Methylatiespecifieke Multiplex Droplet PCR met polymeerdruppelgenerator voor hematologische diagnostiek

Summary

Epigenetische markers worden gebruikt voor witte bloedcellen (WBC) subtypering door de kwantificering van DNA-methylatiepatronen. Dit protocol presenteert een multiplex druppelpolymeerkettingreactie (mdPCR) methode met behulp van een thermoplastische elastomer (TPE) gebaseerd microfluïde apparaat voor druppelgeneratie waardoor nauwkeurige en multiplex methylatie-specifieke doelkwantificering van WBC differentiële telt.

Abstract

Een multiplexed druppel PCR (mdPCR) workflow en gedetailleerd protocol voor het bepalen van epigenetische gebaseerde witte bloedcel (WBC) differentieel telling wordt beschreven, samen met een thermoplastische elastomer (TPE) microfluïde druppelgeneratie apparaat. Epigenetische markers worden gebruikt voor WBC subtypering die van belangrijke prognostische waarde is bij verschillende ziekten. Dit wordt bereikt door de kwantificering van DNA-methylatiepatronen van specifieke CG-rijke gebieden in het genoom (CpG loci). In dit document, bisulfite behandeld DNA van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) is ingekapseld in druppels met mdPCR reagentia met inbegrip van primers en hydrolyse fluorescerende sondes specifiek voor CpG loci die correleren met WBC sub-populaties. De multiplex benadering maakt het mogelijk voor de ondervraging van veel CpG loci zonder de noodzaak van afzonderlijke mdPCR reacties, waardoor meer nauwkeurige parametrische bepaling van WBC sub-populaties met behulp van epigenetische analyse van methylatie sites. Deze nauwkeurige kwantificering kan worden uitgebreid tot verschillende toepassingen en benadrukt de voordelen voor klinische diagnose en de daaropvolgende prognose.

Introduction

Analyse van de samenstelling van witte bloedcellen (BBC's) is een van de meest gevraagde laboratoriumtests in hematologische diagnostiek. Differentiële leukocytentelling dient als een indicator voor een spectrum van ziekten, waaronder infectie, ontsteking, bloedarmoede en leukemie, en wordt onderzocht als een vroege prognostische biomarker voor verschillende andere aandoeningen ook. De gouden standaard in WBC-subtypering omvat immunostaining en/of stroomcytometrie die beide dure, instabiliteitsgevoelige fluorescerende antilichamen vereisen en vaak sterk afhankelijk zijn van de vaardigheid van de operator bij het bereiden van monsters. Bovendien is deze methode alleen ....

Protocol

Alle experimenten die in deze studie met menselijke monsters werden uitgevoerd, zijn goedgekeurd door de Ethische Raad van de NRC en werden uitgevoerd volgens het beleid van NRC ten aanzien van menselijke proefpersonen die de toepasselijke onderzoeksrichtlijnen volgen en voldoen aan de wetten in Québec, Canada.

1. Celvoorbereiding

1. Ontdooi de bevroren menselijke perifere bloedmononucleaire cellen (PBMCs) onmiddellijk door het cryoviale in een waterbad op 37 °C gedurende 5 minuten te plaatsen.
2. Draai de cryoviale tweemaal om de cellen voorzichtig te resuspend en met behulp van een 1 mL pipet overdracht van de cel suspensie ....

Results

De op TPE gebaseerde microfluidic druppelgeneratorapparaat werd vervaardigd volgens het beschreven protocol zoals weergegeven in figuur 1. Een transparantiemasker werd gebruikt in fotolithografie om silicium (Si) meester te verkrijgen. Zachte lithografie werd uitgevoerd om een omgekeerde PDMS replica van de Si master die vervolgens werd gebruikt om de epoxy mal te fabriceren verkrijgen. Epoxy voorloper werd gegoten op de PDMS en genezen om crosslink en verharden. Deze mal, die de exacte repl.......

Discussion

De gepresenteerde experimentele protocol en methoden zorgen voor in-house mdPCR met behulp van een vervaardigde TPE druppelgenerator, een thermische cycler, en fluorescentie microscoop. Het vervaardigde apparaat met behulp van zachte TPE aan TPE binding biedt hydrofobe oppervlakte-eigenschappen die uniform zijn over alle kanaalwanden, zodanig dat het uiteindelijke apparaat geen oppervlaktebehandeling nodig heeft voor later gebruik als druppelgenerator. Dit materiaal is routinematig gebruikt in point-of-care platforms die.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bio-Rad, Mississauga, ON	TFI0201	PCR tube
RAN Biotechnologies, Beverly, MA	008-FluoroSurfactant	Fluoro-surfactant
Silicon Quest International, Santa Clara, CA
Oxford Instruments, Abingdon, UK		EMCCD camera
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	MA5-16728
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	22-8425-71
CellProfiler		Used for fluorescence image analysis
Nikon, Japan		10x objective
American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA	PCS-800-011
Ramé-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ)	p/n 200-U1
Fisher, Canada
Vitrocom, NJ, USA	5015 and 5010	Borosilicate capilary tube
(http://definetherain.org.uk/)
Hamamatsu, Japan	LC-L1V5	DEL UV light source
Dolomite	3200063	Disposable fluidic tubing
Dolomite	3200302	Disposable fluidic tubing
IDT, Coralville, IA
Nikon, Melville, NY		Upright light microscope
Cytec Industries, Woodland Park, NJ
EV Group, Schärding, Austria
Zymo Research, Irvine, CA	D5030
Photron, San Diego, CA
IDT, Coralville, IA
Gersteltec, Pully, Switzerland		SU-8 photoresist
Fineline Imaging, Colorado Springs, CO
Qiagen, Hilden, Germany	203603
Image J		Used to assess droplet diameter
Anachemia, Montreal, QC
Excelitas, MA, USA		Broad-spectrum LED fluorescent lamp
Galenvs Sciences Inc., Montreal, QC	DE1010
Hexpol TPE, Åmål, Sweden		Thermoplastic elastomer (TPE)
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	13-400-518
Nikon, Japan		Used for image acquisition
3M, St Paul, MN		Carrier Oil
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	R37605	Blue fluorescent live cell stain (DAPI)
IDEX Health & Science, Oak Harbor, WA	P-881	PEEK fittings
Sigma-Aldrich, Oakville, ON	806552
Dow Corning, Midland, MI
ThinkyUSA, CA, USA	ARV 310
Ihc world, Maryland, USA	IW-125-0
Zinsser NA, Northridge, CA	2607808
Cetoni GmbH, Korbussen, Germany
Sigma-Aldrich, Oakville, ON	484431
Bio-Rad, Mississauga, ON	1861096
Hitachi High-Technologies, Mississauga, ON
Nikon, Melville, NY		Inverted microscope
Nikon, Japan
Loctite	AA 352