Methylatiespecifieke Multiplex Droplet PCR met polymeerdruppelgenerator voor hematologische diagnostiek

Samenvatting

Epigenetische markers worden gebruikt voor witte bloedcellen (WBC) subtypering door de kwantificering van DNA-methylatiepatronen. Dit protocol presenteert een multiplex druppelpolymeerkettingreactie (mdPCR) methode met behulp van een thermoplastische elastomer (TPE) gebaseerd microfluïde apparaat voor druppelgeneratie waardoor nauwkeurige en multiplex methylatie-specifieke doelkwantificering van WBC differentiële telt.

Samenvatting

Een multiplexed druppel PCR (mdPCR) workflow en gedetailleerd protocol voor het bepalen van epigenetische gebaseerde witte bloedcel (WBC) differentieel telling wordt beschreven, samen met een thermoplastische elastomer (TPE) microfluïde druppelgeneratie apparaat. Epigenetische markers worden gebruikt voor WBC subtypering die van belangrijke prognostische waarde is bij verschillende ziekten. Dit wordt bereikt door de kwantificering van DNA-methylatiepatronen van specifieke CG-rijke gebieden in het genoom (CpG loci). In dit document, bisulfite behandeld DNA van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) is ingekapseld in druppels met mdPCR reagentia met inbegrip van primers en hydrolyse fluorescerende sondes specifiek voor CpG loci die correleren met WBC sub-populaties. De multiplex benadering maakt het mogelijk voor de ondervraging van veel CpG loci zonder de noodzaak van afzonderlijke mdPCR reacties, waardoor meer nauwkeurige parametrische bepaling van WBC sub-populaties met behulp van epigenetische analyse van methylatie sites. Deze nauwkeurige kwantificering kan worden uitgebreid tot verschillende toepassingen en benadrukt de voordelen voor klinische diagnose en de daaropvolgende prognose.

Inleiding

Analyse van de samenstelling van witte bloedcellen (BBC's) is een van de meest gevraagde laboratoriumtests in hematologische diagnostiek. Differentiële leukocytentelling dient als een indicator voor een spectrum van ziekten, waaronder infectie, ontsteking, bloedarmoede en leukemie, en wordt onderzocht als een vroege prognostische biomarker voor verschillende andere aandoeningen ook. De gouden standaard in WBC-subtypering omvat immunostaining en/of stroomcytometrie die beide dure, instabiliteitsgevoelige fluorescerende antilichamen vereisen en vaak sterk afhankelijk zijn van de vaardigheid van de operator bij het bereiden van monsters. Bovendien is deze methode alleen van toepassing op monsters van vers bloed, zodat de monsters niet kunnen worden ingevroren voor verzending of latere analyse.

Epigenetische markers zijn onlangs naar voren gekomen als krachtige analytische instrumenten voor de studie van fenotypische variaties. Vervolgens, menselijke leukocyten populaties zijn aangetoond dat cel-lijn DNA-methylatie patronen die het mogelijk maken voor de precieze karakterisering van WBC subsets. Subtypering op basis van epigenetische markers biedt een veelbelovend alternatief dat niet afhankelijk is van het verzamelen van vers bloedmonsters of dure antilichamen en kan worden gebruikt als biomarker voor ziekteafname en gevoeligheid^1,2,3,4,5.

Genoombrede studies zijn uitgevoerd voor het uitgebreid in kaart brengen van gemethyleerde specifieke CG-rijke gebieden in het genoom (CpG-eilanden) in leukocyten subtypen om kandidaat-epigenetische markers te identificeren die specifiek zijn voor leukocyten subtypen. Vanwege deze reden zijn PCR-protocollen ontwikkeld voor gemethyleerde gengebieden, zoals CD3Z en FOXP3, wat overeenkomt met cd3⁺ T-cellen en CD4⁺ CD25⁺ Regulatory T-Cells (T-Regs). Wiencke et al. hebben aangetoond dat duplexdruppel PCR voor epigenetische subtypering van T-Cellen, resultaten die sterk correleren met flow activated cell sorting (FACS) analyse⁶. Deze kwantitatieve genetische analysemethode is gebaseerd op het verdelen van de sjabloon nucleïnezuurmoleculen en PCR-reagentia in duizenden discrete, volumetrimlijk gedefinieerde druppels met een subnanoliter grootte die nul, een of meer doelnucleïnezuurkopieën bevatten, met behulp van water-in-olie emulsies die door microfluidica^7,8worden ingeschakeld . De PCR-versterking wordt uitgevoerd binnen elke afzonderlijke druppel en de eindpuntfluorescentieintensiteit van elke druppel wordt gemeten, waardoor absolute kwantificering van de in het monster aanwezige doelen mogelijk is. Druppel PCR is vastgesteld om nauwkeuriger, nauwkeuriger en technisch eenvoudiger dan standaard qPCR, waardoor het een gunstiger DNA methylatie-gebaseerde methode voor klinische evaluatie van T-Cellen. Hoewel een snel opkomende subtypering methodologie, multiplexed epigenetische analyse te sonde voor verschillende gemethyleerde CpG regio's tegelijkertijd ontbreekt. Dit is nodig voor routinematige leukocyten differentieel telt.

