te scheiden kalibreren. Om dit te doen, foto's nemen elke min voor 1 uur via time-lapse imaging. In dit voorbeeld is de tijd die nodig is om NRC te observeren die cysten in de hydrogel afscheidt ongeveer 15-20 min.
4. Maak foto's met behulp van een omgekeerde fluorescentie microscoop 5 min na het spoelen met medium zonder FCS. Gebruik 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) en FITC filters om kernen etikettering en fluoresceïne accumulatie in het lumen (Figuur 6A) onthullen. Om het aantal afscheidende cysten te kwantificeren, neem je Z-stacks zoals in stap 2 en pas je de beeldverwerkingsstappen aan fluorescerende beelden aan.
   OPMERKING: Voor de Verapamil-test gaat u vooraf aan het vorige proces (stap 4.3. tot en met 4.4.) door een incubatie met Verapamil, volgens de volgende voorwaarden:
5. Bereid een voorraadoplossing van 10 mM Verapamil in dimethylsulfoxide (DMSO) voor. Om 10 μM werkoplossing voor te bereiden, meng je 2,5 μL Verapamil stockoplossing met 2,5 mL cultuurmedium zonder FCS.
6. Om te beoordelen dat de fluorescentie in het lumen het gevolg is van MDR-afscheiding, neemt u een andere dia en voegt u 250 μL Verapamil-werkoplossing toe in elke put en 20 min incubeer bij 37°C, 5% CO₂
7. Verwijder de oplossing en voeg 250 μL FDA-oplossing (8 μg/mL uiteindelijke concentratie) toe aan elke put. Incubeer 4-5 min in het donker bij 37 °C, 5% CO₂. Was vervolgens met 250 μL 1x PBS, voordat beeldvorming(figuur 6B, C).

5. Epithelial polariteitsbeoordeling door immunofluorescentie

1. Om de bevestigingsoplossing voor te bereiden, mengt u 4% formaldehyde met 5% sacharose, in 1x PBS, pH 7.4 en incubeer in een voorverwarmd waterbad bij 37 °C.
2. Om de cellen te repareren, voorzichtig pipette uit de cultuur medium uit de put zonder beschadiging van de matrix. Voeg langzaam 400 μL van de bevestigingsoplossing toe aan de zijkant van de putten. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (RT).
   LET OP: Laat altijd 25 μL van de vloeistof boven de matrix om schade te voorkomen.
3. Verwijder voorzichtig de bevestigingsoplossing en was 3x met 400 μL 1x PBS bij (RT).
4. Pipette uit de PBS, voeg 400 μL permeabilisatieoplossing (0,5% Triton X-100 in 1x PBS) en incubeer 10 min bij RT.
5. Verwijder voorzichtig de permeabilisatieoplossing, gevolgd door 3 snelle wasbeurten met 400 μL 1x PBS en een lange wasstap van 30 min bij RT.
   LET OP: Bij deze stap kan de dia 2 dagen lang bij 4 °C worden bewaard. Verzegel in dit geval de glijbaan met een paraffinefilm om verdamping en matrixdrogen te voorkomen.
6. Verwijder de PBS, voeg 400 μL blokkeeroplossing toe met 0,1% runderserum albumine (BSA) en 10% geitenserum in 1x PBS en incubate gedurende 60 min bij RT.
   LET OP: Concentraties van BSA hoger dan 0,1% zullen leiden tot intrekking van lumen en verdere instorting van de cyste (zie sectie Representatieve resultaten) (figuur 7A).
7. Pipette de blokkeringsoplossing uit en was één keer met 400 μL PBS/0,05% Tween 20 en gooi het weg.
8. Voeg 150 μL van de antilichaamoplossing toe, bijvoorbeeld E-cadherineantilichaam verdund 1:400 en Phalloidin 568 (16,2 nM eindconcentratie) in 1x PBS en incubate gedurende 90 min bij RT.
   OPMERKING: Deze verdunning van E-cadherine wordt hetzelfde gebruikt als in een standaard 2D-immunofluorescentieprotocol.
9. Was het monster met 400 μL PBS/0,05% Tween 20, 3x; telkens het monster gedurende 10 minuten uitbroeden bij RT.
10. Voeg 150 μL van het secundaire antilichaam (geitantikonijn IgG Alexa Fluor Plus 647), verdund 1:500 in 1x PBS en incubate 60 min bij RT toe.
11. Was 3x met 400 μL PBS/0,05% Tween 20, telkens als het monster 10 minuten uitbroedt bij RT.
12. Was 3x met 400 μL 1x PBS, telkens het monster 10 minuten uitbroeden bij RT.
13. Gooi de PBS van de laatste wasbeurt weg en bereid de kamerdia voor op visualisatie via confocale microscopie volgens een van de twee onderstaande opties.
    1. Voeg 400 μL 1x PBS en 50 μL DAPI per put toe. De monsters kunnen worden onderzocht via de bodem van de put zonder de noodzaak van montage met een coverslip (Figuur 7B).
    2. Voeg 100 μL per put antifade reagens met DAPI toe en laat de slide drogende O/N bij RT.

