Gewijzigde methoden voor het laden van DNA-extractieplaten met hoge doorvoer verminderen het potentieel voor verontreiniging

Summary

Huidige methoden voor het laden van 96-well platen voor DNA-extracties kunnen gevoelig zijn voor verontreiniging. We beschrijven een nieuwe methode voor het laden van 96-well platen die het risico op kruisbesmetting tussen putten vermindert. Onze methode zal andere onderzoekers helpen om te profiteren van de efficiëntie van dna-extractietechnieken met hoge doorvoer en het risico op besmetting te minimaliseren.

Abstract

Dna-sequencingtechnieken met hoge doorvoer hebben aanzienlijk bijgedragen aan de vooruitgang in ons begrip van relaties tussen microbiële gemeenschappen, gastheerkenmerken en bredere ecosysteemfuncties. Met deze snelle toename van de breedte en diepte van de sequencing mogelijkheden zijn gekomen methoden om te extraheren, versterken, analyseren en interpreteren milieu-DNA met succes met maximale efficiëntie. Helaas kan het uitvoeren van DNA-extracties snel ten koste gaan van het verhogen van het risico op besmetting tussen monsters. Met name extracties met hoge doorvoer die gebaseerd zijn op monsters in een 96-putplaat bieden een relatief snelle methode, in vergelijking met extracties met één buis, maar vergroten ook de mogelijkheden voor goed tot goed kruisbesmetting. Om het risico van kruisbesmetting tussen monsters te minimaliseren, met behoud van de voordelen van technieken voor het afzuiden van hoge doorvoer, hebben we een nieuwe methode ontwikkeld voor het laden van milieumonsters in 96-putplaten. We gebruikten pierceable PCR afdichtingsfolies om elke plaat te bedekken tijdens het laden van monsters en voegden eerst monsters toe aan PCR-buizen voordat we ze in putten verplaatsten; samen verminderen deze praktijken het risico op monsterdrift en onbedoelde dubbele belasting van putten. De methode die in dit document wordt beschreven, biedt onderzoekers een aanpak om de beschikbare technieken voor het uitstipperen van hoge doorvoerextractie te maximaliseren en tegelijkertijd het risico op kruisbesmetting te verminderen dat inherent is aan 96-putplaten. We geven een gedetailleerd stap voor stap overzicht van hoe je van monsterverzameling naar DNA-extractie gaan en tegelijkertijd het risico op ongewenste kruisbesmetting minimaliseert.

Introduction

Recente vooruitgang in high-throughput sequencing van microbiële gemeenschappen bieden ongeëvenaarde sequencing diepte en, bijgevolg, een onvoorwaardelijke blik in de werking en diversiteit van het microbioom van de aarde¹. Naarmate de mogelijkheid om multiplex meer en meer monsters op een enkele sequencing lane toeneemt, single tube DNA extractie heeft het potentieel om een tarief-beperkende stap in de generatie van ecologische gegevens. Nieuwe methoden bij dna-extracties met hoge doorvoer beloven echter grote hoeveelheden milieumonsters met een grotere efficiëntie dan voorheen mogelijk was². Deze methoden omvatten vaak....

Protocol

1. Laboratoriumbank en gereedschapsvoorbereiding voor het laden van een 96-putplaat

1. Heldere banktop door nevelen met 70% ethanol. Veeg af en laat de lucht drogen voordat u de bank met 10% bleekwater besproeit. Veeg de bank boven droog.
2. Steriliseren micro-scoopula, spatel, en chirurgische schaar (gebogen) door dompelen in 95% ethanol en vervolgens bloot te stellen aan een vlam. Dip elk in 10% bleekmiddel en laat de lucht drogen voorafgaand aan gebruik.
   OPMERKING: Hulpmiddelen moeten tussen elk monster worden gesteriliseerd.

2. Subbemonstering en monsterbereiding

1. Steriliseren handschoenen met behulp van ....

Results

Deze nieuwe methode werd met succes gebruikt om 96-well DNA extractieplaten te laden. Vergelijking van plaatbeladingsmethoden toonde onze methode om de laagste DNA-concentratie in de lege putten te hebben. De DNA-concentratie in de lege putten was aanzienlijk lager dan de voorgestelde methode mijn McPherson et al.⁹ (p < 0,05), hoewel dna-concentraties in onze methode statistisch niet verschilden van de Qiagen standaardmethode(figuur 2). Alle drie de geproduceerde meth.......

Discussion

Deze methode vermindert de mogelijkheden voor goed tot goed kruisbesmetting tijdens het laden van monsterextractieplaten met hoge doorvoer en biedt een meer gecontroleerd middel om platen met 96-bron te laden die verder gaan dan de bestaande strategieën voor het laden van platen^9,10. Verontreiniging tussen putten kan meer alomtegenwoordig zijn bij 96-put plaatextracties dan bij extracties met één buis, vooral wanneer geautomatiseerde^6.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 oz WhirlPak	Nasco	B01065
2 mL centrifuge tubes	Fisherbrand	05-408-129
200 µL micro-PCR tubes	Thermo Scientific	AB 2000
96-well PowerSoil DNA extraction kit	Qiagen	12955-4	We used a soil extraction kit but any 96-well format kit would work.
Ice block for 2 mL centrifuge tubes	Any	Any	Any ice block made for 2 mL tubes will work
Ice block for 200 µL micro-PCR tubes	Any	Any	Any ice block made for 200 µL tubes will work
Micro scoopula	Any	Any
Precut Pierceable Sealing Film	Excel Scientific	XPS25
Spatula	Any	Any
Surgical scissors	Any	Any