Hierin wordt een thermoplastisch elastomer (TPE) druppelmicrofluïdisch apparaat gepresenteerd en gebruikt voor methylatiespecifieke multiplex druppel PCR (mdPCR). De technologie is gebruikt om specifieke leukocyten subtypes, CD3⁺ T-Cells en CD4⁺ CD25⁺ T-Regs af te bakenen, gebaseerd op cellijn DNA methylatiepatronen, d.w.z. epigenetische variatie van cd3z en FOXP3 CpG regio's, respectievelijk. Een gedetailleerd protocol voor DNA-extractie, bisulfite conversie en mdPCR wordt beschreven in overleg met een fabricagemethode voor een TPE druppelgeneratie apparaat. Representatieve resultaten van de methode worden vergeleken met die van immunofluorescentie vlekken benadrukken het nut van de voorgestelde aanpak.

Protocol

Alle experimenten die in deze studie met menselijke monsters werden uitgevoerd, zijn goedgekeurd door de Ethische Raad van de NRC en werden uitgevoerd volgens het beleid van NRC ten aanzien van menselijke proefpersonen die de toepasselijke onderzoeksrichtlijnen volgen en voldoen aan de wetten in Québec, Canada.

1. Celvoorbereiding

1. Ontdooi de bevroren menselijke perifere bloedmononucleaire cellen (PBMCs) onmiddellijk door het cryoviale in een waterbad op 37 °C gedurende 5 minuten te plaatsen.
2. Draai de cryoviale tweemaal om de cellen voorzichtig te resuspend en met behulp van een 1 mL pipet overdracht van de cel suspensie in een 15 mL conische buis.
3. Voeg 10 mL voorverwarmd (37 °C) groeimedium toe aangevuld met 10% foetale runderserum (RPMI-1640 + 10% FBS) aan de 15 mL buis met de PBMCs.
4. Centrifuge de cel vering in een swingende emmer centrifuge bij kamertemperatuur bij een snelheid van 330 x g gedurende 10 min met snelle acceleratie en de rem op hoog.
5. Zodra de spin voorbij is, voorzichtig decanteren de supernatant. Resuspend de celpellet in 3 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7.2, met 2 mM ethyleenediaminetetraacetic zuur (EDTA) door op de zijkant van de buizen te tikken.
6. Meng de cellen door de buis om te keren met de dop goed gesloten.
7. Bereid twee 1,5 mL microbuisjes en met behulp van een pipette aliquot 1,5 mL van de cel suspensie in elke buis, waarvan er een wordt gebruikt voor latere immunofluorescentie vlekken en een voor de DNA-extractie.