Results

Vorming en karakterisering van cysten
3D-celkweeksystemen zijn een belangrijk instrument om organogenese en ziektemodellering te bestuderen²⁵. Helaas zijn de meeste van deze methoden kwalitatieve of gebruik interne kwantificering uitgevoerd op een enkel vlak door het vergelijken van het aantal cysten versus niet-cysten, in variabele en vaak niet-gespecificeerde volumes, het voorkomen van een vergelijking in termen van cyste vorming efficiëntie tussen de verschillende studies

Discussion

Om organogenese en het onderhoud van 3D cellulaire structuren te bestuderen, zijn verschillende weefsels gemodelleerd, met behulp van verschillende cellulaire oorsprong, maar ook verschillende soorten extracellulaire matrices, waaronder synthetische hydrogels^8,9,10,21. Echter, als gevolg van gebrek aan 3D kwantitatieve analyse die het mogelijk maakt voor vergelijkingen tussen methoden in termen...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 µl- Pipette Eppendorf Research Plus	Thermo Fisher Scientific	3120000020
100 µl - Pipette Eppendorf Research Plus	Thermo Fisher Scientific	3120000046
1000 µl - Pipette Eppendorf Research Plus	Thermo Fisher Scientific	3120000062
1X PBS	Thermo Fisher Scientific	14190-094
200 µl - Pipette Eppendorf Research Plus	Thermo Fisher Scientific	3120000054
3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt	Sigma-Aldrich	T5516	NRC complete medium final concentration = 3.4 µg/mL
Acetic acid	VWR	20104-298	0.02N final
Aerosol barrier pipettes tips 10 µl (Fisherbrand)	Thermo Fisher Scientific	2707439
Aerosol barrier pipettes tips 1000 µl (Fisherbrand)	Thermo Fisher Scientific	2707404
Aerosol barrier pipettes tips 200 µl (Fisherbrand)	Thermo Fisher Scientific	2707430
Antibiotic Antimicotic Solution (100X)	Sigma-Aldrich	A5955	NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution
Bovine pituitary extract	Thermo Fisher Scientific	13028-014	NRC complete medium final concentration = 30 µg/mL
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A2153	1:1000 dilution
Chemically Defined Lipid Concentrate (100X)	Thermo Fisher Scientific	11905-031	NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution
Collagen high concentration, rat tail	Thermo Fisher Scientific	354249	50 µg/mL final concentration
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902	NRC complete medium final concentration = 0.393 µg/mL
DMEM F12	Thermo Fisher Scientific	21331-020	NRC complete medium final concentration = 1X
E-cadherin Rabbit anti-Human, Rat, Polyclonal	Thermo Fisher Scientific	PA5-32178	1:400 dilution
Eclipse TE300 inverted microscope	Nikon		imaging
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	E9508	NRC complete medium final concentration = 0.32 mM
Fetal calf serum	Thermo Fisher Scientific	10270-106	NRC complete medium final concentration = 5:100 dilution
Fluoroshield with DAPI (Mounting medium)	Sigma-Aldrich	F6057
Formaldehyde 16% (W/V)	Thermo Fisher Scientific	28906	4% (W/V)
Goat serum	Thermo Fisher Scientific	16210-064	1:10 dilution
Hamamatsu camera (Digital camera C11440 ORCA - flash 4.OLT)	Hamamatsu		imaging
Hoechst 33258	Sigma-Aldrich	B1155	5 µg/mL final concentration
IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor Plus 647	Thermo Fisher Scientific	A32733	1:500 dilution
ImageJ version 2.0.0-rc-69/1.52n			Open source image processing software
Insulin-Transferrin-Selenium (100X)	Thermo Fisher Scientific	51300-044	NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution
L-Glutamine (100X)	Thermo Fisher Scientific	25030-024	NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution
Matrigel GFR (stock concentration 9.7 mg/mL)	Thermo Fisher Scientific	356231	4:10 dilution
NIS Elements software version 4.50.00	Nikon		image acquisition and display
Non-Essential-Amino-Acids-Solution (100X)	Thermo Fisher Scientific	11140-035	NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution
Objective Plan Fluor 10X/0.30 Ph1 DL (∞/1.2 WD 15.2)	Nikon
Prolong Gold Antifade Reagent	Thermo Fisher Scientific	P36931
Propidium Iodide (PI)	Sigma-Aldrich	P4170	20 µg/mL final concentration
Rhodamine Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	R415	16.2 nM final concentration
Sir-Actin / Verapamil kit	Spirochrome	SC001	10 µM final concentration
Soybean trypsin inhibitor	Thermo Fisher Scientific	17075-029	NRC complete medium final concentration = 50 µg/mL
Sterile cell strainer 40 µm (Fisherbrand)	Thermo Fisher Scientific	22363547
Sterile pipettes 10 mL (Fisherbrand)	Thermo Fisher Scientific	1367811E
Sterile pipettes 5 mL (Fisherbrand)	Thermo Fisher Scientific	1367811D
Sterile tubes 1.5 mL (Fisherbrand)	Thermo Fisher Scientific	11926955
Sterile tubes 15 mL (Fisherbrand)	Thermo Fisher Scientific	7200886
Sterile tubes 50 mL (Fisherbrand)	Thermo Fisher Scientific	553913
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	5:100 dilution
Tissue culture treated flask 25cm2 (Falcon)	Thermo Fisher Scientific	353108
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	5:1000 dilution
Trypsin-EDTA (0.05%) phenol red	Thermo Fisher Scientific	25300-054	1X
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379	5:10000 dilution
Vitamin (100X)	Thermo Fisher Scientific	11120-037	NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution
μ-Slide 8 Well ibiTreat, Ibidi	Clinisciences	80826