2. Immunofluorescentie kleuring en beeldvorming protocol

1. Resuspend cells (from 1.7) in 200 μL of PBS buffer containing 0.1% natrium azide and 2% FBS and adjust the final concentration of the cell suspension to a maximum of 2 x 10⁷ cells/mL.
2. Verdeel de celsuspensie door het volume van 100 μL te pipetten in twee afzonderlijke microbuisjes van 1,5 mL.
3. Voeg 20 μL volume anti-Hu CD3/CD4 geconjugeerd met Fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) en Phycoerythrin (PE) toe aan één buis en anti-Hu CD4/CD25 geconjugeerd met FITC en PE (zie Tabel van Materialen)aan de tweede buis, respectievelijk.
4. Voeg 1 druppel blauwe fluorescerende levende celvlek (zie tabel van materialen)toe aan elke buis.
5. Incubeer bij kamertemperatuur met behulp van een buis rotator voor 2 uur. Bescherm tegen licht.
6. Centrifuge de celvering bij kamertemperatuur op 330 x g gedurende 10 minuten met snelle acceleratie en de rem op hoog.
7. Decanteer de supernatant en resuspend de celpellet door op de buis te tikken. Voeg 1 mL PBS toe, pH 7.2 met 2 mM EDTA. Zorg ervoor dat de dop goed gesloten is, meng de cellen door de buis 2x om te keren.
8. Herhaal stap 2.6 en 2.7 voor drie keer.
9. Resuspend cellen in 20 μL PBS pH 7.2 met 2 mM EDTA.
10. Pipette 10 μL druppel van de cel suspensie op een borosilicaat microscoop schuif en wacht 2 min voor cellen om langzaam sediment naar de bodem van de druppel.
11. Plaats voorzichtig een glazen deksel slip op de top van de microscoop dia en plaats de dia op het podium van een omgekeerde microscoop.
12. Neem beelden van de cellen op met behulp van een 10x-doelstelling en een EMCCD-camera die is aangesloten op de microscoop voor elk van de fluoroforen voor beide celsuspensiemonsters.
13. Tel handmatig fluorescerend gelabelde cellen (zie Aanvullende informatie voor ruwe gegevens).
14. Neem de verhouding van anti-Hu CD3 en anti-Hu CD4/CD25 gelabelde cellen tot DAPI-gekleurde cellen om de verhoudingen van CD3⁺ T-Cellen en CD4⁺ CD25⁺ T-Regs te verkrijgen tot totale leukocyte.

3. DNA-extractie en bisulfieconversie

1. DNA-extractie
   OPMERKING: Haal DNA uit PBMC's die in punt 1 zijn bereid met behulp van een magnetische DNA-zuiveringskit (zie tabel van materialen)volgens de door de fabrikant geleverde procedures.
   1. In een buis van 1,5 mL hangen cellen op in 100 μL PBS en voeg 20 μL Proteinase K en 400 μL Lysis/Binding buffer toe. Meng door pipetting up-down 10x, voer dan incubatie op kamertemperatuur gedurende 5 min.
   2. Leg het DNA-kraalcomplex vast door de buis 1-2 min op een magnetisch rek te plaatsen en verwijder vervolgens voorzichtig en gooi de supernatant weg.
   3. Verwijder de buis met het DNA-kraalcomplex uit het magnetisch rek en zet de kralen opnieuw in 600 μL wasbuffer #1 om een niet-specifieke binding weg te spoelen.
   4. Plaats de buis opnieuw op het magnetische rek en verwijder en gooi de supernatant voorzichtig weg.
   5. Herhaal stap 3.1.3 en 3.1.4 met 600 μL wasbuffer #2.
   6. Laat de buis 1 min in de lucht drogen.
   7. Verwijder de buis uit het magneetrek en ontwijk het DNA door 100 μL Elution Buffer af te geven en het DNA/kraalcomplex 20x op en neer te pipetten.
   8. Plaats de buis met het geëuterde DNA opnieuw op het magnetische rek en broed gedurende 1-2 min om de magnetische kralen te scheiden van het geëuterde DNA.
   9. Breng de gezuiverde GEzuiverde DNA-oplossing over naar een nieuwe schone buis.
   10. Beoordeel de concentratie van het gezuiverde DNA-monster door de absorptie op 260 nm te meten met behulp van een spectrofotometer.
2. Bisulfite conversie
   OPMERKING: Voer de bisulfieconversie uit op gezuiverd DNA met behulp van een methylatiekit (zie Tabel van Materialen)volgens de procedures van de fabrikant.
   1. Voeg 130 μL DNA-monster (200-500 ng) in een PCR-buis 130 μL conversiereagens toe. Meng goed en spin kort naar beneden.
   2. Breng de PCR-buis over op een thermische fietser en voer het fietsprotocol als volgt uit: 98 °C gedurende 8 min; 54 °C gedurende 60 minuten en houd het op 4 °C.
   3. Voeg 600 μL van de bindingsbuffer toe aan een ionenchromatografie (IC) kolom die in een opvangbuis is geplaatst.
   4. Voeg het DNA-monster toe aan de IC-kolom met de bindingsbuffer en meng door de buis meerdere keren om te keren. Centrifuge voor 30 s op volle snelheid. Gooi de verzamelde doorstroom weg.
   5. Voeg nu 100 μL Wasbuffer toe aan de kolom. Voer centrifugatie uit zoals beschreven in stap 3.2.4 en gooi de doorstroom weg.
   6. Voeg 200 μl Desulfonatiebuffer toe en voer incubatie bij kamertemperatuur gedurende 15-20 minuten uit. Centrifugeren en gooi de doorloop zoals beschreven in stappen hierboven.
   7. Voeg 200 μL wasbuffer toe aan de kolom. Centrifuge op volle snelheid voor 30 s en gooi de flow-through.
   8. Herhaal stap 3.2.7.
   9. Breng de kolom over naar een nieuwe 1,5 mL-opvangbuis en voeg 100 μL pcr-kwaliteit water toe aan het membraan van de kolom. Centrifuge op volle snelheid gedurende 1 min om het DNA te ontwijken.
   10. Beoordeel de concentratie van bisulfite-omgezet DNA-monster door de absorptie op 260 nm te meten met behulp van een spectrofotometer.
       LET OP: Gebruik een waarde van 40 μg/mL voor absorptie bij 260 nm = 1,0.
   11. Bewaar DNA bij -20 °C voor korte termijn opslag of bij -70 °C voor langdurige opslag.

4. Droplet generatie apparaat fabricage

OPMERKING: Een microfluïdisch apparaat dat wordt gebruikt voor druppelproductie (CAD-bestand in de aanvullende informatie)is vervaardigd in een cleanroom (klasse 1.000) in thermoplastisch elastomen (zie tabel met materialen)met behulp van hete reliëf gegenereerd door het volgende protocol.

1. SU-8 malfabricage
   1. Bereid een SU-8 mal op een 6 "silicium wafer met behulp van standaard fotolithografie zoals hieronder beschreven.
   2. Reinig een 6" silicium wafer met behulp van zuurstofplasma op 500 W voor 10 s.
   3. Spin-coat SU-8 weerstaat op de siliciumwafer bij 900 rpm voor 40 s om een totale filmdikte van 100 μm te bereiken.
   4. Leg de wafer op een hete plaat en bak 15 min voor op 65 °C, gevolgd door 2 uur bij 95 °C.
   5. Blootstellen aan UV-licht op 365 nm (Hg i-line) door middel van een high-definition transparantie fotomasker met behulp van een blootstelling dosis van 1.000 mJ/cm².
   6. Leg de wafer op een hete plaat en bak 15 min op 65 °C, gevolgd door 40 min bij 95 °C.
   7. Ontwikkel door dompelen in propyleenglycol monomethyl ether acetaat (PGMEA) voor 5 min.
   8. Spoel af met PGMEA en isopropanol en droog met een stroom stikstofgas.
   9. Leg de wafer op een hete plaat en bak 2 uur hard op 135 °C.
   10. Silanize de wafer in het vacuüm desiccator met een druppel silaniserend middel (tricholoro perfluorootyl silane) geplaatst op een aangrenzende glazen microscoop dia voor 2 uur.
       OPMERKING: Dit wordt gedaan om de silanes vormen een monolaag op het oppervlak van de SU-8 master. Tricholoro perfluorocttyl silane moet altijd worden behandeld in de rookkap en weg gehouden van waterbronnen.
2. Polydimethylsiloxane (PDMS) replica
   1. Bereid vloeibare prepolymeren van PDMS (zie Tabel van materialen)op een 10:1 verhouding w/w van elastomeerbasis aan het uitharden van agent in een plastic beker.
   2. Plaats de beker in een planetaire centrifugale vacuümmixer om het PDMS-mengsel te mengen en te ontgassen.
   3. Giet PDMS mengsel op de mal geplaatst in de aangepaste metalen houder die hars lekkage voorkomt en genezen op 65 °C voor 2 uur.
   4. Met behulp van een pincet, voorzichtig afpellen van de PDMS mal van de SU-8 master.
3. Epoxy schimmel
   OPMERKING: Een epoxy mal werd vervaardigd uit de SU-8 / silicon master met behulp van een tussentijdse replicatie proces met PDMS.
   1. Bereid de epoxy hars (zie tabel van materialen) met behulp van een 100/83 w / w verhouding van hars / verharder.
   2. Ontgassen het mengsel onder verminderde druk met behulp van een vacuüm drogen oven gedurende 30 min.
   3. Giet de hars over de PDMS replica en genezen bij 80 °C voor 12 uur.
   4. Haal de uitgeharde epoxymal uit de PDMS-replica, plaats op een hete plaat en bak 2 uur bij 120 °C.
4. TPE-apparaat
   1. Extrudeer pellets van TPE (zie Tabel van materialen) bij 165 °C in 2,0 mm dik en 7" brede platen van enkele meters lang en bewaar ze als rol voor toekomstig gebruik.
   2. Snijd het TPE-vel van de rol met een schaar in een vierkant van 7 inch.
   3. Plaats de TPE-plaat tussen de epoxymal en een niet-patroon silanized siliciumwafer (zie stap 4.1.10 voor wafer silanization procedure).
   4. Voer hot-embossing uit bij een temperatuur van 125 °C, een toegepaste kracht van 10 kN en een druk van 10^–2 mbar gedurende 10 minuten.
   5. Oefen voorzichtig bij kamertemperatuur met behulp van methanolspray om de reliëf TPE te scheiden van de siliciumwafer en de epoxyvorm.
   6. Snijd nog een 7 " vierkante vel TPE en plaats het tussen twee niet-patroon silanized silicium wafers.
   7. Voer hot-embossing uit bij een temperatuur van 140 °C, een toegepaste kracht van 10 kN en een druk van 10^–2 mbar gedurende 10 minuten om een vlakke ondergrond te vormen voor het sluiten van de kanalen en het afdichten van het apparaat.
   8. Oefen voorzichtig bij kamertemperatuur met behulp van methanolspray om de reliëf TPE te scheiden van de twee siliciumwafers.
   9. Snijd elk van de reliëf TPE vellen op apparaatgrootte met behulp van een doktersblad.
   10. Sla de toegangsgaten voor de inlaat- en uitlaatkanalen in het gestructureerde apparaat met behulp van een 1 mm biopsiepaald met een zuiger.
   11. Sluit de kanalen door het plaatsen van een vlakke TPE-apparaat in direct contact met de kanalen bij kamertemperatuur.
   12. Plaats eventueel in een oven op 70 °C voor 2 uur om de hechting van apparaten te bevorderen.
   13. Pas de toegangsgaten aan met een wegwerpvloeistofbuis (I.D. 0,25 mm, O.D. 0,8 mm). Verzegel de gewrichten met behulp van een epoxylijm om lekvrije manipulatie te garanderen.

5. Droplet generatie en PCR

OPMERKING: Tabel 1 schetst informatie over de voorwaartse en omgekeerde primers, samen met de dubbel-gebluste hydrolyse sondes voor C-LESS, CD3Z en Foxp3 genen, die nodig zijn voor de multiplex versterking van demethylated gen doelen.

1. Bereid de hoofdmix zoals beschreven in tabel 2.
2. Ontdooi alle componenten van de mastermix, behalve de enzymmix. Meng de master mix grondig door pipetting up-down en spin naar beneden kort.
3. Voeg het juiste volume (1 μL) van bisulfie omgezet DNA (van punt 3.2) toe om de mix in een PCR-buis te beheersen. Meng de reactie door pipetting up-down en spin naar beneden kort.
4. Sluit wegwerpvloeistoffen (I.D. 0,25 mm, O.D. 1,6 mm) aan op twee precisieglazen spuiten (250 μL volume) met peek fittingen.
5. Vul één precisieglasspuit voor met 250 μL dragerolie met 5% fluor-oppervlakteactieve stoffen.
6. Vul een andere precisieglazenspuit voor met 50 μL dragerolie voordat u 100 μL van de PCR-mix laadt om het gehele monstervolume tijdens de emulsificatie te kunnen afgeven.
7. Stel een druppelmicrofluïdisch apparaat op een podium van een rechtopstaande lichtmicroscoop die is uitgerust met een hogesnelheidscamera om druppelvorming in real-time te observeren en vast te leggen.
8. Plaats de voorgevulde spuiten op de programmeerbare spuitpomp en gebruik peek-unie met fittingen (zie Tabel van Materialen),sluit de slang van de spuiten aan op de slang van de respectieve inlaatkanalen van het druppelmicrofluïde apparaat.
9. Plaats de slang uit de uitlaat van de druppelgenerator in een PCR-buis van 0,5 mL.
10. Pas de stroomsnelheid van de spuitpomp aan op 2 μL/min en laat de druppelgrootte stabiliseren voordat de resulterende emulsie wordt verzameld.
11. Verzamel de emulsie en breng 75 μL over naar een 0,2 mL PCR-buis voor thermische fietsen.
12. Zorg ervoor dat het oliegehalte in de PCR-buis nauw aansluit bij het volume van de verspreide fase om coalescence van de druppels tijdens het thermische fietsen te voorkomen.
13. Plaats de 0,2 mL PCR-buis in thermische cycler en voer het fietsprotocol als volgt uit: voorverwarmen op 95 °C gedurende 5 min, vervolgens 45 cycli van denaturatie bij 95 °C voor 15 s en annealing/uitbreiding bij 60 °C voor 30 s.
14. Gebruik de resterende emulsie om een borosilicaat capillaire buis (100 μm diepte) te vullen met een rechthoekig profiel om druppeltjes te beeld en de druppeldiameter te beoordelen.
15. Plaats de borosilicaat buis gevuld met de emulsie op een microscoop dia. Gebruik een omgekeerde microscoop uitgerust met een EMCCD-camera en 10x doelstelling om heldere veldbeelden van de druppels op te nemen.
16. Meet de druppeldiameter met behulp van een beeldanalysesoftware zoals hieronder beschreven.
17. Stel de schaal van de bekende afstand in microns in die overeenkomen met het aantal pixels in de afbeelding door de knop'Analyseren'te selecteren en vervolgens 'Schaal instellen'.
18. Converteer de afbeelding naar grijswaarden door de knop 'Afbeelding'te selecteren en vervolgens' Type'. Pas indien nodig de helderheid en het contrast aan. Stel een handmatige drempel in om de cirkels af te bakenen en te vullen door de knop 'Afbeelding'te selecteren en vervolgens 'Drempelwaarde aanpassen'.
19. Analyseer de deeltjes door de knop 'Deeltjes analyseren'te selecteren en de circulariteit in te stellen op 0,75 – 1.
20. Verkrijg het resulterende gebied en de diameter van de gemeten druppels die automatisch in de software worden weergegeven.
21. Bereken de gemiddelde druppeldiameter en neem aan dat een bolvormige druppel wordt gebruikt, schat het partitievolume, dat wordt gebruikt om de absolute doelconcentratie te berekenen.
22. Zorg ervoor dat de druppels monodisperse zijn door de variatiecoëfficiënt (CV) te analyseren die wordt genomen als de verhouding tussen de standaarddeviaties en de gemiddelde waarden(k = 1), voor de druppeldiameter (< 3%).

6. Fluorescentie beeldvorming en beeldanalyse

1. Fluorescentie beeldvorming
   1. Breng na versterking de PCR-emulsie over in de capillaire capillaire buis (50 μm diepte) met een rechthoekig profiel om druppels in een dicht verpakte monolaag voor beeldvorming te plaatsen.
   2. Bevestig de gevulde haarvaten op een microscoopdia en verzegel beide zijden met behulp van een UV-acryllijm. Breng een UV-lichtbron op de UV-lijm wordt voorzichtig niet te verlichten van de emulsie om te voorkomen dat bleken van het monster.
   3. Laad de glazen schuif op een omgekeerde microscoop uitgerust met een EMCCD camera en een 10x doelstelling.
   4. Selecteer met behulp van microscoopbeeldvormingssoftware Acquire | Live - Snel om real-time camera-acquisitie te starten, het monster te observeren en ervoor te zorgen dat de breedte van de capillaire wordt vastgelegd.
   5. Stel de felle veldlamp voor diascopische verlichting in op 3,5 V.
   6. Stel de breedspectrum LED-tl-lamp voor episcopische verlichting in op 20% intensiteit.
   7. Pas de opname-instelling voor alle golflengten (Helder veld, FAM, HEX en Cy5) handmatig aan door de kalibratie te selecteren | Optische configuraties commando in de imaging software. Voor elke fluorofoër moet de bijbehorende fluorescentiefilterkubus handmatig worden geschakeld. Een filterkubus voor de heldere beeldvorming van het veld moet worden gebruikt om hetzelfde optische pad te behouden.
   8. De belichtingstijd handmatig aanpassen voordat de afbeeldingsverwerving wordt verwerft | De opdracht Camera-instellingen voor elke fluorofokoe zoals samengevat in tabel 3. Stel de uitleesmodus EM gain 17 MHz in op 16-bits met een gain multiplier van 100 in het menu'Capture Settings'van de software.
   9. Stel in het LUT-venster van de software de LUTs-schaal zodanig in dat het transmissiesignaal binnen het ingestelde bereik valt. In dit experiment werd de schaal vastgesteld van 500 tot 12.000 ongeveer.
   10. Automatiseer de opname met behulp van een multipoint acquisitieprogramma met behulp van zowel XY-scan als meerdere golflengteopties in die specifieke volgorde. Zorg ervoor dat het podium naar de beginpositie gaat, leg alle verschillende golflengten vast en ga vervolgens naar de volgende positie.
   11. Stel eerst de XY-scan in door het XY-scanprofiel aan te pasten in het XY-scanmenu van de software. Kies in 'Custom Multipoint Definition'het grote beelddefinitievak en stel deze in op ongeveer 40,0 x 1,0 mm (de lengte van de emulsievulling). Gebruik 1% overlapping.
   12. Schakel de optie'Focus Surface'in en stel de focusoppervlaktecurve in door het focusvlak op verschillende punten in het monster aan te passen met behulp van de focusknop op de microscoop.
   13. Ten tweede, het instellen van de meervoudige golflengte scan door het selecteren van de scan tabblad. Voeg elk van de optische configuraties die zijn gemaakt in stap 6.1.7 voor elke golflengte.
   14. Klik op de optie om actieve sluiter tijdens de verplaatsing van het stadium en tijdens filterwijzigingen te sluiten om te voorkomen dat het monster wordt bleken en voer de acquisitie uit door op de knop' Start run'te drukken. Exporteer elk acquisitieframe in tiff-bestanden en splits elk kanaal op in een gescheiden bestand met behulp van de optie Meerdere bestanden splitsen en door opgeslagen LUTs-instellingen toe te passen. Gebruik de optie puntnaam en kanaalnaam om elk afbeeldingsbestand eenvoudig te onderscheiden.
2. Beeldanalyse
   1. Sorteer alle verworven beelden op helderveld- en fluorescentiefilters om te uploaden naar een open source beeldanalysesoftware.
   2. Gebruik beeldanalysesoftware om een pijplijn te maken om alle druppels te identificeren met behulp van brightfield-afbeeldingen en meet vervolgens de intensiteit van de bijbehorende fluorescerende druppels.
   3. Upload om beelden van brightfield- en fluorescentie tiff te uploaden en vervolgens modules 'ColorToGray''IdentifyPrimaryObjects'toe te voegen, 'MeasureObjectIntensity'en 'ExportToSpreadsheet'. Gebruik brightfield droplet images om objecten te identificeren en gebruik objecten als masker om de intensiteit van fluorescerende afbeeldingen te meten.
   4. Voer pijplijn uit met geselecteerde tiff-afbeeldingen om de gemiddelde fluorescentieintensiteit van fluorescentiedruppelafbeeldingen te extraheren. Voer het experiment in drievoud, met elke set bestaande uit ~ 5.000 druppels voor analyse.
   5. Pas het algoritme'definetherain'(http://definetherain.org.uk/) toe om de positieve en negatieve druppelclusters te identificeren. De positieven moeten binnen 3 standaarddeviaties van het gemiddelde liggen. Dit bepaalt de drempelintensiteit van positieve druppels die moeten worden gebruikt om te tellen.
   6. Gebruik opnieuw de software voor beeldanalyse om een nieuwe pijplijn te implementeren waarbij de fluorescentiedrempel voor elk gendoel is ingesteld zoals gedefinieerd in de vorige stap.
   7. Upload brightfield- en fluorescerende afbeeldingen naar pijplijn. Voeg modules 'ColorToGray','RescaleIntensity','Threshold', 'IdentifyPrimaryObjects'toe, 'MeasureObjectSizeShape','FilterObjects'en 'ExportToSpreadsheet'. Maak unieke modules voor brightfield-beelden en elk fluorescentiefilter voor druppels.
   8. Schaal van de beeldintensiteit van 0 naar 1 opnieuw schalen voor elke fluorescentiebeeldgroep. Stel vervolgens de drempel in om de objecten boven de vastgestelde drempelwaarde te identificeren en te tellen. Voeg indien nodig de module'ExpandOrShrinkObjects'toe om objecten te verkleinen om het tellen en identificeren van druppels in brightfield te vergemakkelijken.
   9. Identificeer alleen objecten binnen de geselecteerde grootte van 20-30 pixels en filter de getelde objecten om alleen objecten met een specifieke diameter (d.w.z. druppels in het bereik van 75 μm diameter) en een ronde bolvormige excentriciteit van 0,5 en lager te behouden.
   10. Exporteer de resultaten naar een tabel met het totale aantal druppels van brightfield-afbeeldingen, evenals druppeltellingen van alle gebruikte fluorescentiekanalen; namelijk Cy5 voor C-LESS gen, HEX voor gemethyleerd CD3Z-gen en FAM voor gemethyleerd FOXP3-gen (zie aanvullende informatie voor ruwe experimentele gegevens verkregen voor de gepresenteerde mdPCR-test).
   11. Bereken de verhouding van negatieve druppels voor elk gendoel en pas de Poisson-verdeling toe om de respectievelijke kopieën per druppel (CPD) te verkrijgen met behulp van vergelijking 1:
       
       waarbij x het aantal druppels vertegenwoordigt dat 0, 1, 2 of meer moleculen bevat, en λ de CPD-waarde vertegenwoordigt.
   12. Bereken, de absolute doelconcentratie door de verhouding van de CPD-waarde en het druppelvolume verkregen in stap 5.20 met vergelijking 2:
       
       waarbij de waarde (1-p) de fractie van de negatieve druppels vertegenwoordigt.
   13. Bereken het percentage CD3⁺ T-Cells en CD4⁺ CD25⁺ T-Regs door de respectieve CPD-waarden van gemethyleerde CD3Z- en FOXP3-genen te delen door de C-LESS - of totale cel - CPD-waarde (zie Aanvullende informatie voor CPD-berekeningen op basis van ruwe gegevens).
   14. Vergelijk deze procenten waarden die verkregen uit immunofluorescentie imaging met behulp van antilichamen voor CD3⁺ T-Cell en CD4⁺ CD25⁺ T-Reg tellen.

Resultaten

De op TPE gebaseerde microfluidic druppelgeneratorapparaat werd vervaardigd volgens het beschreven protocol zoals weergegeven in figuur 1. Een transparantiemasker werd gebruikt in fotolithografie om silicium (Si) meester te verkrijgen. Zachte lithografie werd uitgevoerd om een omgekeerde PDMS replica van de Si master die vervolgens werd gebruikt om de epoxy mal te fabriceren verkrijgen. Epoxy voorloper werd gegoten op de PDMS en genezen om crosslink en verharden. Deze mal, die de exacte repl...

Discussie

De gepresenteerde experimentele protocol en methoden zorgen voor in-house mdPCR met behulp van een vervaardigde TPE druppelgenerator, een thermische cycler, en fluorescentie microscoop. Het vervaardigde apparaat met behulp van zachte TPE aan TPE binding biedt hydrofobe oppervlakte-eigenschappen die uniform zijn over alle kanaalwanden, zodanig dat het uiteindelijke apparaat geen oppervlaktebehandeling nodig heeft voor later gebruik als druppelgenerator. Dit materiaal is routinematig gebruikt in point-of-care platforms die...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Bio-Rad, Mississauga, ON	TFI0201	PCR tube
RAN Biotechnologies, Beverly, MA	008-FluoroSurfactant	Fluoro-surfactant
Silicon Quest International, Santa Clara, CA
Oxford Instruments, Abingdon, UK		EMCCD camera
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	MA5-16728
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	22-8425-71
CellProfiler		Used for fluorescence image analysis
Nikon, Japan		10x objective
American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA	PCS-800-011
Ramé-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ)	p/n 200-U1
Fisher, Canada
Vitrocom, NJ, USA	5015 and 5010	Borosilicate capilary tube
(http://definetherain.org.uk/)
Hamamatsu, Japan	LC-L1V5	DEL UV light source
Dolomite	3200063	Disposable fluidic tubing
Dolomite	3200302	Disposable fluidic tubing
IDT, Coralville, IA
Nikon, Melville, NY		Upright light microscope
Cytec Industries, Woodland Park, NJ
EV Group, Schärding, Austria
Zymo Research, Irvine, CA	D5030
Photron, San Diego, CA
IDT, Coralville, IA
Gersteltec, Pully, Switzerland		SU-8 photoresist
Fineline Imaging, Colorado Springs, CO
Qiagen, Hilden, Germany	203603
Image J		Used to assess droplet diameter
Anachemia, Montreal, QC
Excelitas, MA, USA		Broad-spectrum LED fluorescent lamp
Galenvs Sciences Inc., Montreal, QC	DE1010
Hexpol TPE, Åmål, Sweden		Thermoplastic elastomer (TPE)
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	13-400-518
Nikon, Japan		Used for image acquisition
3M, St Paul, MN		Carrier Oil
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	R37605	Blue fluorescent live cell stain (DAPI)
IDEX Health & Science, Oak Harbor, WA	P-881	PEEK fittings
Sigma-Aldrich, Oakville, ON	806552
Dow Corning, Midland, MI
ThinkyUSA, CA, USA	ARV 310
Ihc world, Maryland, USA	IW-125-0
Zinsser NA, Northridge, CA	2607808
Cetoni GmbH, Korbussen, Germany
Sigma-Aldrich, Oakville, ON	484431
Bio-Rad, Mississauga, ON	1861096
Hitachi High-Technologies, Mississauga, ON
Nikon, Melville, NY		Inverted microscope
Nikon, Japan
Loctite	AA 352